Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Criopreservação e Avaliação Bioenergética de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.
Introdução
As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como vi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os protocolos descritos neste manuscrito para coleta, isolamento e análise de sangue foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Giessen, Alemanha. Obteve-se o consentimento dos pacientes para inclusão de suas amostras no estudo. Todas as etapas de isolamento e cultura celular são realizadas sob um gabinete de segurança biológica.
1. Punção venosa
- Preparar todo o equipamento necessário para a coleta de sangue, incluindo spray de desinfecção, swab estéril, cânula de coleta de sangue com tubo de 80 mm e multi-adaptador, torniquete/manguito de pressão arterial, Monovette 9 mL....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Viabilidade e número de células
Para obter sucesso no isolamento e criopreservação, a contagem e a viabilidade celular devem ser as mais altas possíveis. Antes e depois da criopreservação, as células são contadas, e sua viabilidade é determinada para garantir a saúde e a qualidade das células. A Figura 3 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação, a contagem de células e a viabilidade dificilmente diferem. Isso indica o isolamento e a preserva.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenergética. Com este.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampão Trietanolamina-HCl (pH = 8,0) | Auto-preparado-0,5 | ||
| M Tampão Trietanolamina-HCl | Auto-preparado-1,0 | ||
| M Tampão Tris-HCl (pH = 8,1) | Auto-preparado-1,01 | ||
| mM DTBB | Auto-preparado-10 | ||
| % Triton X-100 | Auto-preparado-10 | ||
| mM Oxalacetat | Auto-preparado-14 | ||
| – 20 G agulhas de coleta de sangue estéreis Multi Adaptador Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG-70 | ||
| % Etanol (EtOH) | Auto-preparado-Acetil-CoA | ||
| Pancreac Applichem | A3753 | ||
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Toalhetes | com álcool | ( Álcool isopropílico 70%) | |
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | Com MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Solução de Separação | Biochrom | 6115 | |
| Gabinete de segurança biológica MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonilcianido-p-trifluorometoxi-fenilhidrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Contador de células TC20 Contador de células automatizado | Centrífuga Bio-Rad | ||
| Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Contagem de lâminas, câmara dupla para contador de células | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimetilsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Spray de desinfecção Luvas | |||
| descartáveis látex, borracha ou vinil. | |||
| Distrips (12,5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Etanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80° C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Incubadora Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Seringa de injeção | Hamilton | ||
| Malato | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Auto-preparado-Mr | ||
| . Frosty Recipiente de congelamento | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Localizador de tanque de nitrogênio 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetato | Sigma-Aldrich-Oxygraph-2k | ||
| Orobororus Instruments | |||
| Penicilina-Estreptomicina | PAA | 15140122 | |
| Pipetas Performance Pipettor 10 μ L, 100 μ L, 1000 μ L | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Sacarose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinato | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetrametilfenilendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Torniquete/ Manguito | |||
| Tris(hidroximetil)amino-metano | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Bomba de vácuo | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Banho-maria WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Referências
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
- Kleiveland, C. R. Peripher....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
