Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus

Resumo

Aqui, apresentamos um método de purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que é simples, barato e eficiente.

Resumo

A enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) é um novo agente fibrinolítico que pode tanto ativar o plasminogênio em plasmina quanto degradar a fibrina diretamente, apresentando grandes vantagens sobre os trombolíticos tradicionais. No entanto, devido à falta de informações estruturais, todos os programas de purificação para sFE são baseados em purificações por cromatografia em várias etapas, que são muito complicadas e caras. Aqui, um protocolo de purificação por afinidade de sFE é desenvolvido pela primeira vez baseado em uma estrutura cristalina de sFE; inclui a preparação da amostra bruta e da coluna de cromatografia de afinidade da matriz lisina/arginina-agarose, purificação por afinidade e caracterização do FE purificado. Seguindo este protocolo, um lote de sFE pode ser purificado dentro de 1 dia. Além disso, a pureza e a atividade do FE purificado aumentam para 92% e 19.200 U/mL, respectivamente. Assim, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para purificação de sFE. O desenvolvimento deste protocolo é de grande importância para a posterior utilização de sFE e outros agentes similares.

Introdução

A trombose é uma grande ameaça à saúde pública, especialmente após a pandemia global de Covid-19 ^1,2. Clinicamente, muitos ativadores do plasminogênio (APs), como o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e a uroquinase (UK), têm sido amplamente utilizados como trombolíticos. Os APs podem ativar o plasminogênio dos pacientes em plasmina ativa para degradar a fibrina. Assim, sua eficácia trombolítica é fortemente limitada pelo estado plasminogênico dos pacientes ^3,4. Os agentes fibrinolíticos, como a plasmina metaloproteinase e a serina plasmina, são outro tipo de trombolítico clínico que também inclui enzimas fibrinolíticas (EG), como a plasmina, que podem dissolver diretamente os coágulos, mas são rapidamente inativados por vários inibidores de plasmina⁵. Posteriormente, um novo tipo de agente fibrinolítico foi relatado que pode dissolver o trombo não apenas ativando o plasminogênio em plasmina, mas também degradando diretamente a fibrina 6-a enzima fibrinolítica do antigo verme do amendoim Sipunculus nudus (sFE)⁶. Essa bifunção confere ao sFE outras vantagens em relação aos trombolíticos tradicionais, especialmente em termos de estado anormal do plasminogênio. Comparado a outros fibrinolíticos bifuncionais ^7,8,9, o FE apresenta várias vantagens, incluindo segurança, sobre agentes não derivados de alimentos para o desenvolvimento de fármacos, especialmente para drogas orais. Isso porque a biossegurança e a biocompatibilidade de Sipunculus nudus estão bem estabelecidas¹⁰.

Assim como outros fibrinolíticos naturais isolados de microrganismos, minhocas e cogumelos, a purificação do FEs de S. nudus é muito complicada e inclui múltiplas etapas, como homogeneização tecidual, precipitação com sulfato de amônio, dessalinização, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e peneiramento molecular^10,11,12. Tal sistema de purificação não depende apenas de habilidades proficientes e materiais caros, mas também requer vários dias para concluir todo o procedimento. Portanto, um simples programa de purificação de sFE é de grande importância para o desenvolvimento posterior de sFE. Felizmente, dois cristais de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) foram obtidos com sucesso (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Através de análises estruturais e experimentos de acoplamento molecular, descobrimos que o núcleo catalítico do sFE poderia se ligar especificamente a alvos contendo resíduos de arginina ou lisina.

Neste trabalho, um sistema de purificação por afinidade foi proposto pela primeira vez, baseado na estrutura cristalina do sFE. Seguindo este protocolo, o FE altamente puro e altamente ativo pôde ser purificado dos extratos brutos em um único estágio de purificação por afinidade. O protocolo aqui desenvolvido não é apenas importante para a preparação em larga escala de FEf, mas também pode ser aplicado para a purificação de outros agentes fibrinolíticos.

Protocolo

1. Preparo

1. Tratamento da amostra
   1. Dissecar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) e coletar o intestino e seu líquido interno.
   2. Adicionar 300 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneização (1.000 rpm, 60 s).
   3. Congelar-descongelar o homogeneizado 3x.
   4. Centrifugar a amostra (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) e recolher o sobrenadante. Conservar a amostra a 4 °C até nova utilização.
2. Precipitação proteica
   1. Misture o sobrenadante com uma solução saturada de sulfato de amónio (nove volumes) e deixe repousar durante 12 h a 4 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e continuado mais tarde.
   2. Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtenção do precipitado proteico; armazená-lo a 4 °C para uso posterior.
3. Ressuspensão proteica
   1. Ressuspender o precipitado proteico com 30 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solução de proteína bruta a 4 °C para utilização posterior.

2. Cromatografia de afinidade

1. Filtração de soluções
   1. Filtrar a solução de proteína bruta através de uma membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta amostra a 4 °C para utilização posterior.
2. Embalagem em coluna
   1. Embalar a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de arginina-agarose e a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de lisina-agarose carregando uma quantidade adequada de meio de matriz de lisina-agarose e meio de matriz de arginina-agarose em colunas vazias de cromatografia de 5 mL.
      NOTA: A coluna pode ser armazenada a 2-8 °C, com a matriz imersa em tampão de armazenamento (etanol 20%).
3. Purificação de afinidade
   1. Equilibrar a coluna de cromatografia de afinidade com ddH₂O primeiro (1 mL/min, 10 volumes de coluna), seguido por tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, volumes de 5 colunas).
   2. Carregar a amostra de solução proteica na coluna pré-equilibrada (1 mL/min, volume de 1/3 de coluna).
      NOTA: O volume de carregamento da amostra depende da concentração de sFE.
   3. Lavar a coluna com tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinco volumes de coluna).
   4. Eluir a coluna com NaCl de 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M (1 mL/min, cinco volumes de coluna) sucessivamente.
   5. Procure o pico de eluição que deve aparecer na eluição de NaCl 0,15 M e, em seguida, colete as frações em tubos de 5 mL.
   6. Concentrar a amostra de eluição utilizando um filtro ultracentrífugo de 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta amostra a -80 °C para utilização posterior.

3. Avaliação da pureza

1. Preparação de gel de poliacrilamida em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE)
   1. Preparar o gel SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli utilizando gel concentrado a 5% e gel de separação^{a 12% 13}.
2. Eletroforese
   1. Misturar a amostra (15 μL) com 5x tampão de carregamento de proteína SDS-PAGE (1/4 volume), aquecer em água fervente por 5 min, carregar no gel SDS-PAGE e passar o gel a 80 V, 60 mA por 1,5 h.
3. Análise
   1. Após a eletroforese, corar o gel com um Silver Stain Kit, de acordo com o protocolo do fabricante, e observar o gel corado usando um sistema de imagem quimioluminescente.
   2. Analise a pureza da proteína-alvo utilizando a seguinte fórmula: pureza da proteína-alvo = valor da intensidade da proteína-alvo/valor da intensidade da proteína total.

4. Avaliação da atividade fibrinolítica

1. Preparo da placa de fibrina
   1. Preparar a solução de fibrinogênio misturando 25 mg de fibrinogênio com 1,25 mL de solução salina fisiológica.
   2. Preparar a solução de trombina misturando completamente 100 U de trombina com 1,05 mL de soro fisiológico.
   3. Preparar a solução de agarose adicionando 0,5 g de agarose a 22,5 ml de tampão Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Misturar e aquecer a solução de agarose a 100 °C até dissolver completamente.
   4. Arrefecer a solução de agarose até cerca de 50 °C e adicionar a solução de fibrinogénio. Em seguida, adicione imediatamente a solução de trombina, misture-os rapidamente e despeje-os em uma placa de cultura de 60 mm.
2. Carregamento
   1. Perfurar poços de 3 mm nas placas de fibrina preparadas usando uma broca estéril e encher os poços com amostras de 10 μL.
3. Análise
   1. Após 18 h de incubação a 37 °C, medir a atividade fibrinolítica calculando o tamanho de suas zonas de degradação. Atividade fibrinolítica = (tamanho da zona da amostra/ tamanho da zona da uroquinase) x 100 U. Tamanho da zona = diâmetro x diâmetro.
      OBS: Tampão fisiológico salino, proteína bruta (amostra obtida no protocolo passo 1.3.1) e uroquinase foram utilizados para o controle branco, negativo e positivo, respectivamente. Em comparação com a uroquinase, observamos que a atividade fibrinolítica do FE purificado foi de ~19.200 U/mL.

Resultados

Seguindo este protocolo, lisados teciduais brutos foram extraídos, colunas de cromatografia de afinidade com matriz de arginina-agarose e matriz de lisina-agarose foram construídas, FE purificado foi obtido e a pureza e atividade fibrinolítica do FE purificado foram medidas por SDS-PAGE e placas de fibrina, respectivamente.

Após a centrifugação, o sobrenadante coletado foi um líquido viscoso bronzeado transparente. A precipitação iniciou-se quando este sobrenadante foi misturado com solução sa...

Discussão

Devido à indisponibilidade da sequência exata do gene sFE, o FE atualmente utilizado foi extraído de S. nudus fresco ¹⁴. Além disso, os procedimentos de purificação da FEs relatados na literatura foram complicados e dispendiosos, pois se basearam em algumas características gerais da FEs, como peso molecular, ponto isoelétrico, força iônica e polaridade^15,16. Nenhum protocolo de purificação de afinidade de FEs foi relatado até o mo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoetanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Persulfato de amônio	SINOPHARM
4B	Solarbio	Matriz de arginina-agarose
Bromoxilenol Azul (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogênio	Merck
Glicina	Solarbio
Ácido clorídrico	SINOPHARM
Quinase	RHAWN
Lisina-Sepharose 4B	Matriz Solarbio	Lisina-agarose
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Sigma-Aldrich
(10-170 kD)	Beyotime
	SINOPHARM
Dodecil Sulfonato de Sódio (SDS)	Hidróxido de
	SINOPHARM
Trombina	Meilunbio
Tris (Hidroximetil) Aminometano	Solarbio
Tris (Hidroximetil) Cloridrato de Aminometano	Solarbio
Equipment
AKT Sistema de Purificação de Aprotein	GE
Esterilizador a vapor de pressão vertical automática MLS-3750	Sistema de
Bomba de fluxo constante GE
Incubadora de temperatura constante	JINGHONG
Centrífuga refrigerada de mesa 3-30KS	SIGMA
DGG-9140AD	SENXIN
Homogeneizador de vidro elétrico DY89-II	SCIENTZ
Balança analítica eletrônica	DENVER
Banho-maria eletrotermostático DK-S12	SENXIN
Agitador de descoloração horizontal	Kylin-Bell
Máquina de gelo AF 103	Scotsman
KQ-500E Limpador Ultrassônico	Agitador Magnético Zhi
	wei
Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W	Forno
	Galanz
Milli-Q Referência	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Medidor de pH de Mesa de Precisão	Sartorious
Oscilador de Vórtice de Tamanho Pequeno	Vertical Kylin-Bell
	Bio-Rad
Material Consumível
200 µ L Tubo de PCR (200 µ L)	Axygene
(1,5 mL)	Biosharp
(5 mL)	Biosharp
(50 mL)
(7 mL)	Biosharp
(60 mm)
(0,22 µ m)	Millex GP
Parafilm	Bemis
(1 mL)	KIRGEN
(10 µ L)	Ponta de Pipeta Axygene
(200 µ L)	Axygene
Filtro Ultra Centrífugo TZAKZY
(4 mL 3 KDa)	Reagente

Sulfato de amônio SINOPHARM Arginina-Sepharose Marcador de Proteína de Cor Prestained Cloreto de sódio sódio Sigma-Aldrich puro imagem de quimioluminescência SANYO BT-100 QITE DHG Series Forno de aquecimento e secagem de Microondas Cence Sistema de Eletroforese Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga Tubo de Centrífuga NEST Placa de Cultura Membrana de Filtro NEST Ponta de Pipeta Ponta de Pipeta Papel Indicador Especial Unidade de (15 mL 3 KDa)Unidade de Filtro Ultra Centrífuga Millipore SSS Indicador Universal de pH Millipore