A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
O teste de segurança contra ameaças sociais permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento de evitação social como uma medida da aprendizagem condicionada aversiva e da capacidade de discriminação de segurança contra ameaças sociais, ambos utilizados para identificar indivíduos suscetíveis e resilientes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente.
O estresse social é uma das principais causas do desenvolvimento de transtornos mentais. Para aumentar o valor translacional de estudos pré-clínicos, a experiência de estresse social e seu impacto comportamental em camundongos devem ser comparáveis aos humanos. A derrota social crônica (DSC) utiliza um tipo de estresse social envolvendo ataques físicos e ameaças sensoriais para induzir disfunções mentais semelhantes a transtornos afetivos humanos. Para fortalecer o componente psicossocial do DSC, aplicou-se um protocolo de 10 dias de DSC, no qual as agressões físicas diárias são padronizadas para três episódios de 10 segundos seguidos por uma fase sensorial de 24 horas. Após a10ª fase sensorial, o protocolo de DSC é seguido por um ensaio comportamental refinado chamado teste de segurança de ameaça social (STST). Os ensaios comportamentais pós-estresse precisam determinar como e em que medida o estressor social influenciou o comportamento. O STST permite que camundongos machos cronicamente derrotados socialmente interajam com 2 novos indivíduos masculinos (alvos sociais): um alvo social da cepa atacante encontrada durante os dias de DSC e o outro de uma nova cepa. Ambos são apresentados simultaneamente em diferentes compartimentos de uma arena de teste de três câmaras. O teste permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social para medir a aprendizagem condicionada aversiva bem-sucedida e a capacidade de discriminação de segurança e ameaça social. O desenvolvimento de evitação social para ambas as cepas reflete uma resposta aversiva generalizada e, portanto, uma medida de suscetibilidade ao estresse. Enquanto isso, o desenvolvimento de evitação social em relação apenas à cepa agressora reflete discriminação ameaça-segurança e, portanto, uma medida de resiliência ao estresse. Finalmente, a ausência de evitação social em relação à tensão agressora reflete aprendizagem condicionada aversiva prejudicada. O protocolo visa refinar os modelos de camundongos atualmente usados de suscetibilidade/resiliência ao estresse, incluindo critérios translacionais, especificamente discriminação de segurança de ameaça e generalização de resposta aversiva, para categorizar um único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis, eventualmente avançando futuras abordagens translacionais.
O estresse é definido como a ruptura da homeostase causada por estímulos físicos ou psicológicos1. O estresse é um importante fator de risco bem conhecido para o desenvolvimento de transtornos mentais, como transtorno de estresse pós-traumático, depressão e ansiedade 2,3. Em particular, o estresse social é considerado um importante fator de risco para o desenvolvimento de transtornos mentais relacionados ao estresse4. Um tipo de estresse social que tem ganhado particular importância nas pesquisas é o estresse de subordinação social5. Os camundongos, assim como os humanos, são capazes de um rico conjunto de comportamentos sociais6, tornando-os adequados para investigações que envolvam estresse social. No ambiente de laboratório, quando camundongos adultos são alojados em grupo, eles estabelecem uma estrutura social que envolve a formação de fileiras7. Nesse sentido, o modelo de colônia foi desenhado para estudar os efeitos de hierarquias sociais naturalmente estabelecidas em grupos mistos de camundongos8. Ao longo dos anos, variações do modelo de colônia foram desenvolvidas para utilizar o estresse de subordinação social, incluindo modelos de grupos do mesmo sexo, o modelo de instabilidade social e o modelo de colônia intrusa. Nos últimos anos, no entanto, uma variante específica conhecida como modelo residente-intruso masculino foi popularizada na literatura, simplificando a complexidade social para dois ratos: um residente e um intruso. O animal de interesse, conhecido como intruso, é colocado na gaiola de um criador maior, mais velho e aposentado, conhecido como morador ou agressor. O morador então ataca fisicamente o intruso como método de confronto, estabelecendo uma hierarquia social em que o morador é dominante e o intruso é subordinado. Quando os confrontos são eventos únicos, eles classificam como "agudos" (o "modelo de derrota social aguda"), enquanto confrontos repetidos que duram vários dias (geralmente 10) são conhecidos como "crônicos" (o "modelo de derrota social crônica"). No modelo de derrota social crônica (DSC), os ataques são intermitentes e tipicamente confinados a um período de 5-10 min9, denominado fase física. Após a fase física, o intruso e o residente são mantidos durante a noite na mesma gaiola, separados ao meio com uma parede de malha, permitindo todas as formas de interação, exceto o contato físico. Essa configuração, conhecida como fase sensorial, induz o estresse por meio do aparecimento contínuo de ameaça em vez do confronto físico direto. Em 2018, van der Kooji e colegas introduziram um tratamento social crônico modificado para se concentrar no componente psicossocial do modelo, padronizando e limitando estritamente a fase física10. O modelo modificado limita as agressões físicas a três episódios de 10 s com diferentes residentes, ocorrendo em intervalos interepisódios de 15 min da fase sensorial. Após o terceiro episódio físico, a fase sensorial dura durante a noite. Esse ciclo se repete por 10 dias consecutivos com novos residentes por episódio. O tratamento modificado aumenta a validade translacional do modelo de derrota social crônica à medida que o dano físico do intruso é minimizado e a variabilidade de desfecho de durações diferenciais de ataques físicos é reduzida.
Uma vez que o modelo de DSC é utilizado para estudar doenças relacionadas ao estresse (por exemplo, depressão, ansiedade, transtorno de estresse pós-traumático), ensaios pós-comportamentais são escolhidos, incluindo, mas não limitado a, ensaios comportamentais de agressividade, memória e anedonia. Nos últimos anos, ensaios comportamentais pós-DSC em camundongos frequentemente avaliam como e em que medida a sociabilidade éafetada9. A sociabilidade é definida como a preferência inata dos ratos em interagir socialmente em vez de evitar socialmente um conespecífico. Uma vez que a sociabilidade está sujeita aos efeitos do estresse, foram estabelecidos ensaios que avaliam apenas o desenvolvimento da evitação social. A evitação social induzida pelo estresse tem relevância translacional por representar um dos principais sintomas comportamentais de ansiedade social e depressão em humanos11. Semelhante aos humanos, nem todos os camundongos desenvolvem evitação social após o tratamento com DSC, sugerindo a presença de individualidade na responsividade ao estresse. Cohen e colaboradores propuseram critérios comportamentais de corte como uma abordagem promissora para o estudo da neurobiologia da individualidade12. A seleção dos animais com base no comportamento resulta na divisão dos grupos, reforçando a base para estudos gene-ambiente. Posteriormente, diferentes subgrupos frequentemente mostram enriquecimento distinto de variantes/modificações genéticas específicas, que por sua vez podem ser investigadas sob diferentes condições ambientais13. Nesse sentido, a individualidade no desenvolvimento da esquiva social foi utilizada para dividir o único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente em dois subgrupos: suscetíveis ao estresse (socialmente evitativos) e resilientes ao estresse (socialmente nãoevitativos9,14). No entanto, a interpretação do fenótipo de esquiva social em camundongos como um comportamento desadaptativo ou adaptativo deve ser considerada no contexto geral do tratamento (aqui DSC) e do ensaio comportamental pós-tratamento. Além disso, o ensaio comportamental de escolha pós-tratamento idealmente avaliaria outras facetas da sociabilidade e não apenas o desenvolvimento da esquiva social. Nosso trabalho recente revelou o envolvimento da aprendizagem condicionada na evitação social induzida porDSC15. Especificamente, a esquiva social induzida pelo DSC é uma resposta condicionada aversiva aos traços caracterizadores da tensão dos residentes, servindo como estímulo condicionado ao estímulo incondicionado, ou seja, os ataques dos residentes. Além disso, dentro do subgrupo socialmente evitativo, alguns indivíduos podem discriminar entre os traços da cepa dos residentes aversivos e os de outras cepas novas seguras, enquanto outros indivíduos mostram evitação social generalizada para ambas as cepas. Propomos aqui um refinado ensaio comportamental pós-DSC: o Social Threat-Safety Test (STST)15. Ao contrário de outros testes de interação social9, o STST permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social como uma medida da resposta condicionada aversiva correta (isto é, aprendizagem condicionada bem-sucedida) e da capacidade de discriminação de segurança e ameaça social, ambas utilizadas para identificar indivíduos suscetíveis e resistentes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente. A avaliação da discriminação de ameaça social versus generalização de resposta aversiva amplia os critérios translacionais usados para classificar o único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis.
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias relativa aos cuidados e utilização de animais em procedimentos experimentais e foram aprovados pelas autoridades locais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). A Figura 1 representa uma linha do tempo esquemática.
1. Tratamento
2. Teste pós-tratamento: Teste de ameaça social-segurança (Figura 2)
3. Pontuação e análise
OBS: Apenas o teste pós-tratamento de estresse, ou seja, o STST é pontuado e analisado (e não o tratamento de estresse do DSC).
Índice de interação social como medida de resposta condicionada aversiva
Um índice de interação social ≥1 reflete maior interação social com o respectivo alvo social em comparação com a exploração dos recintos de malha vazios. Em condições basais, aqui definidas como não tendo experiência apetitiva ou aversiva com os traços caracterizadores de uma cepa específica (aqui tanto alvos sociais para o grupo controle quanto o alvo social 129/Sv para o grupo de tratamento), níveis de sociabilidade intactos são refletidos em um índice de interação social ≥1 com essa mesma cepa. Enquanto isso, após uma experiência de condicionamento socialmente aversivo (aqui tratamento de DSC) com uma cepa específica (aqui a cepa do residente, ou seja, a cepa CD-1) e, portanto, com seus traços caracterizadores servindo como um estímulo condicionado, o desenvolvimento da evitação social como medida de uma resposta condicionada aversiva correta se reflete em um índice de interação social <1 com essa mesma cepa. O efeito do stress da DSC é o primeiro a ser avaliado e a nível global do grupo de tratamento (ver passo 3.6 do protocolo). Especificamente, o efeito do estresse é refletido no grupo de tratamento ter um índice de interação social <1 com a meta social CD-1 como uma medida do desenvolvimento de evitação social em relação à cepa CD-1. Enquanto isso, os níveis basais de sociabilidade intactos do grupo controle se refletem em ter um índice de interação social ≥1 com o mesmo alvo social. Isso resulta em uma diferença significativa (p < 0,05) no índice de interação social com o alvo social CD-1 entre os dois grupos (Figura 2C).
Identificação de três subgrupos fenotípicos distintos dentro de um único grupo cronicamente derrotado socialmente pelo teste de ameaça social-segurança
Após a divisão dos animais com base no índice de interação social, conforme explicado nas etapas 3.4 e 3.5 do protocolo, uma diferença significativa (p < 0,05) no índice dentro de um único subgrupo entre os dois alvos sociais, só será encontrada dentro do subgrupo de evitadores de discriminação (Figura 2D,E). O subgrupo de evitadores discriminadores e o subgrupo de evitadores indiscriminados têm um índice de interação social <1 com o alvo social CD-1, uma medida do desenvolvimento da evitação social em direção ao estímulo condicionado (tensão CD-1), refletindo assim o desenvolvimento de uma resposta condicionada aversiva correta e de aprendizagem condicionada aversiva bem-sucedida. Em contraste, o índice de interação social (≥1) do subgrupo de não evitadores reflete a aprendizagem condicionada aversiva prejudicada com o mesmo alvo social (cepa CD-1). Enquanto isso, a capacidade de discriminação ameaça-segurança é refletida no subgrupo de evitadores de discriminação ter um índice de interação social ≥1 com o alvo social 129/Sv como uma medida dos níveis de sociabilidade intactos em direção a um estímulo seguro/neutro (cepa 129/Sv). Em contraste, a generalização da resposta aversiva do subgrupo evitadores indiscriminados reflete-se em ter um índice de interação social 0,05) com ambos os alvos sociais dentro do grupo controle.
Interpretação dos resultados dos testes de ameaça social-segurança
As características do subgrupo de evitadores de discriminação, incluindo o aprendizado condicionado bem-sucedido de pistas associadas à ameaça e a discriminação ameaça-segurança, são discutidas como características de indivíduos resilientes ao estresse 16,17,18,19,20,21,22 . Em contraste, respostas condicionadas aversivas generalizadas após eventos traumáticos, como visto pelo subgrupo Evitadores indiscriminados, são um sintoma-chave de transtornos mentais relacionados ao estresse, como transtorno de estresse pós-traumático e transtornos de ansiedade 16,17,23,24,25,26 e, portanto, são características de indivíduos suscetíveis ao estresse. Finalmente, o subgrupo não evitadores representa um fenótipo de aprendizagem prejudicada16.
Figura 1: Linha do tempo esquemática. Ao chegar à instalação, hospede sozinho todos os camundongos por 7 dias e designe para os tratamentos: grupo tratado com estresse CSD ou grupo tratado controle manipulado. Os tratamentos duram 10 dias, após os quais os animais são alojados individualmente por 1 dia. Montar as arenas para realizar o STST (que ocorre após o alojamento único dos animais por 1 dia). Comece com a fase de habituação por 6 min. Siga a fase de habituação imediatamente com a fase de teste por mais 6 min. Por fim, devolva os animais para suas gaiolas domésticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Teste de segurança contra ameaças sociais. (A) Projeto de ensaio. O teste é realizado em uma arena de três câmaras divididas em três partes iguais separadas por paredes transparentes com aberturas, permitindo que o animal de interesse (C57BL6/J, preto) se mova no meio. Em cada uma das periferias, é colocado um recinto de malha. Um recinto contém um novo alvo social da cepa dos residentes encontrada mais cedo durante o tratamento do DSC (CD-1, branco); o outro contém um novo alvo social de uma nova cepa combinada em idade, tamanho e sexo com o novo rato da cepa dos residentes, mas de cor de pele diferente (129/Sv, marrom). Ambos os alvos sociais são mais antigos e maiores do que o animal de interesse. O animal de interesse é introduzido no meio da arena e é autorizado a explorar a arena por 6 min durante a fase de habituação, quando os recintos de malha estão vazios, e novamente durante a fase de teste, quando os alvos sociais são colocados dentro dos recintos de malha, conforme descrito. (B) Índice de interação social. Pontuar o tempo gasto explorando os recintos de malha durante a fase de habituação quando o nariz do animal estiver dentro da zona de interação (2 cm ao redor dos limites dos recintos de malha). Posteriormente, pontuar o tempo gasto interagindo com os alvos sociais durante a fase de teste quando o nariz estiver dentro da zona de interação. Calcule o índice de interação social conforme mostrado. (C) Efeito de estresse social crônico: O grupo de tratamento tem um índice de interação social <1 com o alvo social CD-1 como uma medida do desenvolvimento de evitação social em relação à cepa CD-1. Enquanto isso, os níveis basais de sociabilidade intactos do grupo controle se refletem em ter um índice de interação social ≥1 com o mesmo alvo social. Isso resulta em uma diferença significativa (p < 0,05) no índice de interação social com o alvo social CD-1 entre os dois grupos. Resultados apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), n=16 por grupo, teste de Mann-Whitney. (D) Resultados representativos do teste de segurança de ameaça social após tratamento crônico de derrota social. O grupo de tratamento é dividido em três subgrupos com base nos índices de interação social dos animais com os alvos sociais. Camundongos com um índice de interação social ≥1 com o alvo social CD-1 são denominados não-evitadores, camundongos com um índice de interação social <1 com ambos os alvos sociais são denominados evitadores indiscriminados, e camundongos com um índice de interação social ≥1 apenas com o alvo social 129/Sv são denominados evitadores-discriminadores. O grupo controle apresenta índices semelhantes com ambos os alvos sociais. Resultados apresentados como média ± EPM, n = 55 por sub/grupo. (E) Mapas de calor representativos de cada sub/grupo durante a fase de ensaio do STST. Cores mais escuras indicam mais tempo gasto na área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Critérios de abortamento para procedimento de derrota social crônica. A tabela apresenta um total de quatro famílias de observações, cada uma com várias sub-observações27. Cada observação tem uma pontuação. Dependendo da soma da pontuação, medidas a serem tomadas são indicadas. Clique aqui para baixar esta tabela.
Os autores não têm nada a revelar.
O teste de segurança contra ameaças sociais permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento de evitação social como uma medida da aprendizagem condicionada aversiva e da capacidade de discriminação de segurança contra ameaças sociais, ambos utilizados para identificar indivíduos suscetíveis e resilientes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente.
Esta pesquisa é apoiada pelo Centro de Pesquisa Colaborativa 1193, Subprojeto Z02, financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Alemanha (SFB1193, Neurobiologia da Resiliência) e pela Fundação Boehringer Ingelheim (concessão ao Instituto Leibniz de Pesquisa em Resiliência e Fenotipagem Individual e Análise Comportamental Automatizada de Alta Resolução). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Konstantin Radyushkin e à Sra. Sandra Reichel por sua assistência técnica, bem como à Sra. Hanna Kim por seu suporte em inglês. As fontes de financiamento não tiveram envolvimento no desenho do modelo; coleta, análise e interpretação dos dados; na redação do protocolo; e na decisão de submeter o protocolo para publicação.
| Arenas | Noldus, Gaiola de sociabilidade, Wageningen, Holanda | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Três câmaras, em forma retangular com um tamanho total de 60 cm x 40 cm, feito de paredes transparentes de acrílico e pisos lisos |
| Câmera para gravação de vídeo | Basler AG, Alemanha An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg | ace Classic acA1300-60gc | Se estiver usando o programa de detecção automática, certifique-se de que as câmeras sejam compatíveis |
| Objetiva da câmera | KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Düsseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv | Part-No. 10504 | |
| Programa de detecção/Temporizador | Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, Holanda | https://www.noldus.com/ethovision-xt | A detecção pode ser realizada manualmente (usando um temporizador ou um software para pontuação manual) ou automaticamente |
| Gaiolas de alojamento | ZOONLAB GmbH, Hermannstraß e 6, 44579 Castrop-Rauxel | 3010010 | gaiolas Tipo 2: 265 mm x 205 mm x 140 mm (c x l x a), ou seja, 360 cm² área inferior. Feito de policarbonato (Makrolone©) e Polysulfone. As tampas são feitas de aço inoxidável. Gaiolas padrão europeias para até 5 ratos (20– 25 g). Autoclavável até 134 > Gabinetes de |
| malha C | Parte do Pacote Arena: Noldus, Gaiola de Sociabilidade, Wageningen, Holanda | https://www.noldus.com/applications/sociability-cage | Pequena gaiola de acrílico ou metal com um diâmetro de 100 mm e uma altura de 200 mm com aberturas de 10 mm de tamanho. Dois gabinetes de malha por arena funcionariam, mas quatro é preferível (consulte o ponto 2.5 no protocolo) |
| Parede de malha | de fabricação própria | N / A | Acrílico ou metal, um para cada gaiola. O tamanho depende das gaiolas usadas. As paredes não devem permitir que os dois animais tenham contato físico |
| Alvos sociais: Camundongos das linhagens CD-1 e 129/Sv; reprodutores machos aposentados | Camundongos fornecidos pela Charles River: Nome da cepa: CD-1® IGS Mouse 129S2/SvPasCrl | Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl | CD-1 e 129/Sv reprodutores machos aposentados, de casa única, novos (desconhecidos) coespecíficos para os animais de interesse. Se os criadores aposentados não estiverem disponíveis, os machos com mais de 1 ano de ambas as linhagens seriam suficientes |
