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Artigo de método

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

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DOI:

10.3791/65789

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15 de setembro de 2023

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1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 4VA Ann Arbor Healthcare System

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Resumo

A mitofagia é um mecanismo de controle de qualidade necessário para manter a função mitocondrial ideal. A mitofagia disfuncional de células β resulta em liberação insuficiente de insulina. Avaliações quantitativas avançadas de mitofagia geralmente requerem o uso de repórteres genéticos. O modelo de camundongo mt-Keima, que expressa uma sonda de dupla excitação sensível ao pH para quantificar a mitofagia via citometria de fluxo, foi otimizado em células β. A razão entre as emissões de comprimento de onda mt-Keima ácido-neutro pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia. No entanto, o uso de mitofagia genética pode ser um desafio ao trabalhar com modelos genéticos complexos de camundongos ou células difíceis de transfectar, como ilhotas humanas primárias. Este protocolo descreve um novo método complementar baseado em corantes para quantificar a mitofagia de células β em ilhotas primárias usando MtPhagy. A MtPhagy é um corante celular sensível ao pH que se acumula nas mitocôndrias e aumenta sua intensidade de fluorescência quando as mitocôndrias estão em ambientes de pH baixo, como os lisossomos durante a mitofagia. Combinando o corante MtPhagy com Fluozin-3-AM, um indicador de Zn2+ que seleciona para células β, e Tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, o fluxo de mitofagia pode ser quantificado especificamente em células β via citometria de fluxo. Essas duas abordagens são altamente complementares, permitindo flexibilidade e precisão na avaliação do controle de qualidade mitocondrial em inúmeros modelos de células β.

Introdução

As células β pancreáticas produzem e secretam insulina para atender às demandas metabólicas, e a disfunção das células β é responsável pela hiperglicemia e pelo aparecimento de diabetes tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2. As células β acoplam o metabolismo da glicose à secreção de insulina via produção energética e metabólica mitocondrial, que dependem de uma reserva de massa mitocondrial funcional 1,2,3. Para manter a função ótima das células β, as células β dependem de mecanismos de controle de qualidade mitocondrial para remover mitocôndrias envelhecidas ou danificadas e preservar a massa mitocondrial funcional4. A autofagia mitocondrial seletiva, também conhecida como mitofagia, é um componente-chave da via de controle de qualidade mitocondrial.

Avaliações de mitofagia em células vivas geralmente dependem de mudanças no pH mitocondrial que ocorrem durante a mitofagia. As mitocôndrias têm um pH ligeiramente alcalino, e as mitocôndrias saudáveis normalmente residem no citosol neutro em pH. Durante a mitofagia, mitocôndrias danificadas ou disfuncionais são seletivamente incorporadas aos autofagossomos e, eventualmente, eliminadas dentro dos lisossomos ácidos5. Vários modelos de mitofagia transgênica in vivo em camundongos, como mt-Keima6, mitoQC7 e CMMR8, bem como sondas transfectáveis de mitofagia, como o plasmídeo Cox8-EGFP-mCherry9, utilizam essa mudança de pH para fornecer avaliações quantitativas da mitofagia. O uso de camundongos transgênicos expressando a sonda de dupla excitação mt-Keima-sensível ao pH foi otimizado para avaliações de mitofagia em ilhotas e células β por citometria de fluxo10,11. A razão entre as emissões ácidas/neutras do comprimento de onda mt-Keima (a razão entre a excitação ácida de 561 nm e a excitação neutra de 480 nm) pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia 6,12.

Este protocolo descreve uma abordagem otimizada para avaliar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias e células β isoladas de camundongos transgênicos mt-Keima10,11. Embora a mt-Keima seja uma sonda altamente sensível, ela requer esquemas complicados de melhoramento animal ou a transfecção de células, o que muitas vezes pode ser desafiador quando se trabalha em combinação com outros modelos genéticos ou com ilhotas humanas primárias. Além disso, o uso de múltiplos lasers e detectores de fluorescência para identificar populações de células neutras e ácidas pode limitar o uso combinatório de outros repórteres fluorescentes.

Para superar esses desafios, este protocolo também descreve um método complementar, de canal único fluorescente, baseado em corantes para detecção robusta de mitofagia em células-β de ilhotas isoladas de camundongos. Esta abordagem, conhecida como método MtPhagy, utiliza uma combinação de três corantes permeáveis a células para selecionar células β, quantificar as populações celulares ativamente submetidas à mitofagia e avaliar o potencial de membrana mitocondrial (MMP ou Δψm) simultaneamente.

O primeiro desses corantes é o Fluozin-3-AM, um indicador Zn2+ permeável a células com um Ex/Em 494/516 nm13. As ilhotas de camundongos compreendem uma população heterogênea de células funcionalmente distintas, incluindo células α, β, δ e PP. As células-β compreendem aproximadamente 80% das células dentro da ilhota de camundongo e podem ser distinguidas de outros tipos de ilhotas devido à sua alta concentração de Zn2+ dentro dos grânulos de insulina14,15, permitindo a identificação de células-β comoa alta população de Fluozina-3-AM. O corante MtPhagy, um corante sensível ao pH que é imobilizado na mitocôndria através de uma ligação química e emite fluorescência fraca, também é utilizado neste protocolo16. Após a indução da mitofagia, as mitocôndrias danificadas são incorporadas ao lisossomo ácido, e o corante MtPhagy aumenta sua intensidade de fluorescência dentro do ambiente de pH baixo (Ex/Em 561/570-700 nm).

Além disso, a tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), é usada para avaliar a MMP. TMRE é um corante permeável a células com carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que é sequestrado por mitocôndrias saudáveis devido à carga negativa relativa sustentada por seu potencial de membrana17. Mitocôndrias danificadas ou insalubres dissipam seu potencial de membrana, resultando na diminuição da capacidade de sequestrar TMRE. Utilizando esses corantes em conjunto, as células β submetidas à mitofagia podem ser identificadas como a população baixa de MtPhagyaltaFluozin MtPhagyatravésda citometria de fluxo. Como a mitofagia é um processo dinâmico e não estático, este protocolo foi otimizado para avaliar o fluxo mitofágico usando valinomicina, um ionóforo K+ que induz mitofagia após dissipação de MMP18. A comparação da mitofagia na presença e ausência de valinomicina permite avaliar o fluxo de mitofagia em diferentes grupos amostrais.

A natureza baseada em corantes da abordagem atual permite que ela seja extrapolada para ilhotas humanas e outros tipos de células difíceis de transfectar e contorna a necessidade de esquemas complicados de criação de animais, ao contrário do protocolo mt-Keima. O objetivo geral deste protocolo é quantificar a mitofagia em células β em nível de célula única através de dois métodos independentes baseados em citometria de fluxo. Em conjunto, este protocolo descreve dois métodos poderosos e complementares que permitem precisão e flexibilidade no estudo quantitativo do controle de qualidade mitocondrial.

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Protocolo

Os estudos em animais apresentados neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Camundongos C57BL/6J machos de vinte semanas de idade, com dieta regular de gordura (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD), foram usados para este estudo.

1. Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes (Método 1)

  1. Preparação e tratamento de ilhotas de camundongos
    1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas de camundongos com dieta com gordura regular (RFD) ou dieta hiperlipídica (DHH, 60 kcal% de gordura19), seguindo os métodos descritos anteriormente 2,10.
      2. Amostras de ilhotas cultivadas durante a noite a 37 °C em meio RPMI suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-antimicótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de soro fetal bovino (SFB) (ver Tabela de Materiais). Este meio será referido como "meio ilhota".
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm em 2 mL de meio de ilhotas.
        NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas RFD sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas RFD coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas RFD coradas com fluozina-3-AM; (4) Controle somente MtPhagy: ilhotas RFD coradas com MtPhagy; (5) Controle somente TMRE: ilhotas RFD coradas com TMRE; (6) RFD não tratada: ilhotas RFD coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (7) Ilhotas RFD expostas à valinomicina: ilhotas RFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (8) DHL não tratada: ilhotas de DH coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (9) Ilhotas HFD expostas à valinomicina: ilhotas HFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para as condições (7) e (9) (ver NOTA acima) expostas à valinomicina, adicionar 2 μL de 250 nΜ de estoque de valinomicina (ver Tabela de Materiais) às ilhotas na placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
    2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Após 3 h de exposição à valinomicina, escolha 100 ilhotas de cada condição em tubos de microcentrífuga separados usando uma pipeta.
      2. Gire ilhotas a 350 x g durante 1 min a 10 °C e elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta.
      3. Lavar as amostras 2x com 1 mL 1x de solução salina tamponada com fosfato (PBS), com passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
      4. Para dissociar ilhotas em células únicas, adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (pré-aquecida a 37 °C) ao tubo de microcentrífuga de uma amostra para evitar a digestão excessiva das ilhotas. Pipetar para cima e para baixo repetidamente até que as ilhotas estejam visivelmente dispersas.
      5. Adicionar imediatamente 1 mL de meio de ilhota pré-aquecido para neutralizar a tripsina. Repita a tripsinização e a neutralização para cada amostra, uma de cada vez.
      6. Amostras de spin a 500 x g durante 5 min a 10 °C. Retire o sobrenadante com uma pipeta, com cuidado para não atrapalhar o pellet.
        OBS: O pellet será delicado para amostras expostas à valinomicina.
      7. Lavar as amostras 2x com meio RPMI, sem vermelho fenol, suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-micótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de albumina de soro bovino (BSA). Este meio será referido como "meio de fluxo de ilhotas". Inclua passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
    3. Células corantes com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI para se preparar para citometria de fluxo.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de 100 μM de MtPhagy stock (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante MtPhagy (condições 4, 6, 7, 8 e 9, NOTA para o passo 1.1.1).
      3. Adicionar 0,25 μL de estoque TMRE de 100 μM (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante TMRE (condições 5, 6, 7, 8 e 9).
      4. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM (consulte Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 6, 7, 8 e 9).
      5. Tubos de vórtice em baixa velocidade por 5 s para misturar.
      6. Embrulhe os tubos de microcentrífuga em papel alumínio para proteger da luz e incube a 37 °C por 30 min. No meio da incubação, tubos de vórtice em baixa velocidade para 5-10 s para misturar.
      7. Após a incubação, centrifugar as amostras a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
      8. Ressuspender amostras em meio de fluxo de ilhotas de 500 μL. Adicionar 0,2 μg/mL DAPI (ver Tabela de Materiais) às condições 2, 6, 7, 8 e 9.
      9. Amostras de spin a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e ressuspender em 500 μL de meio de fluxo das ilhotas.
      10. Coloque amostras no gelo.
  2. Citometria de fluxo
    1. Inicie o instrumento (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará. Os seguintes filtros foram utilizados neste estudo: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 para corante MtPhagy: Excitação/Emissão - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 para TMRE: Excitação/Emissão - 561 nm/585 nm (16 nm).
    2. Ajuste as tensões para frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para garantir que as populações de células estejam no centro do gráfico de dispersão. Para este protocolo, as tensões utilizadas foram 120 V para FSC e 260 V para SSC para garantir que as células caíssem uniformemente dentro do FSC-A vs. Gráfico SSC-A (Figura 1A).
    3. Para excluir células não únicas, adicione uma porta retangular em FSC-H vs. FSC-W seguido por SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
    4. Ajuste as tensões e a compensação para DAPI para filtrar células β vivas. Ajuste as comportas de fluorescência para cada fluoróforo utilizado com base na amostra de RFD não corada (Figuras 1D-F).
      NOTA: Tensões utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
    5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra.
      NOTA: Utilizando esta abordagem de gating, os níveis de mitofagia em condições basais e na indução de valinomicina foram avaliados em ilhotas RFD e HFD (Figura 2).
    6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

2. Avaliação da mitofagia utilizando o repórter mt-Keima codificado geneticamente (Método 2)

  1. Preparação de ilhotas de camundongo e dissociação unicelular
    1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas pancreáticas de camundongos selvagens (WT) e mt-Keima/+ (mt-Keima)6. Neste método, foram utilizados camundongos machos WT ou mt-Keima/+ com 20 semanas de idade alimentados com RFD.
      2. Amostras de ilhotas de cultura durante a noite a 37 °C em meio de ilhotas.
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm com 2 mL de meio de ilhotas.
        NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas WT sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas WT coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas WT coradas com Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima apenas controle: ilhotas mt-Keima/+ não manchadas; (5) Não tratadas: ilhéus mt-Keima/+ coradas com Fluozin-3-AM e DAPI; (6) Valinomicina: ilhotas mt-Keima/+ expostas à valinomicina e coradas com Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para a condição (6) com exposição à valinomicina, adicionar 2 μL de estoque de valinomicina 250 nM às ilhotas em placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
    2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Execute etapas de dissociação de célula única, conforme descrito na etapa 1.1.2.
    3. Células corantes com Fluozin-3-AM e DAPI.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 5 e 6).
      3. Incubar as células a 37 °C e proceder ao tratamento com DAPI, conforme descrito nos passos 1.1.3.5-1.3.10.
  2. Citometria de fluxo
    1. Inicie o instrumento. Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará.
      OBS: Foram utilizados os seguintes filtros: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 para mt-Keima neutro: Excitação/Emissão - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 para o ácido mt-Keima: Excitação/Emissão - 561 nm/620 nm (15 nm).
    2. Ajuste as tensões FSC e SSC e exclua células não individuais, conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.3 (Figuras 3A-C).
    3. Ajuste as tensões e compensações para DAPI, Fluozin-3-AM e mt-Keima usando controles não corados e single-positive (condições 1-4) para garantir que as populações de células positivas para fluorescência sejam distinguíveis das células não coradas. Uma vez que a compensação apropriada tenha sido aplicada a cada canal, configure a porta negativa DAPI e as portas positivas Fluozin-3-AM para filtrar as células β vivas (Figuras 3D-E).
    4. Estabelecer um esquema de triângulo usando a amostra positiva para mt-Keima (condição 4) para identificar populações de células ácidas e neutras (Figura 3F).
      NOTA: Tensões normalmente utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
    5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra. Os esquemas de vedação para as condições 5 e 6 são ilustrados na Figura 3A-G.
    6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

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Resultados

Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes
Esta abordagem baseada em corante foi otimizada para analisar o fluxo de mitofagia dentro de células primárias de β de camundongos sem a necessidade de um repórter genético, usando Fluozin-3-AM, TMRE e MtPhagy, bem como DAPI para excluir células mortas. Ao emparelhar esses corantes com valinomicina para induzir mitofagia, este protocolo delineia um método baseado em corantes para medir seletivamente o fluxo de mitofagia em células...

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Discussão

Este protocolo descreveu dois métodos complementares para quantificar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias dissociadas de camundongos. Usando o método mt-Keima, um aumento na mitofagia foi quantificado como um aumento da razão de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), enquanto no método MtPhagy, o aumento do fluxo de mitofagia foi quantificado como um aumento na população de células baixas de MtPhagyaltaMtPhagy Fluozinalta. Esses métodos permitem avaliações rápidas, quantitativas...

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Divulgações

A SAS recebeu financiamento da Ono Pharmaceutical Co., Ltd. e é consultora da Novo Nordisk.

Agradecimentos

E.L-D. reconhece o apoio dos NIH (T32-AI007413 e T32-AG000114). A SAS agradece o apoio do JDRF (COE-2019-861), do NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), do Departamento de Assuntos de Veteranos (I01 BX004444), da família Brehm e da família Anthony.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antibiótico-AntimicóticoLife Technologies15240-062
Attune NxT Citômetro de FluxoThermofisher ScientificA24858
Dimetil SulfóxidoSigma-Aldrich317275
Choque térmico livre BSA póEquitechBAH66
Soro bovino fetalGemini Bio900-108
Fluozin-3AM Thermofisher Scientific F24195100 μ g Fluozin-3AM pó reconstituído em 51 μ L DMSO e 51 μ L Pluronic F-127 para atingir estoque de 1 mM. 
Gibco  RPMI 1640 MédioFisher Scientific11-875-093
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
Corante MtPhagyDojindoMT02-105 μ g MtPhagy pó reconstituído com 50 μ L DMSO para chegar a 100 μ Estoque M. 
Corante MtPhagyDojindoMT02-10
Penicilina-Estreptomicina (100x)Life Technologies15140-1221x Solução usada em procotol diluindo 1:10 em ddH2O
Solução tamponada com fosfato, 10xFisher ScientificBP399-201x Solução usada em procotol diluindo 1:10 em ddH2O
Piruvato de Sódio (100x)Life Tecnologias11360-0705 μ g MtPhagy pó reconstituído com 50 μ L DMSO para chegar a 100 μ Estoque M. 
TMRE [Tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato]AnaspecAS-88061TMRE pó reconstituído em DMSO para atingir 100 μ Estoque M.
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolThermofisher Scientific25300054
ValinomicinaSigmaV0627Valinomicina em pó reconstituída em DMSO para atingir 250 nM de estoque.

Referências

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Reimpressões e permissões

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