Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.
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Artigo de método
Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.
Introdução
Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso1. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense2. Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Hainan Medical University. As amostras de tecido utilizadas neste estudo não são consideradas estudos envolvendo seres humanos. Esses espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico patológico forense, e o restante foi usado para a extração de DNA de diatomáceas neste experimento. Os pesquisadores não podem identificar prontamente os indivíduos para obter o consentimento informado das partes interessadas relevantes.
OBS: Para garantir a aplicabilidade geral do método de pesquisa relatado neste experimento, este experimento seguiu basicamente as instruções de operação do kit utilizado, sendo ....
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Resultados
Uma vez que a solução de DNA extraída pelo método de extração de DNA atualmente utilizado contém todos os componentes de DNA de diferentes fontes na amostra, o DNA obtido por este protocolo não foi exceção. Assim, a solução de DNA não era apenas uma solução de DNA genômico de diatomáceas. Os primers capazes de amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S foram selecionados por meio de consulta à literatura22,23,24.<.......
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Discussão
As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras17, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas21. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de massa no processo .......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82060341,81560304) e pelo Projeto de Pesquisa Científica da Plataforma de Inovação Acadêmica da Província de Hainan (YSPTZX202134).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tampão de ligação | BioTeke | B010006022 | células de lise rápida |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 Escada de DNA | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Meça a posição das bandas eletroforéticas |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotecnologia | TW21109197 | primer reverso |
| Tampão de eluição | BioTeke | B010006022 | Um tampão de eluição com baixo teor de sal lava o |
| DNA Conta de vidro | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Esferas de vidro especiais para dispersão e moagem |
| Coluna de adsorção de importação | BioTeke | B2008006022 | Coluna de adsorção com membrana de matriz de sílica |
| Tampão de remoção de inibidores | BioTeke | B010006022 | Remoção de inibidores na extração de DNA |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitar ou isolar DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | ação oscilatória |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inativação de nucleases intracelulares e outras proteínas |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | quantificação de fluorescência em tempo real PCR |
| Velocidade Micro-Centrífuga | Scilogex | 9013001121 | |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | imagem latente do gel |
| Taq Mix pro | Monad | 00007808-140534 | PCR |
| Mix Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | o |
| tampão | BioTeke | da lavagem do PCR B010006022 | remova as impurezas tais como os metabolitos da pilha |
Referências
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin....
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Reimpressões e permissões
