Considerações práticas para o projeto, execução e interpretação de estudos envolvendo testes de flexão óssea total de ossos de roedores

O teste mecânico do osso é o principal método para extrair informações funcionais relacionadas à suscetibilidade de um osso à fratura. Em estudos pré-clínicos, várias modalidades de teste podem ser usadas, mas de longe a mais comum é a flexão de ossos longos. Esses testes são fáceis de realizar e podem ser usados em ossos que variam em tamanho de humano a camundongo. Como os camundongos são um dos animais mais comumente estudados em pesquisas pré-clínicas, este protocolo se concentrará em testes de flexão realizados nos fêmures e tíbias de camundongos.

Antes de realizar testes de flexão, os ossos devem ser adequadamente colhidos e armazenados. Os métodos de armazenamento mais comuns têm sido tradicionalmente o congelamento de ossos em gaze embebida em soro fisiológico, o congelamento apenas em soro fisiológico ou a desidratação de ossos em etanol ¹. Foi demonstrado que os ossos armazenados em etanol apresentam aumento da rigidez e do módulo de elasticidade e diminuição dos parâmetros de deformação em relação aos armazenados congelados¹. Mesmo a reidratação dos ossos antes do teste não recupera essas propriedades de volta aos níveis normais ¹. O armazenamento submerso em soro fisiológico pode causar danos ao osso, uma vez que a pressão é exercida à medida que o soro se expande. Além disso, um descongelamento completo da solução seria necessário para remover os ossos para a tomografia microcomputadorizada (μCT). Consequentemente, o congelamento de ossos recém-colhidos em gaze embebida em soro fisiológico tornou-se o método padrão de armazenamento e é recomendado em todo este protocolo.

Como o tamanho e a forma de um osso afetam sua força volumosa e muitos modelos de doenças alteram significativamente o tamanho e a morfologia do osso, princípios de engenharia são usados para normalizar os efeitos do tamanho para produzir propriedades que estimam o comportamento do tecido². Essa abordagem requer geometria transversal do local da falha, que é mais comumente adquirida usando μCT para criar varreduras dos ossos antes do teste. A μCT é amplamente utilizada devido à sua disponibilidade e alta resolução de imagem. Além disso, contribuições de partes moles não são incluídas, e o exame não requer fixação química ou outras modificações no osso ^3,4. Em todas as formas de TC, uma fonte de raios X é focada em um objeto, enquanto um detector do outro lado do objeto mede a energia de raios-X resultante. Isso produz uma sombra radiográfica da amostra que pode ser convertida em uma imagem ^3,5. O objeto que está sendo escaneado é girado (ou a fonte de raios X e o detector são girados em torno da amostra), gerando imagens que podem ser reconstruídas em um conjunto de dados tridimensionais representando o objeto⁵.

A resolução da varredura, ou quão próximos dois objetos podem estar e ainda ser resolvidos individualmente, é controlada alterando o tamanho nominal do voxel ou o tamanho de um pixel na imagem resultante. É geralmente aceito que os objetos devem ter pelo menos duas vezes o tamanho de um único voxel para serem identificados³, mas uma proporção maior permitirá uma maior precisão. Além disso, voxels maiores são mais propensos a efeitos parciais de volume: quando um único voxel contém tecidos de densidades variadas, é atribuída a média dessas densidades, em vez da densidade específica de um único tecido, o que pode levar a uma superestimação ou subestimação das áreas teciduais e da densidade mineral³. Embora esses problemas possam ser atenuados escolhendo tamanhos de voxels menores, o uso de uma resolução mais alta não garante a eliminação de efeitos parciais de volume e pode exigir tempos de varredura mais longos³. Ao escanear ossos ex vivo, um tamanho de voxel de 6-10 μm é geralmente recomendado para avaliar com precisão a arquitetura trabecular de ossos de camundongos. Um tamanho de voxel maior de 10-17 μm pode ser usado para osso cortical, embora o menor tamanho de voxel razoável deva ser usado. Este protocolo usa um tamanho de voxel de 10 μm, que é pequeno o suficiente para diferenciar as principais propriedades trabeculares e minimizar os efeitos parciais de volume sem tempo de varredura extenso.

As configurações de energia de raios X e filtro de energia também devem ser selecionadas cuidadosamente, pois a alta densidade mineral e espessura do tecido ósseo atenua e altera muito o espectro de energia de raios X transmitido. É geralmente assumido que, como o espectro de raios X emitido é equivalente ao espectro que sai do objeto⁶, o uso de raios X de baixa energia em objetos densos, como o osso, pode levar a um artefato conhecido como endurecimento do feixe⁷. Recomenda-se uma maior voltagem, de 50-70 kVp, na varredura de amostras ósseas para reduzir a incidência desses artefatos⁵. Além disso, a inserção de um filtro de energia de alumínio ou cobre cria um feixe de energia mais concentrado, minimizando ainda mais os artefatos ^4,7. Um filtro de alumínio de 0,5 mm será utilizado em todo este protocolo.

Finalmente, a etapa de rotação da varredura e o comprimento de rotação (por exemplo, 180°-360°), juntos controlam o número de imagens capturadas, o que determina a quantidade de ruído na varredura final⁴. A média de vários quadros em cada etapa pode reduzir o ruído, mas pode aumentar o tempo de varredura⁴. Este protocolo usa uma etapa de rotação de 0,7 graus e uma média de quadro de 2.

Uma observação final sobre a varredura: os simuladores de calibração de hidroxiapatita devem ser escaneados usando as mesmas configurações de varredura que os ossos experimentais para permitir a conversão dos coeficientes de atenuação em densidade mineral em g/cm ^{3 5}. Este protocolo utiliza simuladores de 0,25 g/cm 3 e 0,75 g/cm³ de hidroxiapatita, embora diferentes simuladores estejam disponíveis. Observe que alguns sistemas de varredura usam simuladores internos como parte da calibração diária do sistema.

Uma vez concluída a digitalização, as projeções angulares são reconstruídas em imagens transversais do objeto, normalmente usando o software que acompanha o fabricante. Seja qual for o sistema utilizado, é importante garantir que todo o osso seja capturado na reconstrução e que o limiar seja definido adequadamente para permitir o reconhecimento de osso versus não-osso. Após a reconstrução, é fundamental girar todos os exames em três dimensões para que os ossos sejam orientados de forma consistente e devidamente alinhados com o eixo transversal, novamente utilizando o software do fabricante.

Após a rotação, regiões de interesse (ROI) para análise podem ser selecionadas com base no desejo de propriedades corticais, propriedades trabeculares ou geometria de fratura para normalização mecânica. Para este último, as ROIs devem ser selecionadas após o teste, medindo a distância do local da fratura a uma extremidade do osso e usando o tamanho do voxel para determinar a localização do corte correspondente no arquivo de exame. A região selecionada deve ter pelo menos 100 μm de comprimento, com o ponto de fratura no centro aproximado da ROI, para fornecer estimativa adequada⁴.

Com as ROIs selecionadas, duas propriedades são necessárias para a normalização mecânica (para calcular a tensão de flexão e a deformação): a distância máxima do eixo neutro de flexão até a superfície onde a falha é iniciada (assumida como sendo a superfície carregada em tensão, determinada pela configuração do teste) e o momento de inércia da área em torno do eixo neutro (também dependente da configuração do teste). Esse protocolo recomenda o uso de um código personalizado para determinar esses valores. Para ter acesso ao código, entre em contato diretamente com o autor correspondente ou visite o site do laboratório em https://bbml.et.iupui.edu/ para obter mais informações.

Uma vez concluída a μCT, os testes mecânicos podem começar. Os testes de flexão podem ser realizados em configurações de quatro ou três pontos. Os ensaios de flexão de quatro pontos são preferidos, pois eliminam a tensão de cisalhamento no osso entre os pontos de carregamento, permitindo que a flexão pura ocorra nessa região³. O osso então se fraturará devido à tensão, criando uma falha mais representativa das verdadeiras propriedades de flexão do osso³. No entanto, o osso deve ser carregado de forma a fornecer a mesma carga em ambos os pontos de carregamento (isso pode ser facilitado com uma cabeça de carga pivotante). Nos ensaios de flexão de três pontos, há uma grande mudança na tensão de cisalhamento onde o ponto de carga encontra o osso, o que faz com que o osso se quebre neste ponto devido ao cisalhamento, e não à tensão³. As normas ASTM recomendam que os materiais submetidos à flexão devem ter uma relação comprimento/largura de 16:1, ou seja, o comprimento do vão de apoio deve ser 16 vezes maior que a largura do osso para minimizar os impactos do cisalhamento ^8,9. Isso muitas vezes é impossível de conseguir ao testar pequenos ossos de roedores, então a extensão de carga é simplesmente feita o maior possível, mas com uma mudança tão pequena na forma transversal quanto possível. Além disso, ao realizar a flexão de quatro pontos, a relação entre os comprimentos do vão inferior e superior deve ser de ~3:1⁸, o que geralmente pode ser alcançado na tíbia, mas é difícil no fêmur mais curto. Além disso, as paredes corticais mais finas dos fêmures os tornam suscetíveis à deformação do tipo anel que altera a forma da secção transversal óssea durante o teste (isso pode ser acentuado em testes de quatro pontos, pois é necessária uma força maior para induzir o mesmo momento fletor em comparação com a flexão de três pontos). Portanto, a flexão de três pontos será utilizada para fêmures de camundongos e a flexão de quatro pontos para tíbias durante todo este protocolo.

Finalmente, é importante capacitar adequadamente o estudo para análise estatística. Uma recomendação geral para ensaios mecânicos é ter um tamanho de amostra de 10-12 ossos por grupo experimental para poder detectar diferenças, pois algumas propriedades mecânicas, especialmente parâmetros pós-rendimento, podem ser altamente variáveis. Em alguns casos, isso pode significar começar com um tamanho de amostra animal maior, dado o desgaste que poderia ocorrer durante o estudo. A análise do tamanho da amostra usando dados existentes deve ser concluída antes da tentativa de um estudo.

Existem inúmeras limitações e suposições, mas os testes de flexão podem fornecer resultados bastante precisos, especialmente quando diferenças relativas entre os grupos são de interesse. Essas propriedades, juntamente com a análise da arquitetura trabecular e morfologia cortical, podem fornecer uma melhor compreensão dos estados patológicos e regimes de tratamento. Se forem tomados cuidados com os aspectos do experimento que estão sob nosso controle (por exemplo, colheita, armazenamento, digitalização e teste), podemos ter certeza de que resultados precisos foram gerados.

Todos os procedimentos descritos ao longo deste protocolo que envolveram animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animais e Uso da Escola de Ciência da Universidade de Indiana (IACUC) antes do procedimento. Os animais descritos no procedimento foram eutanasiados por inalação de CO₂seguido de luxação cervical como meio secundário de eutanásia.

1. Colheita, armazenamento e descongelamento de ossos

1. Colheita e armazenagem
   1. Coloque o lado ventral do mouse para cima. Use um bisturi (ou uma lâmina de barbear ou tesoura) para fazer uma incisão na junção aproximada do fêmur e da pelve de um lado.
   2. Continue a incisão inicial dorsalmente até que a articulação do quadril esteja localizada; Procure a cabeça femoral que aparece como uma pequena esfera branca presa à pelve.
   3. Aplicar pressão com a borda de um bisturi na borda proximal da cabeça femoral até que a cabeça femoral saia do alvéolo. Excisar tecido adicional para libertar o membro posterior do restante da carcaça.
   4. Com o membro posterior isolado, separe a tíbia e o fêmur induzindo a flexão na articulação do joelho. Mova o bisturi na direção médio-lateral na superfície anterior do joelho para cortar qualquer tecido adjacente, incluindo os ligamentos entre os ossos.
   5. Se isso não separar os ossos, estenda a articulação do joelho para permitir o acesso à superfície posterior. Tenha cuidado para evitar cortar o osso ou raspar a cartilagem articular.
   6. Uma vez que o fêmur e a tíbia estejam separados, remova o retropé da tíbia flexionando a articulação e usando um movimento de serragem médio-lateral na superfície posterior da articulação. Se necessário, estender a articulação para expor a superfície anterior. Tenha cuidado para evitar cortar o osso.
   7. Uma vez isolados, limpe os ossos de todos os tecidos moles aderentes. Se estiver realizando testes de flexão de quatro pontos na tíbia, remova a fíbula também. A fíbula é conectada por ligamentos na extremidade proximal, mas é fundida à tíbia perto da extremidade distal do osso. Use uma tesoura afiada perto do ponto de conexão para separar a fíbula.
   8. Embrulhe os ossos isolados e limpos separadamente em gaze embebida em soro fisiológico e armazene-os a -20 °C. Faça isso imediatamente após a colheita.
   9. Repetir os passos 1.1.1 a 1.1.8 para o outro lado da carcaça.
      Observação : se houver resistência ao tentar separar os ossos nas etapas 1.1.4-1.1.6, é melhor repetir as etapas em vez de tentar separar os ossos. Movimentos forçados podem levar a danos ou fratura dos ossos.
2. Descongelar
   NOTA: O número de ciclos de congelamento-descongelamento a que um osso é submetido deve ser minimizado, uma vez que os ciclos de congelamento-descongelamento excessivos podem afetar negativamente as propriedades mecânicas do osso. O descongelamento parcial para μCT pode ser obtido deixando-se o osso à temperatura ambiente por 5-10 min. Só descongelar completamente o osso ao realizar testes de flexão conforme descrito abaixo.
   1. Descongelamento noturno preferido
      1. Mova os ossos de armazenamento de -20 °C para 1-4 °C em uma câmara fria ou geladeira. Certifique-se de que os ossos permaneçam lá por 8-12 h para descongelar totalmente antes do teste.
   2. Descongelamento rápido
      1. Ajuste a temperatura do banho para aproximadamente 37 °C. Uma vez a esta temperatura, adicione os ossos ao banho.
      2. Deixe os ossos no banho por aproximadamente 1 h.

2. μTC

1. Embrulhe os ossos em parafilme antes da varredura para manter a hidratação. Mantenha todos os outros ossos no gelo enquanto espera para ser digitalizado.
2. Uma vez envolvido em parafilme, coloque o osso em um suporte para fazer a interface com o scanner. Certifique-se de que todos os ossos digitalizados estejam alinhados na mesma orientação, pois o alinhamento consistente simplificará a rotação mais tarde na análise.
3. Ajuste as configurações de varredura de acordo com a aplicação da varredura. As seguintes configurações gerais de varredura são recomendadas para ossos de camundongo: resolução/tamanho do voxel: 10 μm; tamanho do pixel: médio, 2000 x 1048; filtro: alumínio 0,5 mm; passo de rotação: 0,7; Média de quadros: 2.
   Observação : essas configurações podem diferir dependendo do sistema usado para varredura e o manual do fabricante e do usuário deve ser consultado conforme necessário.
4. Quando a fonte de raios X estiver ligada, execute uma correção de campo plano para minimizar os artefatos. Para fazer isso, primeiro, certifique-se de que a câmara esteja vazia e desligue o campo plano.
5. Meça a intensidade média do campo e ajuste para 60%. Uma vez em 60%, atualize o campo plano e ligue-o novamente.
6. Garantir que a intensidade média seja agora (86-88%).
   NOTA: Este processo pode variar dependendo do sistema μCT utilizado. Consulte o manual do usuário antes de tentar o processo.
7. Uma vez que a correção de campo plano é realizada com sucesso, coloque o suporte na câmara. Certifique-se de que as amostras estão centralizadas e niveladas antes de colocar o pedestal na câmara.
8. Uma vez que o pedestal esteja fixado, feche a câmara, certifique-se de que todo o osso será capturado na varredura (uma visão scout pode ser necessária) e inicie a varredura.
9. Após a varredura, restaure os ossos em gaze embebida em soro fisiológico a -20 °C.

3. Reconstrução da μCT

1. Selecione uma ROI que irá capturar todo o osso na reconstrução. Para fazer isso, visualize a maior seção transversal do osso e dimensione a ROI com base nessa seção transversal.
2. Defina o limiar do software para permitir o reconhecimento adequado do osso em comparação com o não-osso. Para fazer isso, use um histograma no qual uma restrição inferior é definida como 0 e a restrição superior é definida no final dos dados do histograma de pico.
3. Ajuste configurações adicionais, incluindo redução de artefatos de anel e endurecimento do feixe para 5 e 20%, respectivamente. Verifique se a compensação de desalinhamento está dentro da faixa de -7 a 7. Esses valores podem variar de acordo com o software. Certifique-se de que eles sejam verificados com o manual do usuário e as instruções baseadas no fabricante antes de iniciar a reconstrução.
   NOTA: Os artefatos podem ser minimizados durante a reconstrução usando correções para endurecimento da viga, artefatos de anel e compensação de desalinhamento. A compensação de desalinhamento pode atuar como um indicador da qualidade da varredura e, se estiver fora de um intervalo especificado pelo fabricante, a varredura deve ser repetida. No entanto, as configurações de reconstrução serão dependentes do software, e o manual do usuário deve ser consultado.

4. Rotação do μCT

NOTA: Uma vez reconstruídos, os exames devem ser girados para estabelecer uma orientação consistente em todos os ossos e para garantir que as seções transversais do osso resultante sejam levadas normalmente para o eixo longitudinal com o menor ângulo de deslocamento possível. Isso deve ser feito com o software de escolha do usuário.

1. Rotação do fêmur
   1. Gire o fêmur para que todos os ossos tenham a mesma orientação longitudinal. Por exemplo, orientar todos os ossos com a extremidade proximal do osso na parte superior da varredura.
   2. Gire o osso de modo que a orientação transversal de todos os ossos seja a mesma. Por exemplo, gire os ossos para que o lado anterior esteja sempre no lado direito das varreduras.
   3. Uma vez que esses ajustes são feitos, endireitar a varredura para garantir que a simetria seja mantida em torno do eixo central.
   4. Salve o conjunto de dados rotacionado.
2. Rotação da tíbia
   1. Repita os passos 4.1.1-4.1.4 para a tíbia.

5. Procedimento de ensaio mecânico

1. Preparação
   1. Antes do teste mecânico, certifique-se de que um exame de μCT com resolução de 6-10 μm tenha sido obtido e reconstruído para verificar se um exame de qualidade foi adquirido para cada amostra para calcular a geometria transversal no local da fratura (seções 2-3).
   2. Com exames obtidos e verificados, descongelar todos os ossos antes do teste (seção 1). Testar todos os ossos de um experimento no mesmo dia e randomizar a ordem dos testes para minimizar o viés do usuário e a variabilidade do sistema entre amostras e grupos experimentais. Certifique-se de que os ossos permaneçam hidratados durante todo o processo de teste.
2. Configuração do aparelho
   1. Localize uma célula de carga com sensibilidade e capacidade apropriadas para a amostra. Considere a faixa de falha esperada para a amostra e escolha uma célula de carga com aproximadamente 50% mais capacidade enquanto maximiza a sensibilidade (por exemplo, uma célula de carga de 10 lbf com uma capacidade de 45 N para um osso de camundongo na faixa de falha de 0-25 N).
   2. Localize as luminárias de carga e suporte do vão.
   3. Instale a célula de carga e os dispositivos de fixação conforme mostrado na Figura 1, parafusando a célula de carga no suporte superior ou inferior do testador, o dispositivo de carregamento superior na célula de carga e o dispositivo inferior no suporte inferior do testador. Garanta um ajuste seguro.
      NOTA: A fixação da célula de carga ao dispositivo superior é geralmente recomendada ao realizar testes de flexão para evitar o contato do fluido com a célula de carga, mas a parte inferior pode ser usada se necessário.
   4. Depois que a célula de carga e os dispositivos estiverem instalados, selecione um comprimento de vão de suporte e certifique-se de que ele permaneça constante para todas as amostras que estão sendo testadas. Para escolher uma distância de extensão de suporte, primeiro, localize o osso mais curto no conjunto de amostras.
   5. Orientar o osso entre as luminárias como mostra a Figura 2.
   6. Para flexão de três pontos do fêmur, seguir a Figura 2A. Certifique-se de que a superfície anterior do osso esteja contra o vão de suporte e que a região do vão esteja dentro da diáfise da amostra. Evitar incluir o terceiro trocanter na extremidade proximal e o ponto de transição onde o osso se alarga para a metáfise e côndilos na extremidade distal.
   7. Para flexão de quatro pontos, certifique-se de que os vãos de suporte e carregamento estejam alinhados e centralizados entre si. Siga a Figura 2B para carregar o osso nas luminárias.
      1. Defina os comprimentos dos vãos de suporte e carregamento para seguir uma proporção de 3:1⁸ (por exemplo, vão de suporte de 9 mm e vão de carga de 3 mm).
      2. Para uma tíbia, carregar a superfície medial do osso contra o vão de apoio com um suporte na junção tíbia/fíbula. O outro suporte provavelmente será posicionado logo após a crista tibial. Certifique-se de que a extensão de carga, centralizada dentro da extensão de suporte, contenha uma região uniforme do osso.
   8. Meça a distância de envergadura de apoio se estiver executando flexão de três pontos e as distâncias de carga e de extensão de apoio se estiver executando flexão de 4 pontos e registre essas distâncias. Certifique-se de que esse valor seja registrado a partir do centro dos pontos de carregamento para as medições de carga e extensão de suporte.
   9. Coloque o osso de volta em soro fisiológico ou reidrate com um bolus de soro fisiológico.
      NOTA: Ao selecionar pontos para um vão de carga, recomenda-se o uso de pontos circulares (um raio de 0,75 mm é suficiente, pois distribui a carga ao mesmo tempo em que entra em contato com o osso na tangente do círculo). Embora a teoria recomende uma ponta de faca para representar uma carga pontual, isso esmagará o osso no ponto de aplicação da carga, levando a superestimativas de deformação e subestimações de módulo.
   10. Certifique-se de que todas as partes do acessório estejam firmes e livres de movimentos.
3. Configuração do software
   1. Verifique se o testador está conectado corretamente ao computador através da caixa do módulo, canais da célula de carga e quaisquer outros requisitos de acordo com o manual do sistema.
   2. No software associado ao testador mecânico, crie um perfil de ensaio de flexão com uma rampa que tenha uma taxa de deslocamento lenta o suficiente para não induzir efeitos viscoelásticos (0,025 mm/s é frequentemente usado) para carregar o osso até a falha.
   3. Uma frequência mínima de amostragem de 25 Hz também é recomendada ao criar um perfil de teste, embora uma taxa de amostragem mais alta seja preferida.
   4. Crie uma pasta por grupo de estudo e salve cada teste como um arquivo individual dentro dessa pasta.
4. Carregamento e teste de amostras
   1. Selecione um osso devidamente descongelado (ver passo 1.2). Meça e registre todo o seu comprimento com paquímetros.
   2. Coloque a amostra nos dispositivos de fixação como mostrado na Figura 2A se testar um fêmur em flexão de três pontos e na Figura 2B se testar uma tíbia em flexão de quatro pontos.
   3. Altere o nome do arquivo para refletir o exemplo que está sendo testado.
   4. Zerar a carga (não o deslocamento). Ligue o movimentador do sistema; Certifique-se de que não está no controle de carga ou deslocamento.
   5. Com cuidado, aplique uma pré-carga mínima no osso para garantir sua posição e ajudar a evitar que o osso role, mas certifique-se de que ele não comprometa a amostra. Apontar para uma pré-carga de aproximadamente 0,25 N. Certifique-se de que a orientação óssea desejada seja mantida antes de prosseguir.
   6. Hidrate a amostra encharcando-a generosamente com soro fisiológico.
   7. Inicie o teste de flexão selecionando Iniciar ou Executar no software. CRÍTICO: Observe cuidadosamente a amostra durante todo o teste e observe os testes onde ocorreram problemas (por exemplo, rolagem, deslizamento).
      NOTA: Esses problemas podem comprometer os dados e as notas sobre esses testes serão úteis para consultar durante a análise.
   8. Preste atenção para que o osso comece a fraturar (no lado da tração). A maioria dos testes prosseguirá até que ocorra uma falha. Neste ponto, o teste terminará através de seus limites programados. Se ocorrer uma falha, mas o testador continuar a deslocar-se, pare manualmente o teste para evitar danos à célula de carga.
   9. Uma vez concluído o teste, meça o comprimento da extremidade distal até o ponto de ruptura usando paquímetros e registre-o.
   10. Repita as etapas 5.4.1 – 5.4.9 para cada amostra.

Figura 1: Configuração do testador mecânico. (A) Ensaios de flexão de três pontos e (B) de quatro pontos. A célula de carga é mostrada em amarelo, as luminárias de carga são mostradas em azul e as luminárias de suporte são mostradas em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Orientação dos ossos entre as luminárias . (A) Orientação adequada do fêmur em dispositivos de carga de flexão de três pontos, mostrando (de cima para baixo) as vistas das faces medial, anterior e posterior do fêmur quando posicionadas corretamente. As luminárias de carga são mostradas em laranja e as luminárias de apoio são mostradas em azul. Os vãos inferiores devem ser ajustados para incluir o máximo possível da parte mais reta da diáfise, e o acessório superior deve estar centralizado entre esses vãos. (B) Orientação adequada de uma tíbia para flexão de quatro pontos mostrando (de cima para baixo) as vistas dos lados anterior, lateral e medial da tíbia. O osso deve ser carregado de modo que a superfície medial entre em contato com o acessório inferior e a superfície lateral entre em contato com o acessório superior. A junção tíbia-fíbula deve ser colocada fora do vão de carga. Os vãos devem ser ajustados para melhor atender a uma relação carga/suporte de 1:3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Seleção do ROI

1. Com os comprimentos de quebra registrados, carregue as imagens giradas no software de escolha do usuário. Depois que as imagens giradas forem carregadas, localize e registre as fatias superior e inferior do osso.
2. Calcule a diferença entre as fatias superior e inferior. Multiplique esse valor pelo tamanho do voxel de varredura para determinar o comprimento total do osso em micrômetros.
3. Para localizar o local da fratura na TC, divida o comprimento de quebra registrado (em micrômetros) pelo tamanho do voxel para obter o número de cortes de μCT da extremidade distal do exame até o ponto de ruptura.
4. Selecione um ROI, centralizado neste local. Primeiro, defina o comprimento total desejado da ROI (pelo menos 100 μm). Encontre o número de fatias que esse comprimento representa dividindo o comprimento em micrômetros pelo tamanho do voxel para determinar o número total de cortes na ROI.
5. Para obter o limite inferior da ROI, divida o número total de cortes de ROI por 2 e subtraia esse valor do local de quebra previamente calculado encontrado na etapa 6.4.
6. Adicione o comprimento total da ROI em fatias ao valor calculado anteriormente para obter o limite superior da ROI.
7. Selecione o ROI apropriado, com base nos limites calculados, e salve-o.

7. Normalização dos dados de força e deslocamento

OBS: O testador mecânico só irá gerar pontos com coordenadas x e y (deslocamento, força). Esses pontos podem ser convertidos em tensão e deformação usando as equações de tensão de flexão e deformação de Euler-Bernoulli, mas estas requerem propriedades geométricas obtidas a partir de exames de μCT. A quantificação dessas propriedades pode ser realizada com o software de preferência do usuário. Preferimos um código personalizado, que dá controle total sobre todas as entradas, cálculos e saídas. Como mencionado anteriormente, para ter acesso ao código, entre em contato diretamente com o autor correspondente ou visite o site do laboratório em https://bbml.et.iupui.edu/ para obter mais informações. As equações de tensão e deformação, bem como as propriedades geométricas necessárias que devem ser obtidas a partir de exames de μCT, para calculá-las são discutidas a seguir.

1. Equações de normalização de flexão de três pontos
   1. A equação utilizada para calcular a tensão na flexão de três pontos é mostrada abaixo na Equação 1. Nessa equação, "F" representa a força e "L" representa o comprimento do vão de apoio. Os valores de força são registados pelo testador mecânico durante o ensaio. Certifique-se de que o comprimento da extensão de suporte seja registrado antes do teste. "c" e "I" são propriedades geométricas que serão calculadas usando exames de μCT (seção 7.3).
      (1º)
   2. A equação para calcular a deformação é mostrada abaixo na Equação 2; "c" e "L" representam as mesmas propriedades para os cálculos de tensão e deformação. "d" significa os valores de deslocamento registrados pelo testador mecânico durante os ensaios.
      (2º)
2. Equações de normalização de flexão de quatro pontos
   1. A equação para tensões na flexão de quatro pontos é mostrada abaixo na Equação 3. "F" e "I" permanecem as mesmas variáveis discutidas no passo 7.1.1. Calcule "a" a partir das medições do suporte e da extensão de carga antes do teste. Se seguir a proporção recomendada de 3:1 para suporte à extensão de carregamento para flexão de quatro pontos, "a" será um terço do comprimento da extensão de suporte.
      (3º)
   2. A equação para deformação em flexão de quatro pontos é mostrada abaixo na Equação 4. "c" e "a" significam as mesmas propriedades para os cálculos de tensão e deformação. "d" significa os valores de deslocamento registrados pelo testador mecânico durante os ensaios.
      (4º)
3. Calculando propriedades geométricas a partir de varreduras μCT
   1. A variável "c" representa a distância do eixo neutro à superfície do osso que foi carregado em tensão. Consequentemente, determinar o centroide de cada seção transversal nos exames de μCT, uma vez que o eixo neutro passa através do centroide.
      1. Se seguir a orientação de ensaio de um fémur em flexão de três pontos descrita no passo 5.2.6, medir "c" em relação à superfície anterior.
      2. Se seguir a orientação de ensaio de uma tíbia descrita no passo 5.2.7, medir "c" em relação à superfície medial do osso.
   2. A variável "I" representa a área momento de inércia em relação ao eixo de flexão (eixo médio-lateral para um fêmur; eixo anteroposterior para uma tíbia). Calcule esse valor usando a Equação 5. Nesta equação, "dA" é a área de cada pixel capturado na varredura μCT, enquanto y é a distância calculada de cada pixel do eixo neutro.
      (5º)

8. Propriedades de ensaio mecânico de interesse

1. Antes de calcular qualquer propriedade mecânica, gere uma curva força-deslocamento e uma curva tensão-deformação (curvas ideais mostradas abaixo na Figura 3, juntamente com propriedades significativas).
   NOTA: O teste de amostras biológicas nem sempre gera curvas que se parecem com esses exemplos idealizados, mas eles continuam sendo um guia útil.
2. Examine essas curvas antes da análise para detectar erros no teste, como um rolamento ou deslizamento ósseo. Esses erros normalmente causam solavancos ou regiões planas na porção linear inicial da curva. Remova dados em excesso, incluindo quaisquer dados que possam ter sido coletados antes de o testador entrar em contato com o osso ou dados após falha, neste momento.
3. Uma vez assegurado um teste de qualidade pelas curvas plotadas, iniciar a análise das propriedades significativas.
   1. Rigidez e módulo de elasticidade
      1. Calcule a rigidez usando apenas a região elástica da curva força-deslocamento. A inclinação da curva nessa região é de rigidez.
      2. Calcular o módulo elástico usando a inclinação apenas da porção elástica da curva tensão-deformação.
   2. Ponto de rendimento
      NOTA: Existem dois pontos de escoamento, um na curva força-deslocamento e outro na curva tensão-deformação. Os valores (x,y) para este ponto da curva força-deslocamento são conhecidos como deslocamento para escoamento e força de escoamento, enquanto aqueles da curva tensão-deformação são conhecidos como deformação para escoamento e tensão de escoamento. Esses pontos representam o final da região elástica da curva e podem ser encontrados nas formas listadas abaixo.
      1. Método da curva tensão-deformação: Calcula um deslocamento de linha de (0,0) por 0,2% de deformação (2.000 microdeformação), mas com a mesma inclinação do módulo elástico. Plote esta linha no gráfico tensão-deformação; A posição em que essa linha intercepta a curva tensão-deformação é definida como o limite de escoamento. Use esta tensão de escoamento e coordenada de deformação para encontrar os valores análogos de força e deslocamento; Esses valores representarão a força de escoamento e o deslocamento para os valores de escoamento.
      2. Método Secant: Calcular a rigidez a partir da curva força-deslocamento e reduzir a rigidez em uma porcentagem escolhida (5-10%). Traçar uma reta a partir de (0,0) com a inclinação dessa rigidez reduzida e permitir que ela se cruze com a curva força-deslocamento. O ponto de intersecção terá as coordenadas (deslocamento para escoamento, força de escoamento).
         NOTA: O método secante pode ser utilizado para encontrar o ponto de escoamento sem dados de tensão-deformação.
   3. Força final e tensão final
      1. Calcule a força final e a tensão final encontrando o valor máximo nos respectivos conjuntos de dados.
   4. Propriedades de deslocamento e deformação
      1. Deslocamento para escoamento e deformação para escoamento valores que representam o deslocamento ou deformação até o ponto de escoamento. Para encontrá-los, localize o rendimento conforme descrito na etapa 8.3.2.
      2. Os valores de deslocamento total e deformação total representam o deslocamento total ou deformação total que uma amostra experimentou durante todo o ensaio e correspondem ao ponto de falha.
      3. Deslocamento pós-escoamento e deformação pós-escoamento: O deslocamento pós-escoamento é comumente relatado e pode ser calculado subtraindo-se o deslocamento para o rendimento do deslocamento total. Calcule a deformação pós-escoamento subtraindo a deformação para o rendimento da deformação total, mas relate isso com cautela, pois a deformação é derivada primeiro sob a suposição de que o material é linearmente elástico (pré-rendimento). Isso torna uma medida pós-rendimento suscetível à invalidez.
   5. Propriedades energéticas
      1. Calcule a energia como a área sob a curva força-deslocamento ou tensão-deformação.
      2. A área sob a curva força-deslocamento é conhecida como trabalho. A área calculada sob a porção pré-rendimento da curva, ou a região elástica, é conhecida como trabalho elástico ou energia. A área calculada sob a curva após o ponto de rendimento, ou a região plástica, é conhecida como pós-rendimento ou trabalho plástico, ou energia perdida.
      3. A área total calculada sob a curva tensão-deformação é conhecida como tenacidade ou módulo de tenacidade, enquanto a área calculada sob a curva tensão-deformação até o limite de escoamento é conhecida como resiliência. A tenacidade pós-escoamento, como a deformação pós-escoamento, muitas vezes não é relatada devido às suposições das equações de deformação de que essa propriedade não se enquadra.

Figura 3: Curvas força-deslocamento e tensão-deformação. (A) Curva de força-deslocamento ideal; (B) curva tensão-deformação ideal com a reta derivada do método de deslocamento de 0,2% usado para calcular o limite de proporcionalidade mostrado em vermelho (note que essa reta tem a mesma inclinação da região elástica da curva). As principais propriedades que podem ser obtidas a partir da curva força-deslocamento incluem força de escoamento, força última, deslocamento para escoamento, deslocamento total e trabalho. As propriedades do nível do tecido que podem ser obtidas a partir da curva tensão-deformação incluem tensão de escoamento, tensão máxima, tensão de escoamento, deformação total, resiliência e tenacidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a conclusão da tomografia computadorizada, a maioria dos exames inadequados pode ser detectada na reconstrução. Muitas vezes, varreduras ruins terão uma compensação de alto desalinhamento que é um indicador claro de um erro durante a varredura. No entanto, erros podem ocorrer em outras etapas e também podem levar a dados imprecisos. Esses erros muitas vezes podem ser detectados à medida que as propriedades arquitetônicas calculadas individuais são examinadas. Se os valores ficarem muito fora do intervalo de outros em um grupo, a varredura, o ROI e o método de cálculo das propriedades devem ser reexaminados.

Uma vez que os testes de flexão estejam concluídos, os gráficos de deslocamento de força de cada teste devem ser examinados para identificar testes ruins que podem precisar ser removidos do conjunto de dados. Um exemplo de teste problemático é mostrado na Figura 4. O gráfico da Figura 4A mostra os resultados de um ensaio de flexão realizado corretamente. Há uma região linear clara sem um dedo do pé de baixa inclinação, um ponto de escoamento, um ponto final (força máxima), uma queda de força à medida que o deslocamento se estende além da força máxima e um ponto de falha. A curva é suave, sem mudanças bruscas no carregamento até que o ponto final tenha sido atingido. Consequentemente, as propriedades deste teste podem ser facilmente identificadas e confiáveis. O gráfico mostrado na Figura 4B mostra o resultado de um teste de flexão com múltiplas características preocupantes. As mudanças bruscas no carregamento e o aparecimento de múltiplos picos no gráfico são os principais indicadores de problemas com este teste. Embora pequenos picos possam ocorrer em um teste apropriado perto da força máxima, a magnitude e o número de picos neste gráfico sugerem que o osso pode ter rolado durante o teste. Se observados e anotados durante o teste ou ao examinar os testes antes da análise, os dados da amostra devem ser investigados durante a análise pós-teste. Se os dados forem realmente defeituosos ou muito fora do intervalo de outras amostras do grupo, o ideal seria não incluir esse teste no conjunto de dados final. Esta é uma razão para alimentar adequadamente o experimento com cálculos de potência a priori . Pode ser possível relatar apenas certas propriedades de uma amostra (neste caso, propriedades de pré-rendimento podem ser aceitáveis), mas isso não é ideal e deve ser claramente explicado quando relatado.

Figura 4: Gráficos de deslocamento de força. (A) Gráfico ideal de deslocamento de força. (B) Gráfico de deslocamento de força resultante de um mau ensaio de flexão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Com todos os gráficos de deslocamento de força examinados e os valores normalizados para tensão-deformação, as propriedades de interesse podem ser identificadas e mostradas de várias maneiras. Na Figura 5, são mostrados os gráficos de força-deslocamento e tensão-deformação resultantes de todo um estudo. Estas são representações esquemáticas pelas quais a força e o deslocamento no ponto inicial (0,0), o escoamento, o ponto final e a falha para cada osso são determinados e, em seguida, a força/tensão e o deslocamento/deformação são calculados em média para fornecer um gráfico médio para cada grupo. Os gráficos não são usados para análise estatística, mas podem ser usados para mostrar como o comportamento geral varia devido a fatores como um tratamento ou estado de doença. Os gráficos mostrados na Figura 5 são de um estudo comparando camundongos controle com aqueles induzidos com um estado de diabetes tipo 2 e doença renal crônica (DRC-T2). As tíbias direitas desses animais foram testadas até a falha com a flexão de quatro pontos e analisadas para obtenção das propriedades discutidas no protocolo seção 8. A partir da Figura 5, fica claro que o grupo DTC2 apresentou propriedades mecânicas reduzidas, incluindo resistência e rigidez, tanto em nível estrutural quanto tecidual. Esses camundongos também parecem ter propriedades pós-rendimento reduzidas, um indicador de fragilidade. Essas parcelas não devem ser usadas para tirar conclusões definitivas de um estudo. Em vez disso, eles atuam como uma representação visual e devem ser verificados realizando uma análise estatística em todas as propriedades de interesse.

Figura 5: Gráficos de deslocamento de força e tensão-deformação para um estudo inteiro . (A) Gráfico de deslocamento de força para animais controle e animais induzidos por diabetes tipo 2 e doença renal crônica. Este gráfico resultou da média da força de escoamento, deslocamento para escoamento, força última, deslocamento final, força de ruptura e deslocamento total para cada grupo e plotando essas médias juntamente com o desvio padrão. (B) Cepa de estresse para animais controle e animais com DRC-T2D. Este gráfico resultou da média da tensão de escoamento, deformação sobre o escoamento, tensão última, deformação última, tensão de ruptura e deformação total e plotando as médias resultantes juntamente com o desvio padrão. Abreviação: T2D-CKD = animais induzidos por diabetes tipo 2 e doença renal crônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os dados mecânicos e os resultados do teste t bicaudal são mostrados na Tabela I. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Um exame geral sugere dados dentro de intervalos adequados e com níveis esperados de variabilidade. Observe que as propriedades pós-rendimento tendem a ter a maior variação e, portanto, muitas vezes requerem os maiores tamanhos de amostra para detectar diferenças significativas. Como as curvas esquemáticas da Figura 5 sugeriram, há diminuições significativas em quase todas as propriedades estruturais e mecânicas em nível tecidual. A partir desses dados, pode-se concluir que o estado de doença induzida levou a ossos mais fracos, menos rígidos e mais suscetíveis à fratura devido à perda da deformabilidade e redução da tenacidade. Estudos com comparações mais matizadas podem não ser tão simples de interpretar. Um exemplo disso pode ser se melhorias significativas forem observadas em todas as propriedades mecânicas de nível estrutural, mas não nas propriedades mecânicas de nível de tecido. Nesse caso, os efeitos observados são provavelmente impulsionados por mudanças na arquitetura do osso (por exemplo, aumento da área, aumento da espessura cortical) em vez de melhorias na qualidade óssea no nível do tecido. Por exemplo, a área óssea aumentou devido ao ganho de osso tecido, mas a qualidade do tecido diminuiu à medida que um osso tecido desorganizado está agora presente, em vez de um osso lamelar organizado. Isso pode ser apoiado pela análise de μCT, na qual melhorias estatisticamente significativas na arquitetura podem ser observadas. Em contraste, pode haver melhorias significativas nas propriedades mecânicas em nível de tecido com melhorias mínimas/nenhuma nas propriedades mecânicas de nível estrutural. Essa alta qualidade do tecido poderia mascarar as armadilhas de ossos menores. A interpretação dos dados pode tornar-se ainda mais complicada se forem observadas alterações nas propriedades pré-rendimento, mas não nas propriedades pós-rendimento ou vice-versa. No primeiro caso, uma mudança na capacidade do osso de resistir à deformação pode ser melhorada, enquanto sua capacidade de tolerar danos não é. Em cada um desses casos, a capacidade de referenciar propriedades arquitetônicas a partir da análise de μCT é altamente benéfica e deve ser utilizada (embora a descrição desse método esteja além do escopo deste artigo). Devido à complexidade da interpretação dessas propriedades, apresentar todas as propriedades em forma de tabela ou figura (não apenas aquelas propriedades que tendem a ser as mais fáceis de interpretar, como a força final, ou que contam a história que se está procurando contar) permite uma representação mais completa dos impactos mecânicos.

Tabela 1: Resultados dos ensaios mecânicos e análise estatística. Valores apresentados como média ± desvio padrão. Os valores de p resultam de um teste t bicaudal não pareado. * P < 0,05 e ** P < 0,01. Abreviação: T2D-CKD = animais induzidos por diabetes tipo 2 e doença renal crônica.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.