Este protocolo descreve um método de medida da pressão e volume do ventrículo esquerdo utilizando a técnica de condutância pressão-volume. Este método permite o monitoramento contínuo em tempo real dos efeitos das drogas sobre o coração.
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Artigo de método
Detecção em Tempo Real dos Efeitos do Ácido Ferúlico no Ventrículo Esquerdo de Rato Usando Cateter de Condutividade Pressão-Volume
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diminuição da função cardíaca pode ter um impacto negativo em outros órgãos. A relação pressão-volume do ventrículo esquerdo é considerada um método válido para avaliação da função cardíaca. A monitorização em tempo real da função cardíaca é importante para a avaliação medicamentosa. Em condições de tórax fechado, o transdutor em miniatura, que é um componente importante do cateter pressão-volume, entra no ventrículo esquerdo do rato através da artéria carótida direita. O dispositivo visualiza as mudanças na função cardíaca durante o experimento na forma de uma alça pressão-volume. O volume real do ventrículo é calculado alterando a condutividade do sangue injetando 50 μL de uma solução de cloreto de sódio a 20% na veia jugular esquerda do rato. O volume real da cavidade ventricular do rato é calculado medindo a condutividade do sangue em um volume conhecido usando um cateter de condutância pressão-volume. Este protocolo permite a observação contínua dos efeitos das drogas sobre o coração e promoverá o racional para o uso de drogas étnicas especiais em doenças cardiovasculares.
Introdução
A doença cardiovascular apresenta a maior taxa de mortalidade domundo1. Suas causas incluem estenose de artéria coronária (isquemia miocárdica), bloqueio arterial coronariano (infarto do miocárdio) e lesão de isquemia-reperfusão2. Como o coração está em um ciclo sistólico e diastólico constante, é uma das partes mais exigentes em energia do corpo. Portanto, quando as artérias coronárias têm dificuldade em manter energia e oxigênio suficientes, a função cardíaca inevitavelmente diminui, o que tem um impacto negativo em outros órgãos 3,4. O coração é uma potência no sistema circulatório, e a função cardíaca precisa ser avaliada racionalmente.
A avaliação da função cardíaca pelas relações de pressão e volume ventriculares é considerada um métodoabrangente5. Mudanças em tempo real na pressão e volume ventricular durante todo o ciclo cardíaco compõem a alça pressão-volume. A alça pressão-volume ventricular permite a análise quantitativa da função cardíaca e da capacidade de reserva em termos de diferentes fases e energias do ventrículo. O ventrículo normal apresenta pequeno volume sistólico final, com bom trabalho de batimento e eficiência 5,6,7.
A técnica de cateter de condução pressão-volume é um método invasivo para detectar o estado do ventrículo esquerdo. Ele pode ser usado para obter uma malha contínua de pressão-volume em tempo real8. Os cateteres de condutividade volumétrica de pressão são ferramentas poderosas, e procedimentos de manuseio são essenciais para resultados reprodutíveis e confiáveis, incluindo análise in vivo da condutividade paralela miocárdica durante a calibração de solução salina e medida in vitro da condutividade sanguínea na calibração da cubeta3.
O ácido ferúlico (AG), um ácido fenólico, é amplamente distribuído em reinos vegetais como Avena sativa e Ligusticum chuanxiong hort 9,10. O ácido ferúlico tem efeitos farmacológicos de redução da pressão arterial e arritmia. O AG é um produto natural bioativo com múltiplas funções. A AF pode resistir ao dano oxidativo, reduzir a resposta inflamatória, inibir a agregação plaquetária e prevenir doença coronariana e aterosclerose11. No entanto, a maioria dos estudos sobre o ácido ferúlico tem se concentrado em um aspecto do coração e raramente os efeitos do ácido ferúlico têm sido avaliados no sistema circulatório 12,13,14,15. Descrevemos aqui uma abordagem torácica fechada para anestesia com isoflurano combinada com cetamina (50 mg/kg) com foco na resposta cardíaca à solução de ácido ferúlico durante a injeção da veia jugular.
Descreveremos todo o procedimento para o uso da ferramenta em condições de tórax fechado, incluindo preparo da solução, preparo do transdutor, preparo pré-experimental do rato, inserção do cateter na artéria carótida direita e análise dos dados. A duração do experimento é geralmente inferior a 4 h e é determinada pelos diferentes protocolos experimentais. Em um único experimento, podemos obter informações cardíacas detalhadas, como pressão, volume e frequência cardíaca do ventrículo esquerdo.
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Protocolo
O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Registro nº 2023-04). Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, 8-10 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. Os ratos foram mantidos em uma câmara de animais e estavam livres para beber e comer.
1. Preparação da solução
- Preparar solução de NaCl a 0,9% para ser utilizada para manter a área de trabalho adequadamente úmida.
- Para preparar solução hipertônica de NaCl a 20%, dissolver 2 g de NaCl em 10 mL de água bidestilada (ddH2O). Para determinar a condutividade paralela do miocárdio, é necessário alterar a condutividade do líquido intraventricular.
- Preparar solução de detergente em pó enzimático a 1%. Use-o no final do experimento, para imergir o cateter elétrico pressão-volume na solução por 1-2 h.
- Preparar a solução de AG dissolvendo 10 mg de ácido ferúlico em 20 ml de ddH2O. Filtrar a solução através de uma membrana de 0,22 μm. Injetar no rato 1 mL/kg de solução de ácido ferúlico.
2. Preparação do sensor
- Imergir o sensor de pressão-volume em solução de NaCl a 0,9% a 37 °C por cerca de 30-60 min antes do início do experimento, o que facilita a estabilidade dos dados experimentais.
- Conecte o aparato experimental. O sistema de medição das alças pressão-volume consiste em um cateter pressão-volume, duas unidades de controle, uma unidade de gravação e um software de execução por computador. O módulo de malha pressão-volume do software fornecerá um procedimento experimental de referência.
- Pressione o botão Iniciar e o software gravará automaticamente os dados de monitoramento do sensor de pressão-volume.
- Use o software Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) para calibrar a pressão e a condutividade.
3. Preparação pré-experimental do rato
- Administrar cetamina (50 mg/kg) e fentanil (0,25 mg/kg) aos ratos por injeção intramuscular5.
- Apertar os dedos dos ratos para verificar a profundidade anestésica pela ausência de reflexos. A emoção afeta o estado fisiológico de ratos e a dor provoca alterações na função cardíaca16. Use barbeadores de pequenos animais e cremes depilatórios para remover pelos em locais cirúrgicos. Use iodóforo e álcool 75% para limpar a pele para manter a esterilidade.
- Imobilizar ratos totalmente anestesiados em uma placa de aquecimento isotérmica com o dorso em contato com a placa de aquecimento.
- Insira uma sonda de temperatura revestida com vaselina no reto do rato. Manter a temperatura corporal do rato a 37 °C ± 0,5 ajustando a placa de aquecimento.
OBS: É necessário manter a via aérea desobstruída durante o experimento.
4. Inserção do cateter na artéria carótida direita
- Incisar a pele do lado direito da linha mediana do pescoço de ratos, longitudinalmente. Faça uma incisão de 4 cm e separe o músculo e o tecido conjuntivo por pinças. A artéria carótida situada no lado direito da traqueia é visível. A artéria carótida direita do rato é vermelho-escura, fortemente pulsátil e tem um nervo vago branco paralelo a ele.
- Separe a artéria carótida de outros tecidos e nervos usando pinças. Coloque três linhas cirúrgicas 5-0 abaixo da artéria carótida limpa. Gotejamento de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% na área cirúrgica para manter a umedecimento da artéria carótida.
- Corte a pele acima da clavícula esquerda e descasque o tecido ao redor da veia jugular. Em seguida, coloque um fio cirúrgico 5-0 sob a veia jugular esquerda.
- Use clipes arteriais para suspender o fluxo sanguíneo proximalmente, usando micro tesouras para cortar uma seção no vaso onde o fluxo sanguíneo parou. É normal que uma pequena quantidade de sangue apareça na secção transversal da ferida. Se o sangue estiver saindo do vaso de forma rápida e intermitente, levante a linha cirúrgica proximal e aplique a pinça arterial novamente.
- Insira o cateter a partir da secção transversal ao longo da artéria carótida profundamente no ventrículo esquerdo. Certifique-se de que o valor mais baixo da pressão sistólica após a entrada no ventrículo esquerdo seja próximo de 0 mmHg.
- Para obter uma relação pressão-volume razoável, ajuste levemente o cateter pressão-volume na câmara ventricular. Para evitar perda maciça de sangue e mudança de posição do cateter devido aos batimentos cardíacos, ligadura a extremidade proximal da linha cirúrgica.
NOTA: A temperatura corporal, o nível de anestesia, o sinal de pressão e o sinal de condutância do rato devem permanecer estáveis durante este processo. O trato respiratório do rato deve ser mantido aberto.
5. Injeção de fármacos e calibração da condutividade
- Manter a posição do volume de pressão do cateter na câmara ventricular, após estabilização dos dados, ligar a linha cirúrgica distal à veia jugular ligada e injetar lentamente até 1 mL/kg de solução de ácido ferúlico. Observe por 5-10 min.
- Injetar 50 μL de solução de NaCl a 20% da veia jugular esquerda para remover a condutância paralela gerada pelo miocárdio. A faixa de volume da condutância paralela foi de aproximadamente 130-280 μL5. Repita isso 3x em um intervalo de 2 min.
- Após o teste de pressão ventricular e volume em ratos, retire o sangue da aorta abdominal do rato usando uma agulha de coleta de sangue. Coloque o sangue coletado em um tubo de coleta de heparina sódica e inverta para cima e para baixo 2x para evitar a coagulação do sangue. Eutanasiar os ratos experimentais injetando-se 120 mg/kg de pentobarbital sódico através da veia jugular esquerda.
- Realizar a conversão da condutância medida para o volume sanguíneo real usando tubos de calibração de volume de rato. Coloque o sangue misturado com heparina sódica, sequencialmente, nos orifícios do tubo de calibração, e o cateter detecta os valores de condutância do sangue nos diferentes orifícios e os registra no módulo de monitorização pressão-volume.
6. Análise dos dados
- Ao adicionar o valor de condutividade medido de um volume conhecido de sangue ao local especificado, o software traça automaticamente a curva e extrapola a condutividade do sangue. Use pelo menos três conjuntos de valores de condutividade sanguínea para deduzir a condutividade sanguínea do rato em teste. A condutividade sanguínea é individualizada. Para cada rato sob o teste, realizar este procedimento individualmente.
- Calibração hipertônica: Ao adicionar os dados obtidos de três injeções de solução salina hipertônica a um local especificado, o software calcula médias de condutância paralelas e calibra automaticamente os dados experimentais.
- Utilizar regiões com valores estáveis de pressão arterial e condutância para analisar a função ventricular esquerda de ratos.
- Clique em Analisar e o software calculará automaticamente uma variedade de parâmetros com base na área selecionada, incluindo FE (frações de ejeção do ventrículo esquerdo), SW (trabalho sistólico) e CO (débito cardíaco), etc.
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Resultados
Cada teste (n = 3) baseou-se na entrada de um cateter de condutividade pressão-volume no ventrículo esquerdo. Há alterações significativas de sinal, como aumento acentuado da faixa de pressão, à medida que o cateter entra no ventrículo esquerdo pela artéria carótida (Figura 1). A análise gráfica da relação pressão-volume é completada plotando-se o volume (μL) no eixo Y e a pressão (mmHg) no eixo X. A pressão ventricular esquerda no rato estava entre 10-105 mmHg e os valores de condutância do...
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Discussão
É essencial adotar uma estratégia de dosagem racional para diferentes estados de função cardíaca. A técnica do cateter condutância pressão-volume é a maneira mais intuitiva de estudar a função ventricular esquerda5. Esse método permite que os efeitos de drogas sobre a função cardíaca sejam estudados sob uma perspectiva integral. Descrevemos detalhadamente as várias etapas do experimento. Isso proporcionará alguma facilidade para o estudo da função cardíaca.
A técnica do...
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa e Desenvolvimento Provincial de Sichuan (2022YFS043) e pelo Projeto Especial de Talento de Avanço da Fundação de Jovens da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (QJJJ2022029).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1 mL | Sartorius AG, | Alemanha-Manutenção | |
| da temperatura animal | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Dual Bio Amp | Millar, Inc., EUA | DA-100 | |
| Detergente em Pó Ativo Enzimático | Alconox Inc., EUA | 1104 | |
| Ácido ferúlico | Macklin Biochemical Co., Ltd, Shanghai, China | F900027 | |
| Transdutores de cateter Mikro-Tip, SPR-838NR | Millar, Inc., EUA | SPR-838NR | |
| Millar Volume de pressão Miro-Tip (MPVS) Ultra | Millar, Inc., EUA | SPR-869 | |
| Pet tosquiadeiras elétricas | Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd. | ||
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., EUA | PL3508 | |
| Cloreto de Sódio, NaCl | Reagente químico de Kelong, Chengdu, China | KX829463 | |
| Creme de depilação Veet | Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd. |
Referências
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Reimpressões e permissões
