Method Article

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

DOI:

10.3791/65723

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.

Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os "brilhantes", expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.

As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado genômico e arquitetura metabólica e celular dasCTMs 2,4.

A imunofenotipagem de células tem sido uma aplicação comum da citometria de fluxo para a identificação de células-tronco e foi utilizada pela Sociedade Internacional de Terapia Celular e Gênica (ISCT) em 2006 para prescrever uma lista de critérios mínimos para identificar células como CTMs. Afirmou que, juntamente com a aderência plástica e a capacidade de diferenciação in vitro em três linhagens (osteogênica, condrogênica e adipogênica), ≥95% da população celular deve expressar CD105, CD73, CD90, e essas células não devem ter a expressão (≤2% positiva) de CD34, CD45, CD11b, CD14 e HLA-DR, medida por citometria de fluxo5. Embora as CTMs tenham sido definidas por um conjunto de biomarcadores sob os critérios mínimos do ISCT, suas propriedades imunológicas não puderam ser comparadas com esses biomarcadores e houve uma necessidade de mais além desses critérios para tornar as comparações entre estudos e variações clonais mais fáceis de quantificar2.

Apesar das diretrizes estabelecidas pelo ISCT, uma extensa pesquisa sobre CTMs tem mostrado que existe heterogeneidade nessa população, que pode surgir devido a uma infinidade de fatores, principalmente devido à natureza ubíqua da heterogeneidade que surge entre doadores de CTM6, fontes de tecido7, células individuais dentro de uma população clonal8 e condições de cultura2,9, 10º. A caracterização e purificação dessas células primárias a partir de uma variedade de fontes de tecido para garantir a qualidade e o destino celular são etapas fundamentais em sua produção. A necessidade de compreender as variações apresentadas entre a população requer um método eficiente para resolvê-las em subpopulações que podem ser divididas e coletadas separadamente11. Análises em nível de célula única ajudam a superar os desafios da variação célula-célula, reduzem o ruído biológico proveniente de uma população heterogênea e oferecem a capacidade de investigar e caracterizar células raras12.

Com base na finalidade e nos parâmetros escolhidos, vários métodos podem ser empregados para classificar e enriquecer as populações selecionadas. As técnicas de classificação de células podem incluir métodos de classificação em massa e de célula única. Enquanto a triagem em massa pode enriquecer populações-alvo por meio da classificação celular ativada por fluorescência (MACS)13, fracionamento14 e elutriação 15, a triagem de células únicas pode enriquecer populações mais homogêneas por meio da classificação celular ativada por fluorescência (FACS)11. Uma análise comparativa de cada um desses métodos com seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens é destacada na Tabela 1.

Tabela 1: Análises comparativas de diferentes técnicas: MACS, Fracionamento, Elutriação e FACS, destacando as diferenças em seu princípio e as vantagens e desvantagens da escolha de uma determinada técnica em detrimento de outra. Abreviações: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Classificação celular ativada por fluorescência. Clique aqui para baixar esta tabela.

Desde o advento da técnica, a citometria de fluxo unicelular tem desempenhado um papel importante naenumeração16, detecção e caracterização de uma população celular específica em uma amostra heterogênea17. Hewitt et al., em 2006, lançaram as bases da metodologia de classificação celular automatizada para melhorar o isolamento de pools homogêneos de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs)18. A triagem unicelular enriqueceu a população de hESCs transduzidas por GFP, facilitando o isolamento de clones geneticamente modificados, o que abriu uma nova dimensão na pesquisa clínica. Para melhorar a eficiência da classificação, duas abordagens foram geralmente adotadas; Ou os meios de coleta das populações triadas são modificados para sustentar a viabilidade e proliferação de células pós-trificadas19 ou o algoritmo/software de classificação celular é modificado adequadamente12.

Com o avanço da tecnologia, citômetros de fluxo comerciais e classificadores de células foram capazes de ajudar a enfrentar desafios que foram enfrentados ao classificar assepticamente populações de células frágeis e raras, especialmente células-tronco de diferentes origens. Um dos grandes desafios dos biólogos de células-tronco tem sido o isolamento clonal de células-tronco pluripotentes humanas seguindo protocolos de transfecção exigidos em estudos de edição gênica19. Isso foi resolvido classificando células únicas em placas de 96 poços que foram revestidas com fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), juntamente com suplementos e inibidores comerciais de pequenas moléculas de ROCK. No entanto, as estratégias de isolamento celular poderiam ser amplamente refinadas com o uso da classificação por índice, uma característica do algoritmo de classificação que identifica o imunofenótipo de células individuais classificadas12. Essa modalidade refinada na classificação de células únicas ajudou não apenas a aumentar a eficiência da classificação de células-tronco, especialmente no que diz respeito a populações raras de células-tronco hematopoéticas, mas também ligou eficientemente clones de célula única a seus ensaios funcionais a jusante20.

Este artigo enfoca a triagem unicelular de células-tronco imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) para o enriquecimento de subpopulações para estudar suas capacidades de diferenciação funcional. Utilizando a combinação de dois marcadores CTM positivos, CD90 e CD73, e um marcador hematopoiético negativo CD45, as CTMs foram imunofenotipadas e os expressores dim e null foram identificados. Com base em seu imunofenótipo, as subpopulações foram identificadas como CTMs puras, populações positivas simples e duplas negativas. Eles foram classificados usando o modo de classificação unicelular para obter subpopulações puras e enriquecidas para estudos funcionais posteriores para identificar se a expressão diferencial de marcadores era um artefato de condições de cultivo in vitro ou se também tem algum efeito sobre as propriedades funcionais. As células que não eram expressores homogêneos dos "marcadores MSC positivos" foram selecionadas para estudar suas propriedades funcionais.

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Protocol

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Aprovação ética e consentimento para participar: Amostras de polpa dentária decídua esfoliada humana foram recebidas após a obtenção de consentimento informado e aprovação ética completa pelo Departamento Oral e Maxilofacial do Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Liberação Ética Hospitalar, SRGCDS. Em seguida, o isolamento, o cultivo, a manutenção e a aplicação de SHEDs foram aprovados e em conformidade com as diretrizes recomendadas pelo Comitê Institucional para Pesquisa em Células-Tronco (IC-SCR) do Instituto Manipal de Medicina Regenerativa, MAHE - Bengaluru. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

1. Preparação de reagentes e tampões

  1. Para manutenção da cultura
    1. Preparar meios de cultura de células CTM (10%) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-strep) (Tabela 2).
    2. Preparar meios de cultura celular CTM (20%) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, 20% FBS, 1% L-glutamina e 1% Pen-strep (Tabela 2).
    3. Preparar meios neutralizantes usando meio basal para hESCs indiferenciadas, L-glutamina a 1% e antibiótico-antimicótico a 1% (Anti-Anti) (Tabela 2).
  2. Para análise e classificação por citometria de fluxo
    1. Preparar tampão de coloração usando FBS a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    2. Preparar uma solução-mãe de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) adicionando 1 μL em 1 mL de PBS
  3. Para diferenciação linhagem específica de CTMs
    1. Preparar meios de diferenciação para diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica de acordo com a composição descrita na Tabela 3. Conservar as alíquotas preparadas a 4 °C durante a experiência.
    2. Preparar meios sem soro (2% de meio) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, SFB a 2%, L-glutamina a 1% e Pen-strep a 1% (Tabela 2).
TIPO DE MÍDIAFINALIDADE DA MÍDIACOMPOSIÇÃO PARA 50 mL
FBSCaneta-StrepL-GlutaminaMEIO BASAL PARA HESCs indiferenciadas
10% mídiaCultura e manutenção MSC5 mL500 μL500 μL44 mL
20% mídiaEnsaio UFC-F10 mL500 μL500 μL39 mL
Meios com carência de soro (2%)Meios para Controle de Poços em Protocolo de Diferenciação1 mL500 μL500 μL48 mL
Meios neutralizantesMeios para neutralização da suspensão celular após tripsinização-500 μL500 μL49 mL

Tabela 2: Meios de cultura celular para manutenção e ensaios de cultura. Abreviações: CTM = células-tronco mesenquimais; UFC-F = unidade formadora de colônia-fibroblasto.

COMPONENTESMEIOS OSTEOGÊNICOSMEIOS CHONDROGÊNICOSMEIOS ADIPOGÊNICOS
Mídia Basal90 mL90 mL90 mL
Meios de indução10 mL10 mL10 mL
Total Volume100 mL100 mL100 mL

Tabela 3: Meios de diferenciação para diferenciação de trilinhagens de SHEDs.

2. Cultura e manutenção de galpões

  1. Manter as células em meio de cultura MSC a 10% e realizar trocas de meios a cada 2 dias ou conforme necessário.
  2. Tripsinizar células em 95% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA.
  3. Neutralizar as células após tripsinização usando meios neutralizantes.
  4. Centrifugar o tubo a 300 × g durante 6 min à temperatura ambiente para obter um pellet celular.
  5. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de cultura MSC a 10%.
  6. Células de sementes em placas de cultura celular recém-preparadas contendo 10% de meio de cultura MSC para experimentos posteriores ou subcultivo.
    NOTA: A densidade de semeadura ideal para SHEDs é de 0,2 × 10 6 células em uma placa de 100 mm e 0,8 × 10 6 células em um frasco T-75, para obter 1,5 × 10 6 células e 4 × 10 6 células, respectivamente, com 90-100% de confluência.

3. Caracterização das CTMs

  1. Ensaio de crescimento celular a curto prazo
    1. Sementes de 4 × 104 células/poço em triplicata, em placas de 6 poços em meio de cultura MSC a 10%.
    2. Incubar as placas por 7 dias a 37 °C e realizar trocas de meios a cada 2 dias.
    3. Colher as células nos dias 2, 4 e 8 com tratamento com tripsina a 0,25% e lavar com meios de cultura.
    4. Centrifugar as células a 300 g por 6 min à temperatura ambiente e ressuspender o pellet em 1 mL de meio.
    5. Contar as células usando um hemocitômetro e determinar sua viabilidade pelo método de exclusão do azul de tripano.
    6. Calcule a taxa de proliferação usando a equação (1):
      figure-protocol-1(1º)
  2. Ensaio de unidade formadora de colônia-fibroblasto (UFC-F)
    1. Semeando 10.000 células em uma placa de 100 mm e cultivando-as em meios de cultura MSC a 20%.
    2. Incubar as placas por 14 dias a 37 °C e realizar trocas de meios a cada 3 dias.
    3. Após 14 dias, enxaguar as colônias com PBS, fixá-las com corante violeta cristal em metanol e enxaguar novamente com PBS para remover a mancha residual.
    4. Conte e imagine as colônias.
      NOTA: Contar colônias com >50 células. A eficiência de formação de colônias é calculada como números de unidades formadoras de colônias.
  3. Ensaio de imunofluorescência
    1. Semeando as CTMs em placas de 35 mm e deixe-as crescer até 80-90% de confluência.
    2. Retire o meio e enxágue a louça com PBS uma vez.
    3. Fixar as células com 1 ml de paraformaldeído (PFA) a 4%, incubando durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
    4. Após a fixação, lavar os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    5. Adicionar Triton X-100 a 0,3% em PBST (solução de Tween 20 a 0,05% em PBS) para permeabilizar as células. Mantenha-o no balancim por 15 min à temperatura ambiente.
    6. Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    7. Adicionar 3% de albumina de soro bovino (BSA) para bloqueio e mantê-lo no balancim por 1 h à temperatura ambiente.
    8. Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    9. Adicionar 800 μL de diluição 1:500 de anti-vimentina de rato, mantê-lo no balancim durante 1 h à temperatura ambiente e transferir a placa para 4 °C para incubação durante a noite.
    10. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    11. Adicionar 800 μL de diluição 1:1.000 do anticorpo secundário de cabra anti-camundongo IgG (H+L), Alexa Fluor 555, e mantê-lo por 3 h à temperatura ambiente no balancim.
    12. Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    13. Adicione Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL em 1.000 μL de PBS e incube à temperatura ambiente por 60 min no balancim.
    14. Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
    15. Adicionar 700 μL de DAPI mountant e observar as células sob um microscópio.
  4. Diferenciação específica da linhagem
    1. Diferenciação seguindo a cultura 2D
      1. Pegue duas placas de 48 poços e rotule-as como linhagens osteogênicas e adipogênicas, respectivamente.
      2. Semeando 15.000 células/poço em quatro poços de cada placa e cultivando-as em meio de cultura MSC a 10%.
      3. Uma vez que a monocamada de células tenha atingido 90% de confluência, rotule os dois primeiros poços como "Controle" e substitua o meio existente por meios sem soro (2% de meios). Nos dois últimos poços rotulados como 'Teste', adicionar meios de diferenciação de qualquer uma das duas linhagens, adipogênico ou osteogênico. Marque isso como Dia 0.
      4. Substitua suavemente os meios a cada três dias para contornar o peeling e tenha cuidado para evitar contaminação.
      5. Manter essas condições até o vigésimo primeiro dia; em seguida, processo para o experimento de coloração.
    2. Diferenciação seguindo a cultura 3D
      1. Tomar dois tubos de 15 mL para realizar a diferenciação condrogênica usando cultura de pellets 3D.
      2. Transfira 1 × 10 6 células para cada tubo e centrifuga a 300 × g por6 min para formar um pellet. Rotular um tubo como 'Controle' e adicionar 10% de meio de cultura MSC a ele; rotular o outro tubo como "Teste" e adicionar meios de diferenciação condrogênicos. Coloque os tubos cuidadosamente na incubadora com suas tampas frouxamente rosqueadas. Marque isso como Dia 0.
      3. Troque a mídia a cada três dias com cuidado, para não deslocar/desintegrar a pelota durante as trocas de mídia.
      4. Mantenha essas condições até o vigésimo primeiro dia e, em seguida, processe as células para novos experimentos.
  5. Coloração citoquímica específica da linhagem
    1. Para culturas 2D, utilizar as placas de CTMs diferenciadas (teste) e indiferenciadas (controle) (da etapa 3.4.1.5.) para coloração e, primeiro, retirar o meio e lavar duas vezes com PBS. Fixar as células usando PFA 4% por 30 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e lavar uma vez com PBS. Execute a coloração para cada linhagem da seguinte maneira.
      1. Para a linhagem de adipócitos, adicionar solução de permeabilização do kit e incubar a placa por 5 min à temperatura ambiente. Preparar e adicionar 1 mL de solução de trabalho Oil red O e mantê-lo por 10 min. Retire a mancha e faça cinco lavagens com água destilada.
      2. Para a linhagem de osteócitos, adicionar 5% de nitrato de prata recém-preparado (em água destilada) a cada poço e manter a placa sob UV por 1 h. Retire a solução e adicione 2,5% de tiossulfato de sódio para remover a prata não reagida; guarde-o por 5 min. Remova a mancha, lave duas vezes com água destilada e observe as células coradas ao microscópio.
    2. Para culturas 3D, coletar o pellet após o término do período de diferenciação da etapa 3.4.2.3 e obter criossecções do tecido diferenciado na forma do pellet. Deixe as lâminas secarem ao ar e fiquem em temperatura ambiente antes de proceder à coloração.
      1. Para a linhagem de condrócitos, siga as instruções do kit de coloração para adicionar um volume suficiente de solução de lavagem, removê-la, adicionar a solução de fixação e incubar por 30 min. Lave com água destilada, adicione a solução corante e incube por 30 min. Lavar três vezes com ácido clorídrico 0,1 N; Adicione água destilada para neutralizar a acidez. Observe as células coradas sob um microscópio de campo claro.

4. Coloração da superfície celular para imunofenotipagem

NOTA: As placas de cultura celular recomendadas para obter um número ideal de células nas etapas 4.2-4.5 são placas de 100 mm ou frascos T75.

  1. Preparação celular para experimentos de citometria de fluxo
    1. Tripsinizar e coletar as células de uma placa/frasco confluente e centrifugar a 300 × g por 6 min para obter o pellet celular.
    2. Ressuspender o pellet em 1 mL de meio e determinar a contagem de células viáveis usando um hemocitômetro seguindo o método de exclusão do azul de tripano.
    3. Centrifugar novamente a suspensão celular após a contagem e dar mais duas lavagens ao pellet com 1 mL de tampão corante.
    4. Eliminar o sobrenadante e, finalmente, voltar a suspender o pellet num volume adequado do tampão de coloração, dependendo do protocolo (ver passos 4.2 a 4.5).
  2. Elaboração de controles de remuneração
    1. Pegue sete tubos FACS e rotule-os como Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 e APC.
    2. Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1.) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL por tubo para os tubos não corados e DAPI.
    3. Preparar os tubos de coloração única para compensação conforme descrito na Tabela 4.
    4. Vórtice suavemente cada tubo após a preparação e incube no escuro por 30 min.
    5. Após a incubação, administrar duas lavagens adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo, seguidas de breve vórtice e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
    6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão corante e reserve-o até a aquisição.
    7. Para o tubo DAPI, realizar o tratamento de choque térmico incubando-o em banho-maria a 60 °C por 5 min seguido de 15 min no gelo. Adicionar 5 μL de DAPI à suspensão e mantê-la no escuro até a aquisição da corrida.
  3. Preparação de controles de fluorescência menos um (FMO)
    1. Ressuspender o pellet final em tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
    2. Pegue cinco tubos FACS e rotule-os como isotipo CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, isotipo CD73-PerCP Cy5.5 e isotipo CD105-APC.
    3. Preparar a suspensão celular e de anticorpos de acordo com a Tabela 5.
    4. Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    5. Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
    6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão corante e reserve-o até a aquisição.
  4. Preparação de amostras para análise
    1. Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
    2. Pegue dois tubos FACS e rotule-os como tubos mistos 1 e 2.
    3. Preparar a suspensão celular e de anticorpos de acordo com a Tabela 6.
    4. Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    5. Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
    6. Eliminar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 500 μL de tampão corante e separar até a aquisição.
  5. Preparação de amostras para triagem unicelular
    1. Pegue dois tubos FACS, adicione 1mL de FBS e role o tubo até que uma camada uniforme de FBS seja formada no interior de cada tubo. Incubar por 1-2 h enquanto processa a amostra para coloração. Rotule esses tubos como tubos mistos 1 e 2.
    2. Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 2-3 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
    3. Preparar a suspensão de células e anticorpos em tubos mistos 1 e 2 de acordo com a Tabela 7.
    4. Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    5. Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
    6. Eliminar o sobrenadante, voltar a suspender o pellet em 500 μL de tampão corante e reservar. Adicionar 5 μL de DAPI 15 min antes da classificação.
      NOTA: Observe que para experimentos de classificação é recomendada maior densidade celular por tubo.
Tipo de tuboContas Comp Positivas*Contas Comp negativas*CélulasAnticorpos adicionados
Tubo FITC1 gota1 gota–CD90-FITC anti-humano (2 μL)
Tubo V4501 gota1 gota–CD44-V450 anti-humano (2 μL)
Tubo PerCP-Cy 5.51 gota1 gota–Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL)
Tubo de PE1 gota1 gota–CD45-PE anti-humano (2 μL)
Tubo APC1 gota1 gota–CD105-APC anti-humano (2 μL)
Tubo DAPI––50 μL–
Tubo sem manchas––50 μL–
*1 gota= 60 μL de suspensão de contas

Tabela 4: Amostras de controle de compensação. Abreviações: Comp = compensação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.

TIPO DE TUBOANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (2 μL)ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (2 μL)ANTICORPOS ISOTÍPICOS ADICIONADOS (2 μL)VOLUME TOTAL DE ANTICORPOSVOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADOVOLUME DO TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO
Tubo FMO CD90-FITC- Anti-humano CD44-V450CD45-PE anti-humanoIsotipo FITC IgG110 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD73 PerCP Cy 5.5
- Anti-humano CD105-APC
Tubo CD73-PerCP Cy5.5 FMO- Anti-humano CD44-V450CD45-PE anti-humanoIsotipo PerCP Cy 5.5 IgG110 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD90-FITC
- Anti-humano CD105-APC
Tubo FMO CD44-V450- Anti-humano CD90-FITCCD45-PE anti-humanoIsotipo V450 IgG110 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5
- Anti-humano CD105-APC
Tubo FMO CD105-APC- Anti-humano CD44-V450CD45-PE anti-humanoIsotipo IgG1 APC10 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD90-FITC
- Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5
Tubo FMO CD45-PE- Anti-humano CD44-V450-Isotipo PE IgG110 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD90-FITC
- Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5
- Anti-humano CD105-APC

Tabela 5: Amostras de controle FMO. Abreviaturas: FMO = fluorescência menos um; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.

TIPO DE TUBOANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (2 μL)ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (2 μL)VOLUME TOTAL DE ANTICORPOSVOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADOVOLUME DO TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO
Tubo misto 1- Anti-humano CD44-V450CD45-PE anti-humano10 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD90-FITC
- Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5
- Anti-humano CD105-APC
Tubo misto 2- Anti-humano CD44-V450CD45-PE anti-humano10 μL50 μL40 μL
- Anti-humano CD90-FITC
- Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5
- Anti-humano CD105-APC

Tabela 6: Tubos amostrais para imunofenotipagem multicolor de SHEDs. Abreviações: SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos; PE = ficoeritrina.

TIPO DE TUBOANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (3 μL)ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (3 μL)VOLUME TOTAL DE ANTICORPOSVOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADOVOLUME DE TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO
Tubo misto 1- Anti-humano CD90-FITCCD45-PE anti-humano9 μL50 μL41 μL
- Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5
Tubo misto 2- Anti-humano CD90-FITCCD45-PE anti-humano9 μL50 μL41 μL
- Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5

Tabela 7: Tubos de reação de classificação unicelular. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.

5. Classificação de célula única

  1. Preparação do classificador de células
    1. Instale um bocal de 100 μm no classificador.
      NOTA: O bocal apropriado tem pelo menos cinco vezes o diâmetro da partícula a ser classificada. O fluido da bainha a ser usado para a triagem precisa ser decidido com base no tipo de amostra e na sensibilidade do experimento; Para este experimento, foi utilizado fluido de bainha patenteado.
    2. Realize a verificação diária da qualidade do instrumento (CQ) e configure o classificador para o experimento. Consulte o manual do instrumento para obter um guia detalhado da configuração do instrumento.
  2. Montagem da matriz de remuneração
    1. Defina a matriz de compensação usando tubos de compensação de mancha única da etapa 4.2.
    2. No software proprietário, selecione Experimentar na barra de ferramentas e clique em Configuração de compensação. Abra Criar controles de compensação.
    3. Confira os marcadores e confirme. Um novo espécime é adicionado chamado "Compensação" sob o qual novos tubos chamados de controles de marcador são adicionados automaticamente pelo software.
    4. Selecione o tubo sem manchas e execute-o, para gravar 5.000 eventos. Arraste o portão para a população de células e aplique-o a todos os controles de compensação. Isto é para definir as tensões e porta negativa para cada parâmetro fluorescente.
    5. Da mesma forma, carregue os tubos de compensação de mancha única separadamente e registre e salve os dados. Selecione o portão que demarca a população de interesse e aplique a todos os controles de remuneração. Isso é para definir as portas positivas para cada parâmetro fluorescente.
    6. Selecione Experimentar na barra de ferramentas e clique em Calcular valores de compensação | vincular e salvar.
      NOTA: Uma vez que a matriz auto-comp é gerada usando o software, os parâmetros de tensão dos fluorocromos não podem ser alterados para nenhum dos canais nos tubos mistos.
  3. Aquisição de dados
    1. Registre 10.000 células em cada tubo a partir das etapas 4.3. e 4.4 coletar dados para análise do imunofenótipo das células.
  4. Preparação dos dispositivos de coleta
    1. Dependendo da finalidade das populações de células classificadas, escolha entre placas de 6 poços, 24 poços, 48 poços ou 96 poços.
    2. Revestir os poços com 200-500 μL de FBS e manter as placas intactas por 2 h.
    3. Após 2 h, remover o FBS residual e adicionar 200-500 μL de meio de cultura MSC a 10%.
  5. Classificação de células no modo de classificação de célula única
    1. Execute o tubo misto 1 (a partir da etapa 4.5) e registre 10.000 eventos para definir as portas sobre a população de interesse a ser classificada, usando a estratégia de fechamento apropriada.
    2. Carregue uma placa de coleta e defina números de célula de destino entre 2.500 e 5.000 células/poço e selecione a máscara de pureza de classificação de célula única.
    3. Coletar as populações classificadas no dispositivo de coleta e mantê-las no gelo até o final do experimento de triagem.
    4. Uma vez feito, transferir as placas para a incubadora de 5% CO2 para manter as culturas a 37 °C.
      NOTA: Após a aquisição, os arquivos de dados brutos foram exportados como formato de arquivo .fcs (v.3.0. em diante). Os relatórios de classificação gerados após cada experimento registraram o número de eventos/células classificados por poço atribuído e indicaram o número de conflitos que foram abortados.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os SHEDs foram caracterizados com ensaios de imunofluorescência padrão mostrando a expressão de vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e núcleos corados com DAPI (Figura 1A). Para estimar suas capacidades proliferativas e formadoras de colônias, ensaios padrão de crescimento celular de curta duração foram realizados. Um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação do dia 2 para o dia 8 foi mostrado na

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traumáticas22. O protocol...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflito de interesses referente à publicação deste artigo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mancha Azul AlcianHiMediaCCK029-1KT
Antibiótico-Antimicótico (100x) Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Controle Negativo (BSA) Compensação Plus (7.5 µ m) Conjunto de PartículasBD Biosciences560497
BD FACS Accudrop Beads BD Biosciences345249Usado para configurar o atraso do laser quando o módulo de classificação é aberto.
BD FACS Aria Citômetro de fluxo de fusãoBD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS Fluido de bainhaBD Biosciences342003Usado como fluido de bainha para experimentos de análise e classificação no BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& T Research BeadsBD Biosciences655050Usado para configuração de instrumentos, dependendo do tamanho do bico.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44BD Biosciences561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Controle de isotipoBD Biosciences560374CD44-V450 isotipo
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Controle de isotipoBD Biosciences555751CD105-APC isotipo
BD Pharmingen Solução DAPIBD Biosciences564907DAPI Solução estoque de 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Controle de isotipoBD Biosciences555748CD90-FITC isotipo
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Controle deisotipo BD Biosciences555749CD45-PE isotipo
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Controle de IsotipoBD Biosciences550795CD73-PerCP-Cy 5.5 isotipo
BD Pharmingen Purificado Anti-Vimentinade Camundongo BD Biosciences550513
Albumina de soro bovinoHi-Media TC548-5G
Cristal violetaNice chemical pvt ltd C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-aldrich   D5652-50LdPBS usado para trabalho de cultura e manutenção. 
Etanol ------Usado para esterilização geral.
Soro Fetal BovinoGibco da ThermoFisher 10270-106
Anticorpo Secundário de IgnG (H+L) Anti-Adsorvido Cruzado para Cabra Anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco por ThermoFisher 10829018Meio basal para hESCs indiferenciados, usado na preparação de meios de cultura
L-Glutamina 200mM (100x)Gibco por ThermoFisher25030-081
Metanol, para Biologia Molecular Hi-Media MB113
Óleo vermelho OHiMedia CCK013-1KT
Paraformaldeído loba chemie30525-89-4
Penicilina Estreptomicina (100x)Gibco da ThermoFisher 15140- 122
Faloidina (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)Invitrogen R37110
Nitrato de PrataHiMedia MB156-25G
Tiossulfato de Sódio pentahidratadoChemport10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescente Particles, 3.0 - 3.4 µ mBD Biosciences556291
Tampão de coloração Preparado em MIRM ----Foi preparado usando 2% de FBS em PBS 
StemPro Adipogenesis Diferenciação Basal Media Gibco da ThermoFisher A10410-01Meio basal para meio adipogênico
StemPro Adipogenesis SupplementGibco by ThermoFisher A10065-01Mídia de indução para mídia adipogênica
Suplemento de Condrogênese StemProGibco da ThermoFisher A10064-01Mídia de indução para mídia condrogênica
Suplemento de Osteogênese StemProGibco por ThermoFisher A10066-01Meios de indução para meios osteoogênicos
StemPro Osteogênese/Condrogênese Diferenciação Meios Basais Gibco da ThermoFisher A10069-01Meio basal para ambos os meios Ostegênicos e Condrogênicos
Triton-X-100Hi-Media MB031
Trypan Blue Gibco by life technologies 15250-061
Tripsina - Solução EDTA 1xHi-media TCL049
Tween-20 MERCK 9005-64-5

References

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