Ensaio de Atividade do Fator Tecidual da Vesícula Extracelular

Resumo

Descrevemos aqui um ensaio in house de atividade do fator tecidual da vesícula extracelular. Ensaios baseados em atividade e ensaios baseados em antígenos têm sido usados para medir o fator tecidual em vesículas extracelulares de amostras de plasma humano. Os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos.

Resumo

O fator tecidual (FT) é um receptor transmembrana para o fator (F) VII e FVIIa. O complexo TF/FVIIa inicia a cascata de coagulação ativando tanto o FIX quanto o FX. O FT é liberado das células para a circulação na forma de vesículas extracelulares (EVs). O nível de EVs TF-positivos (⁺) está aumentado em várias doenças, incluindo câncer, infecções bacterianas e virais e cirrose, e está associado a trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade. Existem duas maneiras de medir os EVs TF⁺ no plasma: ensaios baseados em antígeno e atividade. Os dados indicam que os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos. Este artigo descreve nosso ensaio interno de atividade de EVTF baseado em um ensaio de geração FXa de dois estágios. FVIIa, FX e cálcio são adicionados às amostras contendo TF⁺ EV para gerar FXa na presença e ausência de anticorpo anti-TF para distinguir a geração FXa TF-dependente da geração FXa TF-independente. Um substrato cromogênico clivado por FXa é usado para determinar o nível de FXa, enquanto uma curva padrão gerada com um TF recombinante relipidado é usada para a determinação da concentração de FT. Este ensaio interno de atividade de EVTF tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio comercial de atividade de FT.

Introdução

A coagulação sanguínea é iniciada com a ligação do fator (F) VII/VIIa ao fator tecidual (FT)¹. O complexo TF/FVIIa ativa tanto o FIX quanto o FX para ativar a coagulação sanguínea¹. Existem duas formas de TF completo, ligado à membrana: criptografado e ativo. Além disso, há uma forma alternativamente emendada de FT (asTF). A esfingomielina e a fosfatidilcolina no folheto externo da membrana celular mantêm os FT criptografados ^2,3,4. Quando as células são ativadas ou danificadas, a scramblase fosfolipídica transfere fosfatidilser....

Protocolo

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da University of North Carolina at Chapel Hill (número do protocolo: 14-2108).

1. Coleta de sangue de doadores

1. Coletar sangue total usando punção venosa limpa na veia antecubital com uma agulha 21 G. Descarte os primeiros 3 mL de sangue, pois essa porção de sangue pode conter FT das células perivasculares.
2. Extrair 2,7 ou 1,8 ml (dependendo do tamanho dos tubos) de sangue num vacutainer contendo 3,2% de citrato de sódio (0,109 mol/L). Não encha demais ou subencha os tubos. Inverter suavemente os tubos imediatamente após a coleta de sangue para dispe....

Resultados

Um resultado bem-sucedido fornece um valor de controle positivo de ≥0,5 pg/mL e um valor de controle negativo de <0,5 pg/mL. É melhor encontrar um respondedor de LPS alto com atividade de >1,0 pg/mL EVTF para um controle positivo. O resultado representativo mostra a atividade EVTF de EVs isolados do plasma do sangue total de 11 doadores saudáveis, com e sem ativação do LPS (Figura 4). Seis dos onze doadores (Doadores 2, 4, 5, 8, 10, 11) responderam de médio a alto LPS, enquanto cinco d.......

Discussão

Aqui, o protocolo do nosso ensaio interno de atividade EVTF é apresentado. Há três etapas críticas no protocolo. Ao reconstituir a pelota de EV, é importante pipetar para cima e para baixo no local da pelota de EV, mesmo que ela não seja visível. A reconstituição incompleta da pastilha de EV resultará em um falso negativo ou subestimação dos valores de atividade de EVTF das amostras. Em segundo lugar, o uso de HBSA-Ca(+) é crítico na etapa 6.5 do protocolo porque a geração FXa não pode ser gerada sem cálcio. Em terceiro .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de 1,5 mL para centrifugação de 20.000 x g	qualquer empresa	N/A	Usamos o da Fisher Scientific (Número de catálogo: 05-408-129).
Tubo de 1,5 mL para ultracentrífuga	de qualquer empresa	N/A	Usamos o da Beckman Coulter (Número de catálogo: 357448)
Tubo de 15 mL	de qualquer empresa	N/A	Usamos o da VWR (Número de catálogo: 89039-666)
21 G x .75 in. Conjunto de Coleta de Sangue BD Vacutainer Safety-Lok com 12 pol. tubo e adaptador luer	BD	367281
placa de 96 poços	qualquer empresa	N/A	Usamos o da Globe Scientific (Número de catálogo: 120338).
Tubos de citrato de vacutainer BD		BD 363083
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A9418
Cloreto de cálcio	Fisher Scientific	C69-500
Centrífuga para tubo de 1,5 mL	qualquer empresa	N/A	Usamos a Centrífuga 5417R (Eppendorf).
Centrífuga para tubo de 15 mL	qualquer empresa	N/A	Utilizamos a Centrífuga 5810R (Eppendorf).
D-(+)-glicose	Sigma Aldrich	G7021
Ácido etilenodiaminotetracético sal tetrassódico di-hidratado	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Laboratório de Pesquisa Enzimática	FVIIa Humana	HFVIIa	A solução deve ser diluída com HBSA-Ca(+).
Laboratório de	Pesquisa de Enzimas	HFX1010	A solução deve ser diluída com HBSA-Ca (+).
Fator anti-tecido humano inibitório de camundongo IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolissacarídeo de Escherichia coli O111: B4	Sigma Aldrich	L2630	Existem vários lipopolissacarídeos de diferentes E. coli.< / em> Diferentes lipopolissacarídeos têm diferentes potenciais para ativar monócitos.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Leitor de placas	qualquer empresa	N/A	Usamos o SpectraMax i3x da Molecular Devices
Fator de tecido recombinante relipidado, Dade Innovin	Siemens	10873566
Cloreto de sódio	Ultracentrífuga Fisher Scientific	S271-500
	Beckman Coulter	Optima TLX
Rotor de ultracentrífuga	Beckman Coulter	TLA-55

FX Humanas