Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.
Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os "brilhantes", expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.
As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.
Introdução
As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Aprovação ética e consentimento para participar: Amostras de polpa dentária decídua esfoliada humana foram recebidas após a obtenção de consentimento informado e aprovação ética completa pelo Departamento Oral e Maxilofacial do Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Liberação Ética Hospitalar, SRGCDS. Em seguida, o isolamento, o cultivo, a manutenção e a aplicação de SHEDs foram aprovados e em conformidade com as diretrizes recomendadas pelo Comitê Institucional para Pesquisa em Células-Tronco (IC-SCR) do Instituto Manipal de Medicina Regenerativa, MAHE - Bengaluru. Consulte a Tab....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os SHEDs foram caracterizados com ensaios de imunofluorescência padrão mostrando a expressão de vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e núcleos corados com DAPI (Figura 1A). Para estimar suas capacidades proliferativas e formadoras de colônias, ensaios padrão de crescimento celular de curta duração foram realizados. Um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação do dia 2 para o dia 8 foi mostrado na
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traumáticas22. O protocol.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses referente à publicação deste artigo.
Agradecimentos
Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Mancha Azul Alcian | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Controle Negativo (BSA) Compensação Plus (7.5 µ m) Conjunto de Partículas | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Usado para configurar o atraso do laser quando o módulo de classificação é aberto. |
| BD FACS Aria Citômetro de fluxo de fusão | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Fluido de bainha | BD Biosciences | 342003 | Usado como fluido de bainha para experimentos de análise e classificação no BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS& T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Usado para configuração de instrumentos, dependendo do tamanho do bico. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Controle de isotipo | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotipo |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Controle de isotipo | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotipo |
| BD Pharmingen Solução DAPI | BD Biosciences | 564907 | DAPI Solução estoque de 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Controle de isotipo | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotipo |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Controle de | isotipo BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotipo |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotipo |
| BD Pharmingen Purificado Anti-Vimentina | de Camundongo BD Biosciences | 550513 | |
| Albumina de soro bovino | Hi-Media | TC548-5G | |
| Cristal violeta | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS usado para trabalho de cultura e manutenção. |
| Etanol | --- | --- | Usado para esterilização geral. |
| Soro Fetal Bovino | Gibco da ThermoFisher | 10270-106 | |
| Anticorpo Secundário de IgnG (H+L) Anti-Adsorvido Cruzado para Cabra Anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco por ThermoFisher | 10829018 | Meio basal para hESCs indiferenciados, usado na preparação de meios de cultura |
| L-Glutamina 200mM (100x) | Gibco por ThermoFisher | 25030-081 | |
| Metanol, para Biologia Molecular | Hi-Media | MB113 | |
| Óleo vermelho O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldeído | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicilina Estreptomicina (100x) | Gibco da ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Faloidina (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Nitrato de Prata | HiMedia | MB156-25G | |
| Tiossulfato de Sódio pentahidratado | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescente Particles, 3.0 - 3.4 µ m | BD Biosciences | 556291 | |
| Tampão de coloração | Preparado em MIRM | ---- | Foi preparado usando 2% de FBS em PBS |
| StemPro Adipogenesis Diferenciação Basal Media | Gibco da ThermoFisher | A10410-01 | Meio basal para meio adipogênico |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Mídia de indução para mídia adipogênica |
| Suplemento de Condrogênese StemPro | Gibco da ThermoFisher | A10064-01 | Mídia de indução para mídia condrogênica |
| Suplemento de Osteogênese StemPro | Gibco por ThermoFisher | A10066-01 | Meios de indução para meios osteoogênicos |
| StemPro Osteogênese/Condrogênese Diferenciação Meios Basais | Gibco da ThermoFisher | A10069-01 | Meio basal para ambos os meios Ostegênicos e Condrogênicos |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Tripsina - Solução EDTA 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Referências
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
