Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.
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Artigo de método
Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A enxertia de organoides em tecidos vascularizados em animais modelo, como a membrana corioalantóide (CAM) imunodeficiente de camundongos ou embriões de pintinhos, tem se mostrado eficiente para a modelagem da neovascularização. A CAM é uma membrana extraembrionária ricamente vascularizada, que apresenta imunorreatividade limitada, tornando-se um excelente modelo hospedeiro para transplantes de células de origem humana.
Este trabalho descreve a estratégia para enxertar organoides cerebrais humanos diferenciados em múltiplos estágios de maturação no MAC. A composição celular dos organoides cerebrais muda com o tempo, refletindo os marcos do desenvolvimento do cérebro humano. Nós enxertamos organoides cerebrais em estágios de maturação relevantes: expansão neuroepitelial (18 DIV), neurogênese precoce (60 DIV) e gliogênese precoce (180 DIV) na CAM de embriões embrionários dia (E)7 de galinha. Organoides cerebrais enxertados foram colhidos 5 dias depois e suas características histológicas foram analisadas.
Não foram detectados sinais histológicos de neovascularização nos organoides enxertados ou vasos sanguíneos anormais adjacentes aos enxertos. Além disso, mudanças marcantes foram observadas na composição celular dos organoides enxertados, a saber, um aumento no número de astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos-reativos. Entretanto, as alterações citoarquiteturais foram dependentes do estágio de maturação dos organoides. Em conjunto, esses resultados sugerem que organoides cerebrais podem crescer no MAC e mostram diferenças na citoarquitetura dependendo do estágio de maturação na enxertia.
Introdução
Os organoides cerebrais humanos são uma técnica emergente que nos permite recapitular in vitro o desenvolvimento inicial do cérebro humano 1,2,3. No entanto, uma das principais limitações desse modelo é a falta de vascularização, que desempenha papéis indispensáveis não só na homeostase cerebral, mas também no desenvolvimentocerebral4. Além da oferta de oxigênio e nutrientes, evidências acumuladas sugerem que o sistema vascular cerebral regula a diferenciação neural, migração e sinaptogênese durante o desenvolvimento
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Protocolo
Os embriões de galinha-de-leghorn (Gallus gallus) foram tratados seguindo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, EUA, e os experimentos foram aprovados pelo Council for Care and Use of Experimental Animals da Universidade de Barcelona.
1. Preparação organoide cerebral não guiada
- Manter as células estaminais embrionárias humanas H9 (hESCs) em mTESR1 pré-aquecidas à temperatura ambiente (RT) sob uma confluência de 70% em placas de 6 poços revestidas com Matrigel dissolvido em DMEM (1:40) numa in....
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Resultados
Seleção do cronograma de maturação do embrião para o transplante
O experimento inicia-se em D0, quando os ovos fertilizados são incubados a 38 °C e 60% de umidade relativa. A membrana corioalantóide (MAC) é uma membrana extraembrionária altamente vascularizada que se desenvolve após a incubação dos ovos. É formado pela fusão do alantois e córion. Em D1, após 24 h de incubação, a câmara de ar é puncionada para impedir que a CAM se fixe à membrana interna do invólucro. A punção da câmara de ar em D1 mel.......
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Discussão
Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado com inúmeras etapas fundamentais que proporcionam crescimento e desenvolvimento favoráveis de organoides cerebrais humanos após a enxertia sem perturbar a sobrevivência dos embriões de galinha. Recomendamos o uso de agulhas estéreis para puncionar a câmara de ar do ovo após 24 h de incubação (dia 1). Além disso, também tentamos fazer a punção no 4º dia (após verificar a casca do ovo com luz para testar o desenvolvimento da vasculatura para ter certeza de que estávamos trab.......
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Divulgações
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Alcántara e ao Dr. Ortega do UB e ao resto dos membros do laboratório do Dr. Acosta pelas discussões perspicazes. S.A. é professor assistente da Generalitat de Catalunya da Universitat de Barcelona.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1.000 |
| Anti-GFAP, coelho | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-coelho AlexaFluor 488, cabra. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, cabra | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Ovos de galinha Leghorn Branca Fertilizada (Gallus gallus) | Granja Gibert (Cambrils, Espanha) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | meio de montagem à base de xileno |
| Solução de dissociação suave | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | solução de dissociação celular |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mídia de montagem | Merk | 81381 | |
| Toalha de papel, grau de laboratório | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| inibidor de ROCK Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Tesoura cirúrgica de ponta afiada | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscópio Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Referências
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
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Reimpressões e permissões
