Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

As células β pancreáticas produzem e secretam insulina para atender às demandas metabólicas, e a disfunção das células β é responsável pela hiperglicemia e pelo aparecimento de diabetes tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2. As células β acoplam o metabolismo da glicose à secreção de insulina via produção energética e metabólica mitocondrial, que dependem de uma reserva de massa mitocondrial funcional ^1,2,3. Para manter a função ótima das células β, as células β dependem de mecanismos de controle de qualidade mitocondrial para remover mitocôndrias envelhecidas ou danificadas e preservar a massa mitocondrial funcional⁴. A autofagia mitocondrial seletiva, também conhecida como mitofagia, é um componente-chave da via de controle de qualidade mitocondrial.

Avaliações de mitofagia em células vivas geralmente dependem de mudanças no pH mitocondrial que ocorrem durante a mitofagia. As mitocôndrias têm um pH ligeiramente alcalino, e as mitocôndrias saudáveis normalmente residem no citosol neutro em pH. Durante a mitofagia, mitocôndrias danificadas ou disfuncionais são seletivamente incorporadas aos autofagossomos e, eventualmente, eliminadas dentro dos lisossomos ácidos⁵. Vários modelos de mitofagia transgênica in vivo em camundongos, como mt-Keima⁶, mitoQC⁷ e CMMR⁸, bem como sondas transfectáveis de mitofagia, como o plasmídeo Cox8-EGFP-mCherry⁹, utilizam essa mudança de pH para fornecer avaliações quantitativas da mitofagia. O uso de camundongos transgênicos expressando a sonda de dupla excitação mt-Keima-sensível ao pH foi otimizado para avaliações de mitofagia em ilhotas e células β por citometria de fluxo^10,11. A razão entre as emissões ácidas/neutras do comprimento de onda mt-Keima (a razão entre a excitação ácida de 561 nm e a excitação neutra de 480 nm) pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia ^6,12.

Este protocolo descreve uma abordagem otimizada para avaliar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias e células β isoladas de camundongos transgênicos mt-Keima10,11. Embora a mt-Keima seja uma sonda altamente sensível, ela requer esquemas complicados de melhoramento animal ou a transfecção de células, o que muitas vezes pode ser desafiador quando se trabalha em combinação com outros modelos genéticos ou com ilhotas humanas primárias. Além disso, o uso de múltiplos lasers e detectores de fluorescência para identificar populações de células neutras e ácidas pode limitar o uso combinatório de outros repórteres fluorescentes.

Para superar esses desafios, este protocolo também descreve um método complementar, de canal único fluorescente, baseado em corantes para detecção robusta de mitofagia em células-β de ilhotas isoladas de camundongos. Esta abordagem, conhecida como método MtPhagy, utiliza uma combinação de três corantes permeáveis a células para selecionar células β, quantificar as populações celulares ativamente submetidas à mitofagia e avaliar o potencial de membrana mitocondrial (MMP ou Δψm) simultaneamente.

O primeiro desses corantes é o Fluozin-3-AM, um indicador Zn²⁺ permeável a células com um Ex/Em 494/516 nm¹³. As ilhotas de camundongos compreendem uma população heterogênea de células funcionalmente distintas, incluindo células α, β, δ e PP. As células-β compreendem aproximadamente 80% das células dentro da ilhota de camundongo e podem ser distinguidas de outros tipos de ilhotas devido à sua alta concentração de Zn²⁺ dentro dos grânulos de insulina^14,15, permitindo a identificação de células-β como^{a alta população} de Fluozina-3-AM. O corante MtPhagy, um corante sensível ao pH que é imobilizado na mitocôndria através de uma ligação química e emite fluorescência fraca, também é utilizado neste protocolo¹⁶. Após a indução da mitofagia, as mitocôndrias danificadas são incorporadas ao lisossomo ácido, e o corante MtPhagy aumenta sua intensidade de fluorescência dentro do ambiente de pH baixo (Ex/Em 561/570-700 nm).

Além disso, a tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), é usada para avaliar a MMP. TMRE é um corante permeável a células com carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que é sequestrado por mitocôndrias saudáveis devido à carga negativa relativa sustentada por seu potencial de membrana¹⁷. Mitocôndrias danificadas ou insalubres dissipam seu potencial de membrana, resultando na diminuição da capacidade de sequestrar TMRE. Utilizando esses corantes em conjunto, as células β submetidas à mitofagia podem ser identificadas como a população baixa de MtPhagy^altaFluozin MtPhagy^atravésda citometria de fluxo. Como a mitofagia é um processo dinâmico e não estático, este protocolo foi otimizado para avaliar o fluxo mitofágico usando valinomicina, um ionóforo K⁺ que induz mitofagia após dissipação de MMP¹⁸. A comparação da mitofagia na presença e ausência de valinomicina permite avaliar o fluxo de mitofagia em diferentes grupos amostrais.

A natureza baseada em corantes da abordagem atual permite que ela seja extrapolada para ilhotas humanas e outros tipos de células difíceis de transfectar e contorna a necessidade de esquemas complicados de criação de animais, ao contrário do protocolo mt-Keima. O objetivo geral deste protocolo é quantificar a mitofagia em células β em nível de célula única através de dois métodos independentes baseados em citometria de fluxo. Em conjunto, este protocolo descreve dois métodos poderosos e complementares que permitem precisão e flexibilidade no estudo quantitativo do controle de qualidade mitocondrial.

Os estudos em animais apresentados neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Camundongos C57BL/6J machos de vinte semanas de idade, com dieta regular de gordura (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD), foram usados para este estudo.

1. Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes (Método 1)

1. Preparação e tratamento de ilhotas de camundongos
   1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas de camundongos com dieta com gordura regular (RFD) ou dieta hiperlipídica (DHH, 60 kcal% de gordura¹⁹), seguindo os métodos descritos anteriormente ^2,10.
      2. Amostras de ilhotas cultivadas durante a noite a 37 °C em meio RPMI suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-antimicótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de soro fetal bovino (SFB) (ver Tabela de Materiais). Este meio será referido como "meio ilhota".
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm em 2 mL de meio de ilhotas.
         NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas RFD sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas RFD coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas RFD coradas com fluozina-3-AM; (4) Controle somente MtPhagy: ilhotas RFD coradas com MtPhagy; (5) Controle somente TMRE: ilhotas RFD coradas com TMRE; (6) RFD não tratada: ilhotas RFD coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (7) Ilhotas RFD expostas à valinomicina: ilhotas RFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (8) DHL não tratada: ilhotas de DH coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI; (9) Ilhotas HFD expostas à valinomicina: ilhotas HFD expostas à valinomicina e coradas com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para as condições (7) e (9) (ver NOTA acima) expostas à valinomicina, adicionar 2 μL de 250 nΜ de estoque de valinomicina (ver Tabela de Materiais) às ilhotas na placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
   2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Após 3 h de exposição à valinomicina, escolha 100 ilhotas de cada condição em tubos de microcentrífuga separados usando uma pipeta.
      2. Gire ilhotas a 350 x g durante 1 min a 10 °C e elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta.
      3. Lavar as amostras 2x com 1 mL 1x de solução salina tamponada com fosfato (PBS), com passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
      4. Para dissociar ilhotas em células únicas, adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (pré-aquecida a 37 °C) ao tubo de microcentrífuga de uma amostra para evitar a digestão excessiva das ilhotas. Pipetar para cima e para baixo repetidamente até que as ilhotas estejam visivelmente dispersas.
      5. Adicionar imediatamente 1 mL de meio de ilhota pré-aquecido para neutralizar a tripsina. Repita a tripsinização e a neutralização para cada amostra, uma de cada vez.
      6. Amostras de spin a 500 x g durante 5 min a 10 °C. Retire o sobrenadante com uma pipeta, com cuidado para não atrapalhar o pellet.
         OBS: O pellet será delicado para amostras expostas à valinomicina.
      7. Lavar as amostras 2x com meio RPMI, sem vermelho fenol, suplementado com 100 unidades/mL de antibiótico-micótico, 50 unidades/mL de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES e 10% de albumina de soro bovino (BSA). Este meio será referido como "meio de fluxo de ilhotas". Inclua passos de rotação (350 x g/1 min, 10 °C) entre cada lavagem. Descarte o sobrenadante com uma pipeta após cada lavagem.
   3. Células corantes com MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM e DAPI para se preparar para citometria de fluxo.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de 100 μM de MtPhagy stock (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante MtPhagy (condições 4, 6, 7, 8 e 9, NOTA para o passo 1.1.1).
      3. Adicionar 0,25 μL de estoque TMRE de 100 μM (ver Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante TMRE (condições 5, 6, 7, 8 e 9).
      4. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM (consulte Tabela de Materiais) aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 6, 7, 8 e 9).
      5. Tubos de vórtice em baixa velocidade por 5 s para misturar.
      6. Embrulhe os tubos de microcentrífuga em papel alumínio para proteger da luz e incube a 37 °C por 30 min. No meio da incubação, tubos de vórtice em baixa velocidade para 5-10 s para misturar.
      7. Após a incubação, centrifugar as amostras a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
      8. Ressuspender amostras em meio de fluxo de ilhotas de 500 μL. Adicionar 0,2 μg/mL DAPI (ver Tabela de Materiais) às condições 2, 6, 7, 8 e 9.
      9. Amostras de spin a 350 x g durante 1 min a 10 °C. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e ressuspender em 500 μL de meio de fluxo das ilhotas.
      10. Coloque amostras no gelo.
2. Citometria de fluxo
   1. Inicie o instrumento (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará. Os seguintes filtros foram utilizados neste estudo: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 para corante MtPhagy: Excitação/Emissão - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 para TMRE: Excitação/Emissão - 561 nm/585 nm (16 nm).
   2. Ajuste as tensões para frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para garantir que as populações de células estejam no centro do gráfico de dispersão. Para este protocolo, as tensões utilizadas foram 120 V para FSC e 260 V para SSC para garantir que as células caíssem uniformemente dentro do FSC-A vs. Gráfico SSC-A (Figura 1A).
   3. Para excluir células não únicas, adicione uma porta retangular em FSC-H vs. FSC-W seguido por SSC-H vs. SSC-W (Figura 1B,C).
   4. Ajuste as tensões e a compensação para DAPI para filtrar células β vivas. Ajuste as comportas de fluorescência para cada fluoróforo utilizado com base na amostra de RFD não corada (Figuras 1D-F).
      NOTA: Tensões utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
   5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra.
      NOTA: Utilizando esta abordagem de gating, os níveis de mitofagia em condições basais e na indução de valinomicina foram avaliados em ilhotas RFD e HFD (Figura 2).
   6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

2. Avaliação da mitofagia utilizando o repórter mt-Keima codificado geneticamente (Método 2)

1. Preparação de ilhotas de camundongo e dissociação unicelular
   1. Realizar cultura de ilhotas e exposição à valinomicina seguindo os passos abaixo.
      1. Isolar ilhotas pancreáticas de camundongos selvagens (WT) e mt-Keima/+ (mt-Keima)⁶. Neste método, foram utilizados camundongos machos WT ou mt-Keima/+ com 20 semanas de idade alimentados com RFD.
      2. Amostras de ilhotas de cultura durante a noite a 37 °C em meio de ilhotas.
      3. Usando uma pipeta, escolha 100 ilhotas por condição em placas de Petri de 6 cm com 2 mL de meio de ilhotas.
         NOTA: Condições utilizadas para este protocolo: (1) Controle sem manchas: ilhotas WT sem manchas; (2) Controle somente DAPI: ilhotas WT coradas com DAPI; (3) Controle somente com fluozina-3-AM: ilhotas WT coradas com Fluozin-3-AM; (4) mt-Keima apenas controle: ilhotas mt-Keima/+ não manchadas; (5) Não tratadas: ilhéus mt-Keima/+ coradas com Fluozin-3-AM e DAPI; (6) Valinomicina: ilhotas mt-Keima/+ expostas à valinomicina e coradas com Fluozin-3-AM e DAPI.
      4. Para a condição (6) com exposição à valinomicina, adicionar 2 μL de estoque de valinomicina 250 nM às ilhotas em placa de Petri por 3 h para induzir mitofagia.
   2. Realizar dissociação de célula única.
      1. Execute etapas de dissociação de célula única, conforme descrito na etapa 1.1.2.
   3. Células corantes com Fluozin-3-AM e DAPI.
      1. Ressuspender amostras de ilhotas em 500 μL de meio de fluxo de ilhotas.
      2. Adicionar 0,25 μL de estoque de Fluozin-3-AM 1 mM aos tubos que recebem corante Fluozin-3-AM (condições 3, 5 e 6).
      3. Incubar as células a 37 °C e proceder ao tratamento com DAPI, conforme descrito nos passos 1.1.3.5-1.3.10.
2. Citometria de fluxo
   1. Inicie o instrumento. Qualquer citômetro de fluxo com os filtros apropriados funcionará.
      OBS: Foram utilizados os seguintes filtros: (1) VL1 para DAPI: Excitação/Emissão - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 para Fluozin-3-AM: Excitação/Emissão - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 para mt-Keima neutro: Excitação/Emissão - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 para o ácido mt-Keima: Excitação/Emissão - 561 nm/620 nm (15 nm).
   2. Ajuste as tensões FSC e SSC e exclua células não individuais, conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.3 (Figuras 3A-C).
   3. Ajuste as tensões e compensações para DAPI, Fluozin-3-AM e mt-Keima usando controles não corados e single-positive (condições 1-4) para garantir que as populações de células positivas para fluorescência sejam distinguíveis das células não coradas. Uma vez que a compensação apropriada tenha sido aplicada a cada canal, configure a porta negativa DAPI e as portas positivas Fluozin-3-AM para filtrar as células β vivas (Figuras 3D-E).
   4. Estabelecer um esquema de triângulo usando a amostra positiva para mt-Keima (condição 4) para identificar populações de células ácidas e neutras (Figura 3F).
      NOTA: Tensões normalmente utilizadas para cada canal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
   5. Uma vez que os portões são estabelecidos, colete 10.000 eventos por amostra. Os esquemas de vedação para as condições 5 e 6 são ilustrados na Figura 3A-G.
   6. Salve os dados como arquivos FCS para análise.

Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes
Esta abordagem baseada em corante foi otimizada para analisar o fluxo de mitofagia dentro de células primárias de β de camundongos sem a necessidade de um repórter genético, usando Fluozin-3-AM, TMRE e MtPhagy, bem como DAPI para excluir células mortas. Ao emparelhar esses corantes com valinomicina para induzir mitofagia, este protocolo delineia um método baseado em corantes para medir seletivamente o fluxo de mitofagia em células-β primárias de camundongos18. Para os dados mostrados usando este método de MtPhagy, tanto a mitofagia basal quanto a induzida por valinomicina foram analisadas em ilhotas isoladas de dieta com gordura regular (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD, 60 kcal% de gordura) alimentadas com camundongos para avaliar o efeito do estresse metabólico sobre o fluxo de mitofagia. Para identificar a população de interesse, as células foram confinadas usando ilhotas RFD não tratadas. As tensões FSC e SSC foram primeiramente ajustadas para obter uma distribuição uniforme de células em um gráfico SSC-A vs. FSC-A (Figura 1A). Para selecionar células únicas, FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. Foram utilizados gráficos SSC-W, onde os multipletos foram excluídos devido aos seus maiores valores de sinal de largura em comparação com células individuais (Figura 1B,C). Em seguida, células DAPI-negativas foram selecionadas para excluir células mortas20 (Figura 1D). Após o estabelecimento das comportas primárias, controles corados com coloração única foram utilizados para estabelecer comportas de fluorescência para Fluozin-3-AM, MtPhagy e TMRE (Figura 1E-G), bem como controles de compensação para citometria de fluxo de fluorescência multicolorida.

Uma vez estabelecidas essas comportas primárias e de fluorescência, as células β com alta utilização de mitofagia foram definidas comoa população baixa de TMREaltaMtPhagydeFluozin no quadrante 3 (Q3) usando RFD sem exposição à valinomicina (Figura 1H). Usando essa estratégia de gateing, os níveis basais e de mitofagia induzidos por valinomicina foram caracterizados em ambas as ilhotas de DDF e HFD (Figura 2). Para quantificar o fluxo mitofágico, basal vs. Os níveis de mitofagia induzida por valinomicina foram comparados usando a seguinte razão:

Usando esta razão, o fluxo de mitofagia foi quantificado e comparado em RFD vs. Células β HFD para avaliar diferenças na mitofagia após a indução de obesidade e resistência periférica à insulina. Quantificação do fluxo mitofágico em RFD vs. As amostras de HFD são mostradas na Figura 2E. Este resultado destaca a viabilidade deste ensaio para quantificar a mitofagia em células β usando uma abordagem simples baseada em corantes. Este método também pode ser empregado em ilhotas humanas, células de difícil transfecção e ilhotas isoladas de modelos genéticos complexos, onde o cruzamento com o modelo transgênico mt-Keima seria complicado.

Avaliação da mitofagia utilizando o repórter mt-Keima codificado geneticamente
Mt-Keima é uma proteína fluorescente de excitação dupla fundida com uma sequência de localização de Cox8 que permite seu direcionamento para a membrana mitocondrial interna. A propriedade fluorescente bimodal do mt-Keima permite alternar seus espectros de excitação do comprimento de onda neutro (405 nm) para ácido (561 nm), dependendo do pH do compartimento intracelular6. Isso permite uma análise robusta de fluorescência ratiométrica da mitofagia, onde um aumento na razão ácido-neutro indica indução da mitofagia. Nesse protocolo, a fluozina-3-AM também foi utilizada para seleção de células β por citometria de fluxo. Nesses estudos representativos, o fluxo de mitofagia foi avaliado utilizando ilhotas isoladas de camundongos alimentados com dieta RFD10,11. As tensões FSC e SSC foram primeiramente ajustadas para atingir uma distribuição uniforme de células em um SSC-A vs. Gráfico FSC-A (Figura 3A). Para selecionar células únicas, FSC-H vs. FSC-W e SSC-H vs. Foram utilizados gráficos SSC-W, onde os multipletos foram excluídos devido aos seus maiores valores de sinal de largura em comparação com células individuais (Figura 3B,C). A voltagem e a estratégia de gating para DAPI e Fluozin-3-AM foram determinadas utilizando ilhotas de coloração simples (Figura 3D,E). Portas triangulares para as populações ácida e neutra foram então identificadas usando a amostra mt-Keima positiva sem exposição à valinomicina (Figura 3F).

Uma vez estabelecidas essas comportas primárias e de fluorescência, o fluxo mitofágico foi avaliado por meio das alterações basais e induzidas pela valinomicina na fluorescência da mt-Keima (Figura 3F,G). Para quantificar o fluxo mitofágico, mitofagia basal vs. Os níveis induzidos por valinomicina foram comparados usando a seguinte razão:

Usando esta razão, o fluxo de mitofagia foi quantificado em células RFD. A quantificação desse resultado é mostrada na Figura 3H. É importante ressaltar que esses resultados são comparáveis aos resultados em ilhotas RFD geradas usando a abordagem MtPhagy (Figura 3H).

Figura 1: Esquema de Gating para o método MtPhagy. (A) Gráfico de fluxo exibindo esquema de gating a ser selecionado para todas as células. (B) Gating para selecionar singlets com base em FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating para células DAPI-negativas para excluir células mortas. (E) Gating para célulasaltas de Fluozin-3-AM para selecionar células β. (F) Esquema de Gating para o corante MtPhagy para identificar populaçõesde células altas e baixas deMtPhagy. (G) Esquema de Gating para TMRE para identificar populaçõesde células TMRE altas ebaixas TMRE. (H) Esquema de agrupamento de quadrantes estabelecido com ilhotas RFD não tratadas paraidentificar células baixas de FluozinhighMtPhagyhighTMRE no quadrante 3 (Q3) como células β submetidas à mitofagia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Avaliação das diferenças do fluxo mitofágico em células β de camundongo após estresse metabólico usando o esquema de gating MtPhagy. Gráficos representativos de citometria de fluxo de (A) células β RFD não tratadas, (B) células β HFD não tratadas, (C) células β RFD expostas à valinomicina e (D) células β HFD expostas à valinomicina. (E) Quantificação do fluxo de mitofagia em células β, calculado usando uma razão entreas células baixas TMREaltasMtPhagy expostas à valinomicina eas células baixas TMREaltasMtPhagy não expostas à valinomicina, tanto para amostras de RFD quanto HFD. *p < 0,05 pelo teste t de Student não pareado. n = 3/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Esquema de Gating para o método mt-Keima e comparação entre os dois métodos. (A) Gráfico de fluxo exibindo esquema de gating para selecionar para todas as células. (B) Gating para selecionar singlets com base em FSC-H vs. FSC-W e (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Gating para células DAPI-negativas para excluir células mortas. (E) Gating para célulasaltas de Fluozin-3-AM para selecionar células β. (F) Gráficos representativos de citometria de fluxo de células mt-Keima/+ não tratadas e (G) células mt-Keima/+ expostas à valinomicina. (H) Quantificação do fluxo de mitofagia em células β de camundongos alimentados com RFD, calculado usando uma razão entre as células ácidas/neutras expostas à valinomicina e a razão entre as células ácidas/neutras não expostas à valinomicina usando o método mt-Keima e comparado com o método MtPhagy (dados para o protocolo MtPhagy originalmente mostrados na Figura 2E). n = 3/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A SAS recebeu financiamento da Ono Pharmaceutical Co., Ltd. e é consultora da Novo Nordisk.