Triagem de sensibilidade a drogas esferóides em linhagens de células-tronco de glioma

Resumo

As telas de sensibilidade a medicamentos in vitro são ferramentas importantes para descobrir combinações de medicamentos anticâncer. Células cultivadas em esferas ativam diferentes vias de sinalização e são consideradas mais representativas de modelos in vivo do que linhagens celulares monocamada. Este protocolo descreve um método para triagem in vitro de drogas para linhagens esferoides.

Resumo

As telas de sensibilidade a medicamentos in vitro são ferramentas importantes na descoberta de terapias combinadas de medicamentos anticâncer. Normalmente, essas triagens de drogas in vitro são realizadas em células cultivadas em monocamada. No entanto, esses modelos bidimensionais (2D) são considerados menos precisos em comparação com os modelos tridimensionais (3D) de células esferoides; Isso é especialmente verdadeiro para linhagens de células-tronco de glioma. Células cultivadas em esferas ativam diferentes vias de sinalização e são consideradas mais representativas de modelos in vivo do que linhagens celulares monocamada. Este protocolo descreve um método para triagem in vitro de linhas esferóides; linhagens de células-tronco de glioma humano e de camundongo são usadas como exemplo. Este protocolo descreve um ensaio de sinergia e sensibilidade a medicamentos esferóides 3D que pode ser usado para determinar se um medicamento ou combinação de medicamentos induz a morte celular e se dois medicamentos sinergizam. As linhagens de células-tronco de glioma são modificadas para expressar RFP. As células são revestidas em placas de fundo de poço de baixa fixação e as esferas podem se formar durante a noite. Os medicamentos são adicionados e o crescimento é monitorado medindo o sinal RFP ao longo do tempo usando o sistema de imagem ao vivo Incucyte, um microscópio de fluorescência embutido na incubadora de cultura de tecidos. Metade da concentração inibitória máxima (IC50), dose letal mediana (DL50) e escore de sinergia são subsequentemente calculadas para avaliar a sensibilidade aos medicamentos isoladamente ou em combinação. A natureza tridimensional deste ensaio fornece um reflexo mais preciso do crescimento do tumor, comportamento e sensibilidades a medicamentos in vivo, formando assim a base para uma investigação pré-clínica adicional.

Introdução

O glioblastoma é uma neoplasia cerebral devastadora e de alto grau, com sobrevida global de 5% em cinco anos¹. Gliomas de alto grau (HGG), como o glioblastoma, representam a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer na população pediátrica² e são um dos tumores mais recalcitrantes para tratar também em adultos³. Apesar dos avanços significativos em nossa compreensão dos fatores moleculares do HGG, as opções de tratamento permanecem limitadas³, enfatizando a necessidade de métodos de triagem de medicamentos que prevejam com mais precisão as sensibilidades terapêuticas na clínica.

As culturas de células 3D têm sido usadas principalmente para a modelagem do comportamento celular fisiologicamente relevante⁴. Além disso, a arquitetura 3D do microambiente tumoral pode ser recapitulada in vitro estabelecendo ensaios de crescimento 3D⁵. O crescimento esferóide também ativa diferentes vias de sinalização e, portanto, é considerado mais representativo dos modelos in vivo ^6,7 em comparação com a cultura 2D. As células-tronco pediátricas de HGG e nossas linhagens de células-tronco de glioma NF1 de camundongo crescem naturalmente como neuroesferas e usaram essas linhagens de células de glioma NF1 de camundongo em uma triagem de drogas de médio rendimento⁸. As linhagens pediátricas usadas aqui foram derivadas de HGG pediátrico hemisférico, de linha média e cerebelar e foram adquiridas e totalmente caracterizadas pela Children's Brain Tumor Network (perfis de mutação e expressão gênica)⁹. Essas linhas foram modificadas para expressar uma proteína fluorescente vermelha nuclear (RFP), que permite o monitoramento da proliferação e sobrevivência usando o sistema de imagem ao vivo Incucyte. A intensidade do sinal RFP é representativa do número de células presentes. Outros fluoróforos, como a proteína fluorescente verde (GFP), também podem ser usados.

A quimioterapia combinada para leucemia linfoblástica aguda infantil, linfomas, neoplasias epiteliais e muitos outros tipos de câncer é uma maneira eficaz de erradicar tumores e prevenir a resistência a medicamentos a agentes únicos ^10,11. No entanto, há informações limitadas sobre quais agentes combinar para alcançar sensibilidades terapêuticas em HGG, incentivando o uso de modelos esferóides mais precisos em testes de drogas in vitro.

Protocolo

Todos os procedimentos do protocolo foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Infantil da Filadélfia.

1. 3D revestimento de células esferóides

1. Prepare meios de células-tronco de glioma: Para fazer o meio de base, adicione 50 mL do suplemento de proliferação e 5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina 100x (10.000 U/mL) ao meio basal (500 mL). Para fazer meios de células-tronco de glioma, adicione o fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a uma concentração final de 20 ng/mL e 10 ng/mL, respectivamente, conforme a descrição do fabricante.
   NOTA: Os meios de células-tronco de glioma podem ser usados por 1 semana quando armazenados a 4 °C.
2. Dissociar células que expressam RFP:
   NOTA: Neste exemplo, a linha de células-tronco NF1 HGG do camundongo 5746 é usada.
   1. Transfira as esferas de glioma para um tubo cônico de 15 mL e gire as esferas de glioma em uma centrífuga (150 x g por 5 min). Remover o sobrenadante e adicionar 300 μL de accutase para dissociar as esferas (incubar durante 5 min a 37 °C).
   2. Adicione 1 mL de meio de células-tronco de glioma e interrompa as esferas pipetando suavemente. Centrifugue as células dissociadas por 5 min a 150 x g, aspire o sobrenadante e dissolva o pellet em 1 mL de meio de células-tronco de glioma.
3. Meça a concentração de células usando um contador de células ou hemocitômetro. Ao usar um contador de células de fluorescência, adicione 18 μL da suspensão celular a 2 μL de laranja de acridina/coloração de iodeto de propídio. Carregue 12 μL desta suspensão em um hemocitômetro para contar o número de células vivas/mortas presentes na suspensão.
4. Dilua as células até uma concentração final de 2.000 células por 100 μL de meio de células-tronco de glioma.
   NOTA: As modificações na concentração celular podem depender da linhagem celular e podem ser ajustadas de acordo.
5. Usando uma pipeta multicanal, dispense 100 μL da suspensão celular (2.000 células por 100 μL) em cada poço de uma placa de fixação inferior redonda de 96 poços por pipetagem reversa.
   NOTA: Use placas de fixação baixas de fundo redondo; Essas placas estimularão a formação de uma única esfera de glioma em cada poço. A pipetagem reversa evita a formação de bolhas, que interferirão na captura de imagens do sistema de análise de células vivas.
6. Centrifugue as placas a 150 x g por 5 min.
   NOTA: A centrifugação é uma etapa crítica para iniciar a formação da neuroesfera 3D.
7. Incube durante a noite para permitir que uma única esfera se forme em cada poço.

2. Adição de fármacos para ensaio de sinergia (Figura 1)

1. Certifique-se de que cada poço da placa de 96 poços receba uma concentração específica dos medicamentos 1 e 2. Crie uma grade em que cada concentração do medicamento 1 seja combinada com cada concentração do medicamento 2 em duplicata.
2. Faça uma diluição seriada dos dois medicamentos para os quais a sinergia será determinada (5 diluições do medicamento 1 e 7 diluições do medicamento 2) usando o meio de células-tronco de glioma (Figura 1A).
   NOTA: Neste estudo, é utilizada uma série de diluição serial de 50%; No entanto, qualquer série de diluição pode ser utilizada.
   1. A série de diluições deve ser 7x mais concentrada do que a concentração final desejada em cada alvéolo. Por exemplo, se a concentração final mais alta para o medicamento 1 for 1 μM, faça a primeira concentração da série de diluição para o medicamento 1, 7 μM (1 mL, Tubo B ou I na Figura 1A).
   2. Adicione 500 μL de meio de células-tronco de glioma a cada tubo adicional da série de diluição (tubos CH e JM, conforme mostrado na Figura 1).
   3. Para criar a série de diluição, aspire 500 μL da mistura de drogas do Tubo B ou Tubo I e adicione-o ao próximo tubo na série de diluição Tubo C ou Tubo J, respectivamente (contendo 500 μL de meio de células-tronco de glioma). Misturar bem e repetir para o tubo seguinte da série de diluições. Faça um controle DMSO (Tubo A) e certifique-se de que a concentração de DMSO seja a mesma em todas as condições.
      NOTA: Modificações nas concentrações de medicamentos e séries de diluição podem ser feitas. Certifique-se de listar as concentrações corretas do medicamento no Arquivo Suplementar 1 se a série de diluição for alterada.
3. Para cada poço das placas de 96 poços, adicione 20 μL de fármaco 1 e 20 μL de fármaco 2 por pipetagem reversa, conforme mostrado na Figura 1B, para um volume final de 140 μL por poço; As combinações de medicamentos são avaliadas em duplicata. Se estiver usando a análise downstream fornecida para IC50 e LD50, use o layout do medicamento conforme mostrado na Figura 1B.
   1. Neste ensaio, o efeito de cada medicamento por si só (sem que o outro medicamento esteja presente) também é medido. Certifique-se de adicionar 20 μL de meio de controle DMSO (Tubo A na Figura 1B) a esses poços de medicamento único para trazer o volume final de cada poço para 140 μL.
   2. Certifique-se de que os poços não contenham bolhas, pois isso afetará a imagem.
      NOTA: Modificações no volume final podem ser feitas; No entanto, certifique-se de ajustar as concentrações no ponto 2.2.
4. Coloque as placas no gerador de imagens ao vivo e monitore o crescimento de cada esfera em cada poço usando o módulo esferóide, configuração de esfera única, imagem de campo claro e RFP com ampliação de 4x.
5. Monitore as placas por 72 h, gerando imagens de cada poço da placa em um intervalo de tempo regular, normalmente 2 h.
   NOTA: Carregue um mapa de placa correto; isso garantirá uma análise adequada a jusante (Figura 1C).

3. Cálculo de IC50, DL50 e escore de sinergia (Figura 2 e Figura 3)

1. Analise a intensidade da RFP para cada poço e cada ponto de tempo usando o software de geração de imagens ao vivo. Os parâmetros de análise utilizados estão listados nos arquivos suplementares (Arquivo Suplementar 2).
   NOTA: Diferentes parâmetros de análise podem ser usados conforme preferir.
2. Exporte os dados de RFP como Intensidade de RFP integrada vermelha total para cada poço, certificando-se de exportar os dados brutos não agrupados (Figura 2A).
   NOTA: Se estiver usando o modelo fornecido (Arquivo Suplementar 1) para calcular IC50 e LD50, é essencial aderir ao ponto 3.2
3. Determine a média e o desvio padrão para cada combinação de medicamentos de (1) a mudança de dobra em comparação com apenas o DMSO (para este cálculo, os valores de 0 h não são necessários) e (2) o Log2 da mudança de dobra em comparação com 0 h colando os dados brutos na planilha Excel fornecida (Figura 2B e veja o exemplo no Arquivo Suplementar 1).
4. Ajuste a concentração máxima dos medicamentos 1 e 2 na planilha (Figura 2B).
   NOTA: Certifique-se de ajustar as concentrações dos medicamentos 1 e 2; caso contrário, serão calculados valores incorretos de LD50 e IC50.
5. Calcule os valores IC50 usando um aplicativo de software de análise de dados apropriado (aqui, o GraphPad é usado). Para o cálculo do valor IC50, use a mudança de dobra média e a mudança de dobra de desvio padrão em comparação com o DMSO determinado apenas na etapa 3.4 e copie as tabelas IC50 dos medicamentos 1 e 2 para o software de análise de dados (Log (inibidor) vs. resposta normalizada, inclinação variável) (Figura 3A).
   1. Use apenas dados de poços aos quais um único composto foi adicionado para os cálculos do IC50. Use os valores de concentração de drogas Log no software de análise de dados, que são calculados automaticamente na planilha fornecida.
6. Calcule a pontuação de sinergia:
   1. Use a mudança média de dobra em comparação com o DMSO apenas de cada combinação para calcular a pontuação de sinergia usando um pacote de software ou site. Por exemplo, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (parâmetros: ajuste da curva LL4, método ZIP para cálculo da pontuação de sinergia). O Arquivo Suplementar 1 calcula automaticamente os valores necessários para criar a tabela de entrada de sinergia que pode ser carregada no SynergyFinder (Figura 3B). Um exemplo da tabela de entrada de sinergia é fornecido no Arquivo Suplementar 3.
      NOTA: Uma pontuação acima de 10 denota sinergia, uma abaixo de -10 denota antagonismo e um valor entre -10 e 10 mostra efeitos aditivos.
7. Calcule a pontuação LD50:
   1. Para cada concentração do medicamento 1, calcule o LD50 do medicamento 2. O arquivo suplementar calcula automaticamente o valor Log2 e o desvio padrão para cada concentração (Figura 3C).
   2. Insira a média e o desvio padrão da mudança de dobra Log2 em comparação com 0 h, bem como o número de réplicas no software de análise de dados (neste estudo, 2,) e calcule o valor LD50 e o desvio padrão LD50 determinando a concentração em -1 (Log2 = -1 representa o valor log2 para o qual 50% do sinal é perdido em comparação com 0 h). Nesses cálculos, use o modelo de parâmetros Log(inibidor) vs. resposta, inclinação variável de 4 parâmetros.
      NOTA: O software de análise de dados não calcula automaticamente a concentração do medicamento correspondente a um valor log2 = -1; no entanto, esse valor pode ser adicionado aos cálculos relatados do software de análise de dados como uma equação definida pelo usuário (Figura 3C). Certifique-se de usar os valores de concentração Log no software de análise de dados, que são calculados automaticamente na planilha fornecida. O Arquivo Suplementar 4 mostra os painéis IC50 e LD50 no software GraphPad.

Resultados

Como exemplo, foi avaliada a sinergia de Trametinib (inibidor de MEK) e GDC-0941 (inibidor de PI3K), que inibem duas vias efetoras a jusante do RAS na linhagem de células-tronco de glioma de camundongo 5746 (expressão de RFP) (Figura 4). A Figura 4A mostra a mesma esfera em 0 h e 72 h tratada com uma combinação de Trametinibe e GDC-0941. Essas imagens foram exportadas diretamente do software de imagem ao vivo. IC50 e LD50 foram calculados conforme descrito no Gr...

Discussão

Este protocolo descreve os ensaios de triagem de drogas 3D que têm sido efetivamente usados para avaliar as vulnerabilidades a drogas em modelos esferóides de glioma⁸. Este sistema de ensaio esferóide 3D foi projetado especificamente para permitir uma investigação pré-clínica mais precisa de quimioterapias combinatórias para linhagens celulares de glioma cultivadas em esferas. Para o HGG, esse método fornece uma estrutura para identificar possíveis vulnerabilidade...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de centrifugação de 15 mL	CELLTREAT	229411	Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL, placa estéril
de 96 poços	MS9096UZPlaca	fixação ultrabaixa de fundo redondo de 96 poços
Accutase	STEMCELL Technologies	7922	Solução de desprendimento de células
Acridina Laranja/Mancha de Iodeto de Propídio	Logos Biosystems	F23001	Vivo/morto corante para contagem de células
bFGF	STEMCELL Technologies	78003.2	bFGF recombinante humano
	Logos Biosystems	L20001	LUNA-FL Centrífuga contrária de células de fluorescência dupla
	Eppendorf	5810R	Centrifugação de células e placas
DMSO	Pierce	20688	solvente para compostos
	EGF STEMCELL Tecnologias	78006.2	Tubos EGF Eppendorf recombinantes humanos
	Costar	07-200-534	Tubos de microcentrífuga
Excel	Microsoft		Microsoft excel
GDC-0941	Selleckchem	S1065	Droga 1
GraphPad	GraphPad GraphPad	Prism 9	IC50 e LD50
	Biosystems	LGBD10008	Sartorius
S3	Incucyte	Luna	embutido na incubadora de cultura de tecidos que obtém imagens de todos os poços em intervalos de tempo específicos.
Software de incucito	Sartorius	Incucyte 2022B	Análise de dados de proliferação
Mídia	STEMCELL Technologies	5702	Kit de proliferação NeuroCult (Camundongo e Rato) contendo Meio Basal e suplemento
de crescimento Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	Antibióticos para adicionar à mídia
Trametinib	Selleckchem	S2673	Medicamento 2

de Contador de células Cálculo de logotipos de hemocitômetros microscópio de fluorescência PhotonSlide