Artigo de método

Criopreservação e Avaliação Bioenergética de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano

DOI:

10.3791/65730

⸱

20 de outubro de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.

Introdução

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As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como viabilidade e pureza do isolamento são os requisitos básicos para seu manuseio e são adicionalmente influenciados por fatores ambientais como o tempo de coleta, o nível de melatonina, se o indivíduo está em jejum, entre outros 3,4.

Com base em estudos sobre bioenergética de CMSP, descrevemos aqui um método para o isolamento, criopreserva e cultivo de CMSP que também é adequado para outros métodos. Enquanto a biópsia muscular é considerada o padrão-ouro para o metabolismo energético mitocondrial5, o exame das células sanguíneas é um procedimento rápido e minimamente invasivo. Além disso, cada vez mais estudos sugerem que as alterações da função mitocondrial no envelhecimento e na doença de Alzheimer (DA) ocorrem não só no cérebro, mas também na periferia6,7,8,9,10. O método também permite a investigação de outras condições e doenças, incluindo diabetes mellitus e obesidade11,12,13. Padrões de expressão gênica em pacientes com esclerose múltipla podem ser analisados, assim como a função imune e suas influências em geral 14,15,16.

As CMSP geralmente dependem da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para gerar adenosina trifosfato (ATP)17,18. Portanto, os PBMCs cobrem uma ampla gama de aplicações como substitutos. Em relatos anteriores, o metabolismo energético das CMSP tem sido utilizado para tratar disfunções orgânicas, como na insuficiência cardíaca precoce19, choque séptico20 ou diferenças associadas ao sexo4 na função mitocondrial. Um método generalizado para isolamento criopreservacional e cultivo de CMSP teria vantagens na comparabilidade dos resultados obtidos em diferentes institutos. Há grande variação nos protocolos para cadaetapa21,22, o objetivo desse método é fornecer uma diretriz para medidas bioenergéticas em CMSP.

Neste artigo descrevemos um método para mensuração de parâmetros bioenergéticos em CMSP. Explicamos os métodos para isolar, criopinar e medir a bioenergética de CMSP do sangue humano. Este método pode ser usado para determinar parâmetros bioenergéticos em pacientes e avaliá-los em um contexto clínico. Para aplicar essas medidas, os pesquisadores precisam ter acesso a uma população de pacientes a partir da qual amostras de sangue fresco podem ser obtidas.

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Protocolo

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Todos os protocolos descritos neste manuscrito para coleta, isolamento e análise de sangue foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Giessen, Alemanha. Obteve-se o consentimento dos pacientes para inclusão de suas amostras no estudo. Todas as etapas de isolamento e cultura celular são realizadas sob um gabinete de segurança biológica.

1. Punção venosa

  1. Preparar todo o equipamento necessário para a coleta de sangue, incluindo spray de desinfecção, swab estéril, cânula de coleta de sangue com tubo de 80 mm e multi-adaptador, torniquete/manguito de pressão arterial, Monovette 9 mL de lítio-heparina.
    NOTA: EDTA como um anticoagulante também é eficaz.
  2. Coletar sangue da veia do braço mais apropriada, geralmente vena mediana cubiti ou veia cefálica.
  3. Aplicar um torniquete/manguito de pressão arterial com leve pressão, em torno de 80 mm/Hg.
  4. Desinfete luvas e local de punção com spray desinfetante contendo álcool. Deixe o local de punção desinfetado secar ao ar.
  5. As veias se projetam devido à pressão do manguito de pressão. Inserir a agulha (diâmetro da cânula (exterior) 21G / 0,8 mm, comprimento 19 mm) em um ângulo de 15°-20° da veia tentando evitar trauma e minimizando a sondagem.
  6. Tome sangue com sistema apropriado, 4 tubos contendo 9 mL de sangue (mais de 7-8 tubos são problemáticos para um experimentador isolar corretamente).
  7. Após a coleta de sangue, colocar os tubos de coleta no escuro por 5 min para garantir uma anticoagulação uniforme.

2. Isolamento do PBMC

  1. Prepare todas as soluções necessárias conforme descrito abaixo.
  2. Levar a solução salina balanceada de Dulbecco (DPBS; concentração 1x) e o meio de isolamento de linfócitos (1,077 g/mL) à temperatura ambiente (20-25 °C).
  3. Preparar soro fetal bovino (SFB) à temperatura ambiente e manter um tubo cônico estéril de 50 mL com FBS sobre gelo. Para cada amostra de sangue, são necessários 2 mL de FBS.
  4. Conservar o recipiente de congelação a 4 °C e pré-arrefecer os criotubos a 4 °C.
  5. Meio de cultura de células aquecidas a 37 °C, o meio consiste de RPMI 1640 com 50 mL de FBS e penicilina 50 U/mL estreptomicina 50 U/mL. Esta solução pode ser armazenada a 3 °C por até 2 meses.
  6. Adicionar 8 mL de DPBS em tubos cônicos estéreis de 50 mL. Adicionar 15 mL de meio de isolamento de linfócitos em tubo cônico estéril de 50 mL (O meio é sensível à luz, adicione-o antes de iniciar o isolamento).
  7. Adicione 8 ml de sangue a 8 ml de DPBS e, misture cuidadosamente com uma pipeta de plástico Pasteur de 3 ml.
  8. Coloque o sangue/DPBS misturando suavemente com uma pipeta plástica de Pasteur de 3 mL sobre o meio de isolamento de linfócitos. Para aplicar a primeira camada no meio, incline o tubo 20°-30°, o que resultará em menor penetração da mistura sangue-PBS na camada média.
  9. Coloque cuidadosamente a mistura sangue-PBS sobre a parede lateral do tubo sobre o meio de isolamento de linfócitos. Use uma velocidade constante para manter o fluxo sanguíneo constante.
  10. Na próxima etapa, traga o tubo lentamente para uma posição vertical, o sangue restante é cuidadosamente colocado sobre a parede lateral do tubo na camada de sangue.
  11. Centrifugar por 10 min a 1000 x g à temperatura ambiente em uma centrífuga com rotor de caçamba oscilante com freios desligados. Após a centrifugação, a mistura sangue/CMSP é separada em quatro camadas. A camada superior é composta por plasma e plaquetas, a segunda camada é a camada PBMC, seguida por uma camada média de isolamento de linfócitos e, finalmente, eritrócitos e granulócitos na camada inferior. As diferentes camadas são exibidas na Figura 1.
  12. Retire 2/3 da camada de plasma com uma pipeta plástica Pasteur.
  13. Com pipeta de 1 mL, colete as CMSP na camada média de isolamento de linfócitos, tomando cuidado para não obter nenhum meio na amostra.
  14. Coloque a ponta 1 mm acima da camada PBMC. A camada de CMSP não deve ser puncionada, caso contrário o meio fluirá sobre as células. A sucção da pipeta puxa os PBMCs até este ponto para que eles possam ser coletados várias vezes neste ponto.
    NOTA: Para maximizar o número de PBMCs coletados, no final do procedimento procure o restante na superfície e tente coletar as células lá também. Para estabilizar o procedimento, o tubo pode ser colocado em uma superfície.
  15. Transfira passo a CMSP para um novo tubo de 50 mL até que a camada seja completamente colhida. Adicione DPBS até a marca de 25 mL, lave o meio de isolamento de linfócitos e outros resíduos.
  16. Centrifugar por 10 min a 100 x g à temperatura ambiente com os freios ligados. Remova o sobrenadante com uma bomba de vácuo ou similar, tome cuidado para não danificar o pellet celular.
  17. Ressuspender o pellet em 1 mL de DPBS e somar o DPBS até a marca de 25 mL. Repita a lavagem mais uma vez e, em seguida, ressuspenda em meio apropriado para os próximos passos.

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Figura 1: Representação esquemática de uma centrifugação por gradiente de densidade para ilustrar as diferentes camadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Criopreservação

  1. Resfriar um recipiente de congelamento a 4 °C, resfriar o FBS no gelo.
  2. Ressuspenda a pastilha de PBMC em 1 mL de FBS com uma pipeta de 1 mL, a FBS deve estar à temperatura ambiente.
  3. Misture DMSO com FBS pré-resfriado em gelo 1:5, concentração final 20% DMSO em seguida, coloque a mistura FBS: DMSO de volta no gelo. Prepare sempre a solução fresca.
  4. Transfira a suspensão de células PBMC em FBS para criotubos de 2 mL bem marcados. Use um criotubo por tubo de coleta. Ajuste o número de células entre 1 x 107 e 5 x 107 por mL. Use um contador de células automatizado para determinar a contagem e a viabilidade de células.
  5. Adicione 1 mL de FBS: DMSO mistura gota a gota com uma pipeta de 1 mL, aproximadamente 1-2 gotas por s, no tubo. A adição dropwise leva a uma mistura contínua e consistente.
  6. Coloque os tubos no recipiente de congelamento pré-resfriado. Coloque o recipiente de congelação num congelador a -80 °C durante 24 horas. O recipiente de congelamento fornece um resfriamento controlado de -1 °C por minuto.
  7. Retire os tubos do congelador a -80 °C. Após a remoção do congelador armazenar os tubos na fase gasosa de nitrogênio líquido. Documente o local de cada amostra.

4. Descongelamento

  1. Preparar todas as soluções necessárias: Meio de cultura celular RPMI 1640 com 50 mL de SFB e penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Esta solução pode ser armazenada a 3°C por até 2 meses.
  2. Meio de cultura celular pré-aquecido a 37 °C. Adicionar 3 mL de meio de cultura celular pré-aquecido em tubos cônicos estéreis de 50 mL.
  3. Remova a amostra do tanque de nitrogênio líquido. Descongelar as amostras em banho-maria a 37 °C por aproximadamente 3,5 min, retirar do banho-maria assim que o último gelo estiver derretendo. Um pedaço de gelo do tamanho de uma cabeça de alfinete ainda deve ser visível no tubo.
    NOTA: DMSO é prejudicial para PBMCs trabalhar o mais rápido possível.
  4. Remova a mistura de célula:FBS:DMSO com uma pipeta de 1 mL do criotubo. Misturar as amostras de PBMC com o meio de cultura celular nos tubos de 50 mL preparados. Lave os tubos com 5 mL de meio de cultura em três etapas de 2 mL, 2 mL e 1 mL.
  5. Transfira o meio para os tubos. Isso é realizado para transferir possíveis resíduos celulares. Centrifugar durante 10 min a 100 x g à temperatura ambiente.
  6. Eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio adequado para utilização planeada. As células estão prontas para experimentos subsequentes.
    NOTA: No entanto, com testes funcionais em células frescas ou congeladas, um período de repouso em uma incubadora (normalmente durante a noite) é frequentemente recomendado após o isolamento de linfócitos com base em meio de isolamento ou descongelamento celular.

5. Cultura celular

  1. Após o isolamento ou descongelamento das células de cultura durante a noite a 37 °C em 5% CO2/95% ar.
  2. Ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI suplementado com SFB a 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL. Para uso posterior há muitas possibilidades, tratar as células conforme necessário para os ensaios.
  3. Para armazenamento geral utilizar placas de cultura celular estéreis de 6 poços e células de colheita após o período de repouso. Transfira 1 mL de suspensão celular com uma pipeta de 1 mL para um poço e adicione 4 mL de meio de cultura celular.
    NOTA: A quantidade de CMSP isoladas varia muito entre os indivíduos, um poço com 5 mL de meio de cultura celular é suficiente para cada 8 mL de sangue isolado. No entanto, ao isolar PBMCs de buffy coats, a quantidade de PBMCs é significativamente maior do que em amostras de sangue total e, portanto, as células devem ser divididas em vários poços.
  4. Deixar as células descansarem 24 h em atmosfera umidificada suplementada com 5% de CO2 a 37 °C. Esta incubação é realizada para células recém-isoladas, bem como para células criopreservadas.

6. Ensaio de ATP

  1. Ressuspender CMSP descongeladas em 1 mL de meio RPMI suplementado com SFB a 10%, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 U/mL.
  2. Pegue uma amostra e determine a contagem de células e, em seguida, execute uma discriminação de mortos-vivos com azul de tripano. Retirar 10 μL das células ressuspensas e misturar com meio de cultura celular de 90 μL. Em seguida, tome 10 μL e misture com 10 μL de azul de tripano. Coloque as células em uma câmara de contagem de células ou em um contador automático de células e determine o número de células vivas/mortas.
  3. Placa de 100 μL de células a uma densidade de 1 x 105 células/100 μL por poço em uma placa de poliestireno branco de 96 poços.
  4. Deixar as células descansarem durante 24 h numa atmosfera humidificada suplementada com 5% de CO2 a 37 °C.
  5. Determine as concentrações de ATP com um ensaio de ATP.
    1. Use a emissão de luz que ocorre quando o ATP é combinado com luciferina. A luz emitida pode ser avaliada com um leitor de placas. Retire as placas para a incubadora arrefecer até à temperatura ambiente durante 15 minutos. Lise as células e deixe-as por 5 min. Em seguida, aplique o reagente de monitoramento nas células e meça de acordo com as instruções do fabricante. Um padrão interno é usado para determinar o nível de ATP.

7. Respirometria de alta resolução

  1. Ligue o oxígrafo de alta resolução e deixe esquentar por 30 min.
  2. Tratar as células de acordo com um protocolo descrito na Figura 1. Prepare todos os estoques necessários, conforme Tabela 1.
  3. Pipetar 2,1 mL de tampão respiratório (Tabela 1) em ambas as câmaras oxigráficas de alta resolução e agitar o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente nas câmaras (750 rpm) a 37 °C por 30 min até obter um sinal estável de fluxo de oxigênio do sensor polarográfico de oxigênio.
    NOTA: Nas câmaras do oxígrafo, o consumo de oxigênio em tempo real (fluxo) e a saturação de oxigênio da câmara são medidos com o auxílio de eletrodos polarográficos de oxigênio. A calibração de fundo deve ser realizada para evitar ruídos de fundo e garantir resultados confiáveis.
  4. Realizar calibração a ar do sensor polarográfico de oxigênio de acordo com os protocolos do fabricante23.
  5. Ressuspender CMSP isoladas em 1 mL de meio de respiração mitocondrial (MIR05, a composição é mostrada na Tabela 1) e diluir para 8 x 106 células/mL.
  6. Após a calibração do ar, aspirar o meio respiratório da câmara oxigráfica e adicionar 2,1 mL de suspensão celular em cada camber do respirômetro. Se necessário, durante a medição, reoxigenar as câmaras (ver Abrir no ponto h na Figura 2), a saturação de oxigênio das câmaras não deve cair abaixo de 100 μM.
  7. Feche as câmaras inserindo as rolhas, as câmaras são projetadas para conter 2,0 mL de volume. Aspirar a suspensão de células emergentes.
  8. Misture continuamente a suspensão celular a 37 °C com um agitador magnético (750 rpm) localizado na câmara. Aguarde cerca de 20 minutos até que um sinal estável seja obtido. Determinar a respiração endógena (a) na Figura 2).
  9. Para determinar as diferentes atividades complexas da cadeia respiratória, injetar os substratos e inibidores da respiração mitocondrial através das portas de injeção de titânio das rolhas. Use a seguinte concentração final na câmara.
  10. Para romper as membranas celulares, adicionar 5 μL de digitonina 8,1 mM, através da porta de injeção de titânio da rolha da câmara, para remover substratos virgens (b) na Figura 2 , enquanto as membranas mitocondriais permanecem intactas.
  11. Adicionar substratos 2 M glutamato e 800 mM malato através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min.
    NOTA: Também é possível usar substratos adicionais como o piruvato.
  12. Adicionar 8 μL de difosfato de adenosina (ADP) 500 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (d) na Figura 2.
  13. Adicionar 20 μL de succinato de 1 M através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até se obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min(e) na Figura 2.
  14. Titular 1 M de cianeto de carbonila p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) gradualmente a 0,5 μL até ao ponto em que não ocorra qualquer aumento adicional. Aguarde 2-4 min até que o sinal se estabilize (f) na Figura 2. Quando não houver mais aumento na respiração, continue com o próximo passo.
    CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear o FCCP, pois ele oferece riscos à saúde humana.
  15. Adicionar 5 μL de rotenona 0,1 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (g) na Figura 2.
    CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a rotenona, pois ela oferece riscos à saúde humana.
  16. Adicionar 1 μL de oligomicina 4 mg/mL através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min (h) na Figura 2.
    CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear oligomicina, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana.
  17. Adicionar 1 μL de antimicina A 5 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registar a respiração até se obter um sinal estável. O sinal estabiliza após 2-4 min (i) na Figura 2.
    CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a antimicina A, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana.
  18. Ao avaliar a corrida para excluir o consumo de oxigênio de enzimas não envolvidas na fosforilação oxidativa, subtraia os valores de antimicina A de todos os outros valores medidos.
  19. Adicionar 200 mM N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina dicloridrato (TMPD; doador de elétrons) e 800 mM ascorbato para manter a TMPD em um estado reduzido. Injetar os substratos através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal estabiliza após 2-4 min (j) na Figura 2.
  20. A TMPD está sujeita à autooxidação, portanto, subtraia o consumo de oxigênio resultante do valor medido no Complexo IV.
  21. Adicionar NaN3 ≥ 100 mM através da porta de injeção da rolha da câmara e registrar a respiração até que um sinal estável seja alcançado. O sinal se estabiliza após 2-4 min para inibir a atividade do complexo IV, restando apenas a auto-oxidação da TMPD.
    CUIDADO: Tenha cuidado ao manusear a azida sódica, pois é um veneno que oferece riscos à saúde humana.

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Figura 2: Curso esquemático do fluxo O2 . O curso esquemático do fluxo de oxigênio é mostrado. A curva é dividida nas diferentes fases após a adição de inibidores e substratos de a-k. a: respiração endógena; b: células permeabilizadas; c: respiração do complexo I desacoplado; d: respiração acoplada ao complexo I; e: OXFOS ; f: atividade máxima não acoplada de IC e CII; g: respiração desacoplado do complexo II; h: respiração de vazamento; i: respiração residual; j: Respiração desacoplado do CIV(U) e autooxidação da TMPD; k: autooxidação da TMPD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Atividade da citrato sintase

  1. Meça a atividade da citrato sintase como um parâmetro separado e use-o para normalizar as medidas do oxígrafo de alta resolução.
  2. Ressuspender CMSP isoladas em 1 mL de meio de respiração mitocondrial (MIR05) e diluir para 8 x 106 células/mL.
  3. Congelar em azoto líquido e armazenar a -80 °C até à realização de experiências ou para medir células frescas.
  4. Preparar todas as soluções necessárias: tampão 0,1 M de trietanolamina HCl pH 8,0, tampão Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM Oxacetato em tampão de HCl trietanolamina 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM em tampão Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, acetil-CoA 12,2 mM em duplo destilado H2O.
  5. Preparar meio de reacção (Quadro 1) contendo 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobezoico) (DTNB; 0,1 mM), acetilcoenzima A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolamina HCl (5 mM) e Tris HCl (0,1 M).
  6. Preparar o reagente de partida (quadro 1) com oxaloacetato 0,5 mM dissolvido em H2O bidestilado.
  7. Descongele as amostras no gelo, pois a citrato sintase é instável se descongelada muito rapidamente.
  8. Adicionar 40 μL das amostras a uma placa de 96 poços sobre gelo antes de adicionar 110 μL de meio de reação com uma multipipeta.
  9. Meio de reacção quente e amostra numa incubadora a 30 °C durante 5 min. Reagente de arranque morno em banho-maria a 30 °C durante 5 min.
  10. Adicionar 50 μL do reagente de partida com uma multipipeta a cada poço. Meça a absorbância a 30 °C a um comprimento de onda de 412 nm durante 20 minutos através de um leitor de placas.

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Resultados

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Viabilidade e número de células
Para obter sucesso no isolamento e criopreservação, a contagem e a viabilidade celular devem ser as mais altas possíveis. Antes e depois da criopreservação, as células são contadas, e sua viabilidade é determinada para garantir a saúde e a qualidade das células. A Figura 3 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação, a contagem de células e a viabilidade dificilmente diferem. Isso indica o isolamento e a preserva...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenergética. Com este...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 M Tampão Trietanolamina-HCl (pH = 8,0)Auto-preparado-0,5
M Tampão Trietanolamina-HClAuto-preparado-1,0
M Tampão Tris-HCl (pH = 8,1)Auto-preparado-1,01
mM DTBBAuto-preparado-10
% Triton X-100Auto-preparado-10
mM OxalacetatAuto-preparado-14
– 20 G agulhas de coleta de sangue estéreis Multi Adaptador Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37% HClCarl Roth GmbH & Co. KG-70
% Etanol (EtOH)Auto-preparado-Acetil-CoA
Pancreac ApplichemA3753
ADPSigma-AldrichA5285
Toalhetescom álcool ( Álcool isopropílico 70%)
Antimicina ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)Com MilliQ Academic (self-made)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Solução de SeparaçãoBiochrom6115
Gabinete de segurança biológica MSC AdvantageThermo Fisher Scientific Inc.
Carbonilcianido-p-trifluorometoxi-fenilhidrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Contador de células TC20 Contador de células automatizadoCentrífuga Bio-Rad
Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
Contagem de lâminas, câmara dupla para contador de célulasBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninSigma-Aldrich37008
Dimetilsulfoxid (DMSO)Merck102952
Spray de desinfecção Luvas
descartáveis látex, borracha ou vinil.
Distrips (12,5 ml) DistriTipsGilsonF164150
Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (DPBS; 10x)Gibco (Thermo Scientific)15217168
Etanol (EtOH 100%)Carl ROTH GmbH & Co. KG9065.3
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF9665
Frezer (-80° C)Thermo Fisher Scientific Inc.
GlutamateSigma-AldrichG1626
 
Incubadora Midi 40 CO2Thermo Fisher Scientific Inc.
Seringa de injeçãoHamilton
MalatoSigma-AldrichM-1000
MIR05Auto-preparado-Mr
. Frosty Recipiente de congelamentoThermo Fisher Scientific Inc.
Multireader CLARIOstarBMG Labtech
Localizador de tanque de nitrogênio 6 plusThermo Fisher Scientific Inc.
OligomicinaSigma-AldrichO4876
OxalacetatoSigma-Aldrich-Oxygraph-2k
Orobororus Instruments
Penicilina-EstreptomicinaPAA15140122
Pipetas Performance Pipettor 10 μ L, 100 μ L, 1000 μ LVWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)Gibco (Thermo Scientific)11530586
RotenonaSigma-AldrichR8875
SacaroseCarl ROTH GmbH & Co. KG9286.2
Azida sódicaSigma-AldrichS2002
SuccinatoSigma-AldrichS2378
Tetrametilfenilendiamin (TMPD)Sigma-AldrichT3134
Torniquete/ Manguito
Tris(hidroximetil)amino-metanoSigma-Aldrich108382
Triton X-100Sigma-Aldrich108643
TrypanblauBiochromT6146
Bomba de vácuoVaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
Banho-maria WNB22Memmert GmbH & Co. KG
Suporte/adaptador 10110051de pressão arterial

Referências

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