Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.
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Artigo de método
Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transportadores de solutos (SLCs) são transportadores de membrana que importam e exportam uma gama de substratos endógenos e exógenos, incluindo íons, nutrientes, metabólitos, neurotransmissores e produtos farmacêuticos. Apesar de ter emergido como alvos terapêuticos atraentes e marcadores de doença, esse grupo de proteínas ainda é relativamente subdrogado pelos fármacos atuais. Projetos de descoberta de fármacos para esses transportadores são impedidos por limitados conhecimentos estruturais, funcionais e fisiológicos, em última análise, devido às dificuldades na expressão e purificação dessa classe de proteínas embutidas em membrana. Aqui, demonstramos métodos para obter quantidades de miligramas de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas usando sequências gênicas otimizadas para códons. Em conjunto com uma exploração sistemática do projeto de construção e expressão de alto rendimento, esses protocolos garantem a preservação da integridade estrutural e da atividade bioquímica das proteínas-alvo. Também destacamos etapas críticas na expressão de células eucarióticas, purificação de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho dessas proteínas. Em última análise, esse fluxo de trabalho produz preparações proteicas puras, funcionalmente ativas e estáveis adequadas para determinação de estrutura de alta resolução, estudos de transporte, ensaios de engajamento de moléculas pequenas e triagem in vitro de alto rendimento.
Introdução
As proteínas de membrana têm sido alvos de pesquisadores e indústrias farmacêuticas. Destes, os portadores de solutos (SLCs) são uma família de mais de 400 genes transportadores secundários codificados dentro do genoma humano1. Esses transportadores estão envolvidos na importação e exportação de inúmeras moléculas, incluindo íons2, neurotransmissores3, lipídios 4,5,6,7,aminoácidos8, nutrientes
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Protocolo
NOTA: Todos os genes RESOLUTE SLC otimizados para códons foram depositados no AddGene43, cujos links estão disponíveis na lista de reagentes públicos RESOLUTE44. Esses genes foram clonados no plasmídeo pDONR221 e permitem a clonagem direta dos genes no vetor de destino usando clonagem de recombinação45. Para maximizar o paralelismo, células bacterianas, de insetos e de mamíferos são cultivadas em formato de bloco para produção de bacmid (seção 3), amplificação de baculovírus (seção 5) e teste de expressão (seção 6), respectivamente. Para estas etapas, é necessário um agitador de microexpressão par....
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Resultados
Genes SLC podem ser clonados de plasmídeos resolutos pDONR em vetores BacMam para expressão em mamíferos
Os protocolos descritos para clonagem, expressão e purificação provaram ser bem-sucedidos para muitos transportadores SLC em múltiplas dobras proteicas. No entanto, os procedimentos incluem vários pontos de verificação para monitorar o progresso, permitindo a otimização para levar em conta as diferenças na expressão, enovelamento de proteínas, estabilidade dependente de lipídios e detergentes e sen.......
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Discussão
O desenvolvimento de terapias direcionadas para SLC tem permanecido dificultado devido à ausência de caracterização sistemática da função do transportador. Isso levou a um número desproporcionalmente menor de drogas direcionadas a essa classe de proteínas em relação aos GPCRs e canais iônicos63, apesar de seus inúmeros papéis em processos normais e fisiopatológicos. RESOLUTE é um consórcio internacional que visa desenvolver técnicas e ferramentas de pesquisa de ponta para acelerar e melhorar a pes.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi realizado dentro do projeto RESOLUTE. A RESOLUTE recebeu financiamento da Empresa Comum Iniciativa para os Medicamentos Inovadores 2 ao abrigo do acordo de subvenção n.º 777372. Esta Empresa Comum recebe apoio do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia e da EFPIA. Este artigo reflecte apenas a opinião dos autores e nem o IMI, nem a União Europeia e a EFPIA são responsáveis por qualquer utilização que possa ser feita da informação nele contida. O plasmídeo pHTBV foi gentilmente cedido pelo Prof. Frederick Boyce (Harvard).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Protease 3C | Concentradores | ||
| Sartorius | VS0242 | ||
| 5-Ciclohexil-1-Pentil-β-D-Maltosídeo | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| Kit de purificação bacmid de 96 poços | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| Bloco de 96 poços (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Selos plásticos adesivos | Qiagen | 19570 | Tapetes Coluna de |
| cromatografia de exclusão de tamanho de agarose | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Aumento 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produzido internamente | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Hemisuccinato de colesterol Sal de tris | Anatrace | CH210 | CHS Resina de |
| afinidade de metal cobalto | Takara Bio | 635653 | TALON Resina de afinidade de metal |
| D (+) -Biotina | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose coluna de cromatografia de exclusão de tamanho | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Aumento 10/300 GL |
| Digitonina | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tecido moedor (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| coquetel de inibidor de protease sem EDTA | Sigma Aldrich | 4693132001 | coquetel de inibidor de protease completo e sem EDTA Soro |
| fetal | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Colina-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glico-diosgenina | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Colunas de fluxo por gravidade | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 médio | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 médio |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Coluna UHPLC de sílica neutra hidrofílica | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazol | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Reagente de transfecção de insetos | Sigma Aldrich | 71259 | Reagente |
| Lauryl Maltose Neopentil Glicol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Agitador de microexpressão | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-decil-β-D-maltosídeo | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecil-b-D-Maltopiranosídeo | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecil-N,N-Dimetilamina-N-Óxido | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-nonil-β-D-glicopiranosídeo | Anatrace | N324S | NG |
| n-octil-d17-β- D-Glucopiranosídeo | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaetilenoglicol Monododecil Éter | Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octil Glicose Neopentil Glicol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Fosfato Tampolado Salino | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polioxietileno(10)Éter Dodecílico | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polioxietileno (9) éter dodecil | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Vedação porosa para placas de cultura de tecidos | VWR | 60941-084 | Filmes de rayon para culturas biológicas |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Mistura enzimática de recombinação | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Meio de inseto sem soro | Gibco | 10902088 | Sf-900 II mídia sem soro |
| Butirato de sódio | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonda de 24 cabeças Sonicator | Sonics | 630-0579 | |
| Unidade de energia Sonicator | Sonics | VCX 750 | |
| Resina Strep-Tactin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow resina de alta capacidade |
| Sacarose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Monododecanoato de sacarose | Anatrace | S350 | DDS |
| Células HEK293 adaptadas à suspensão | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Reagente de transfecção | Sigma Aldrich | 70967 | Reagente de transfecção GeneJuice |
Referências
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science
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Reimpressões e permissões
