O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.
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Artigo de método
Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sequenciamento do multioma, que fornece RNA de célula única- mesma célula/pareado e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequenciamento), representa um avanço em nossa capacidade de discernir a heterogeneidade de células tumorais - um foco primário da pesquisa translacional do câncer neste momento. No entanto, a qualidade dos dados de sequenciamento adquiridos com essa modalidade avançada é altamente dependente da qualidade do material de entrada.
As condições de digestão precisam ser otimizadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade. Isso é particularmente desafiador no contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicas densas que devem ser suavemente quebradas para liberação celular. Células recém-isoladas de tecido tumoral sólido são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, condições devem ser selecionadas para suportar a população celular total.
Finalmente, as condições de isolamento nuclear devem ser otimizadas com base nessas qualidades em termos de tempos de lise e tipos/proporções de reagentes. Neste artigo, descrevemos nossa experiência com isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de espécimes tumorais sólidos. Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, armazenamento de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento e avaliação nuclear.
Introdução
À medida que nosso conhecimento da biologia tumoral cresce, a importância de analisar células heterogêneas em todo o microambiente tumoral também temaumentado1,2. A capacidade de adquirir RNA de célula única e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequencing) da mesma célula de forma pareada (sequenciamento multioma) proporcionam um avanço significativo nesse sentido 3,4. No entanto, esses experimentos são caros e demorados, e a qualidade e o impacto dos dados adquiridos são altamente dependentes da qualidade....
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Protocolo
Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) foram adquiridas de acordo com um protocolo aprovado pelo IRB em nosso laboratório. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para coleta de tecidos. O tecido foi transportado da sala cirúrgica para o laboratório e, em seguida, processado da seguinte forma.
1. Dissociação tecidual (digestão)
- Prepare o Buffer de Digest (consulte a Tabela de Materiais).
- Obter o tecido de interesse o mais rápido possível após a excisão do tumor e transportar o espécime em tampão de têmpera (DMEM F-12 com ~5% de soro fetal bovin....
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Resultados
Para isolar núcleos de alta qualidade de espécimes tumorais sólidos de pacientes para sequenciamento do multioma (Figura 1), o tecido tumoral foi dissociado e uma suspensão unicelular foi criopreservada (Figura 2A-D). A suspensão celular foi então descongelada no momento da captura planejada do mulômeno. A captura dos núcleos foi realizada com reagentes de tampão de lise otimizados e temporização para maximizar a qualidade e o r.......
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Discussão
Desembaraçar as populações celulares heterogêneas presentes no microambiente tumoral é uma área ativa de foco na biologia do câncer. Da mesma forma, existem tecidos complexos em patologias benignas, como cicatrização de feridas e fibrose. O sequenciamento multioma tem emergido como uma ferramenta poderosa que permite a aquisição de dados de scRNA- e ATAC-seq pareados. Este protocolo descreve o isolamento de núcleos, o que demanda otimização no processamento de espécimes tumorais frescos, frágeis e pequenos. Aqui nós forn.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), particularmente Dhananjay Wagh e John Coller, e à 10x Genomics por sua assistência na otimização de nossos experimentos. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser e Byrne Lee por sua assistência na aquisição de espécimes de pacientes. Gostaríamos de agradecer a Art e Elaine Taylor, a Fundação Rantz e Warren e Judy Kaplan por seu generoso apoio aos nossos esforços de pesquisa. As fontes de financiamento incluem subsídios do NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Dam....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100, 70 e 40 μ m Filtros de células Falcon | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Cloreto de Cálcio | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Colagenase (Colagenase Tipo IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μ m Filtro de Células de Ponta de Pipeta | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Solução de separação de células gradientes | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM kit de digestão | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Recipiente de Congelamento "Mr. Frosty" Nalgene Cryo | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substituto | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Inibidor de rnase | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
Referências
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).
- Sahai, E., et al.
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Reimpressões e permissões
