Procedimento de operação e precauções da terapia de acupuntura com incorporação de fios em Alzheimer

Summary

Este estudo apresenta um protocolo para terapia de acupuntura com incorporação de fios em ratos semelhantes à doença de Alzheimer.

Abstract

A terapia de incorporação de fios (TEAT) é um tratamento que previne e gerencia doenças inserindo uma sutura biodegradável em um ponto de acupuntura, proporcionando estimulação duradoura. A TEAT é uma abordagem simples que evita o desconforto da acupuntura regular e proporciona efeitos terapêuticos sustentados. Este artigo discute o impacto potencial do TEAT nas habilidades de aprendizagem e memória de ratos com sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer. Uma vez que a degeneração neuronal induzida quimicamente e as deficiências cognitivas em ratos não refletem inteiramente as verdadeiras alterações patológicas observadas na doença de Alzheimer. Consequentemente, nosso grupo de pesquisa designou essas manifestações como sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer. Um protocolo foi estabelecido para delinear a seleção de pontos de acupuntura, o processo de operação e as precauções necessárias para a cabeça e a região lombar. O experimento foi conduzido em três grupos: um grupo controle, um grupo modelo e um grupo TEA, cada um contendo 6 ratos. Para induzir sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer, os ratos foram injetados intraperitonealmente com D-galactose por 7 semanas (49 dias). Os ratos do grupo TEAT receberam tratamento de incorporação de categute de acupuntura. Após o período de intervenção, um labirinto aquático de Morris (MWM) foi realizado para avaliar o aprendizado e a memória dos ratos. Posteriormente, os ratos foram sacrificados e seu tecido cerebral foi examinado. Um exame histológico foi realizado para entender os efeitos do TEAT na patologia de ratos que apresentavam sintomas da doença de Alzheimer. Este estudo sugere que o TEAT pode melhorar o aprendizado e a memória em ratos com sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer, indicando uma nova abordagem de tratamento potencialmente promissora para essa condição neurodegenerativa.

Introduction

A acupuntura com incorporação de fios (TEA) envolve a incorporação de categute ou suturas absorvíveis em pontos de acupuntura usando uma agulha especial. Esta técnica tem um efeito prolongado até que as suturas sejam absorvidas e degradadas. Ele fornece estimulação contínua e sustentada aos pontos de acupuntura por uma semana ou mais¹, alcançando um resultado comparável sem a necessidade de procedimentos repetitivos diários². Isso reduz o número de pacientes que procuram tratamento médico, conservando assim os recursos médicos até certo ponto. Nos últimos anos, o TEAT tem sido cada vez mais usado em várias áreas médicas na China, incluindo medicina interna, medicina externa, dermatologia, características faciais, ginecologia e pediatria³. Estudos demonstraram que é eficaz na produção de efeitos confiáveis e de longo prazo para certas doenças crônicas e complexas, como epilepsia⁴ e paralisia do nervo facial⁵. Tem as vantagens de trauma mínimo e operação simples⁶. Além disso, os custos do tratamento do TEAT foram relatados como menores do que os da eletroacupuntura (EA)⁷. Por isso, o TEAT é cada vez mais valorizado na investigação clínica e científica.

A doença de Alzheimer (DA) é uma condição neurodegenerativa que progride com o tempo. Seu processo fisiopatológico começa a se acumular aproximadamente 20 anos antes do aparecimento dos sintomas clínicos, mas seu mecanismo ainda não é totalmente^{compreendido8}. Dada a disponibilidade limitada de medicamentos eficazes para a DA, a pesquisa está cada vez mais focada nos estágios prodrômicos e pré-clínicos da doença⁹. A prevenção é uma estratégia crucial para abordar o desenvolvimento e a progressão da AD ^9,10. Nos últimos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem feito progressos significativos e espera-se que ofereça novas possibilidades de prevenção e tratamento da ^DA11,12. Como um subtipo de acupuntura, o TEAT é preferido a outras terapias devido à sua ampla faixa de tratamento, trauma mínimo, operação simples, baixa frequência de tratamento e eficácia duradoura⁶. A literatura emergente sugere que o TEAT pode beneficiar indivíduos com obesidade^13,14, diabetes¹⁵, insônia¹⁶, osteoporose pós-menopausa¹⁷ e depressão¹⁸, todos fatores de risco para DA. Também melhora a senescência em ratos idosos, regulando a mitofagia², melhora o aprendizado espacial e o comprometimento da memória, alivia os danos patológicos do hipocampo e inibe a resposta inflamatória em ratos com demência vascular (DV)¹⁹. Parecia atraente descobrir se o TEAT também poderia atuar em processos patológicos durante a DA.

A pesquisa atual carece de uniformidade e padronização em vários elementos críticos da operação do TET, incluindo o método de incorporação, ferramenta de incorporação, rosca e período de intervalo de incorporação. Essa falta de padronização afeta a avaliação do efeito da terapia e a exploração de mecanismos relacionados e restringe a promoção e comunicação externas. Pesquisas anteriores^20,21 demonstraram que a administração intraperitoneal de D-galactose (D-gal) pode induzir alterações patológicas semelhantes à doença de Alzheimer em ratos, incluindo degeneração neuronal e deficiências cognitivas. Além disso, a eletroacupuntura no Baihui (GV20) e Shenshu (BL23) demonstrou melhorar efetivamente o declínio cognitivo, mitigar a neuroinflamação e reduzir o dano neuronal. Este estudo toma como exemplo o modelo de ratos semelhantes à doença de Alzheimer para introduzir a seleção de pontos de acupuntura e o processo de operação e precauções do TEAT sob este modelo. Ele discute os elementos operacionais críticos do TEAT em pesquisas experimentais para fornecer uma referência para estudos futuros.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados seguindo o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Gerenciamento e Uso de Animais de Laboratório do Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Hubei. Um total de 18 ratas Sprague-Dawley (SD) de 3 meses de idade, pesando 220-250 g, foram usadas para o teste. Todos os ratos foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a 23 ± 1 °C e umidade de 40%-50%, com livre acesso a comida e água. Após um período de aclimatação de uma semana, durante o qual os ratos foram autorizados a se habituar às condições de laboratório, os experimentos foram iniciados.

1. Desenvolvimento do modelo

1. O desenho experimental é mostrado na Figura 1. Divida aleatoriamente 18 ratas Sprague-Dawley de 3 meses pesando 220-250 g em grupos controle, modelo e TEAT. Cada grupo é composto por 6 ratos.
2. Injetar diariamente D-galactose (D-gal; 120 mg/kg/dia) no grupo modelo e no grupo TEAT diariamente, enquanto o grupo controle recebe injeções de solução salina (120 mg/kg/dia), por 7 semanas (49 dias) na área ventral inferior²². A injeção deve ser administrada diariamente entre 8h00 e 9h00.
3. Pese os ratos no 7º dia de cada semana entre 9:00 e 10:00 da manhã. O experimento teve duração de 49 dias. Enterre os fios a cada 14 dias nos dias 14, 28 e 42^. Fixe o horário para cada incorporação de thread entre 9:00 e 12:00 da manhã.
4. Continuar a administração intraperitoneal de D-galactose por 7 semanas para induzir manifestações patológicas relacionadas à doença de Alzheimer em ratos²².

2. Preparação para o TEAT

1. Esterilize instrumentos cirúrgicos, como tesouras oftálmicas, bandejas e pinças e desinfete. Limpe bem as superfícies do ambiente da sala de cirurgia e desinfete.
2. Prepare a plataforma cirúrgica colocando uma almofada de aquecimento para pequenos animais na superfície, seguida de uma toalha estéril. Em seguida, coloque a placa de operação limpa e desinfetada suavemente em cima, com o lado áspero voltado para cima. Em seguida, ligue a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 32 °C.
3. Para o procedimento, selecione uma agulha de inclusão de fio descartável nº 6 com diâmetro de 0,6 mm e uma sutura cirúrgica absorvível 5-0 (sutura de colágeno) com comprimento de 2 cm. Corte a sutura cirúrgica absorvível 5-0 de 2 cm em pedaços de 0,5 cm e 0,2 cm usando uma tesoura oftálmica. Mergulhe o fio cortado em solução salina a 0,9% e reserve.
4. Lave as mãos com água e sabão por 20 s e depois seque-as. Depois, use luvas estéreis.
5. Anestesiar os ratos com uma injeção IP de hidrato de cloral (300 mg/kg) na região ventral inferior, garantindo que a anestesia seja confirmada quando os animais não responderem em um plano cirúrgico, com base na falta de resposta de um teste de pinça do dedo do pé, e mantendo um estado fisiológico estável. Além disso, para evitar o ressecamento da córnea e possíveis danos enquanto os ratos estão sob anestesia, aplique uma quantidade generosa de pomada veterinária nos olhos, garantindo que eles permaneçam lubrificados durante todo o procedimento.
   NOTA: Recomenda-se anestesiar o rato, pois é doloroso para ele experimentar o piercing.

3. Operação de incorporação de roscas para Baihui (GV 20)

1. Localize o ponto de acupuntura Baihui (GV 20) em ratos no ponto médio direito do osso parietal (Figura 2A). Posicione os ratos para expor totalmente a cabeça, com as orelhas puxadas para a frente para se aproximar do método usado em humanos para conectar as linhas do ápice da orelha. Identifique o ponto Baihui (GV 20) palpando a crista longitudinal central do crânio e identificando a localização aproximadamente em seu ponto médio. Confirme esse ponto de acupuntura ainda mais no nível em que as orelhas entrariam em contato com a cabeça se colocadas planas, alinhando-se com a interseção da sutura sagital e do osso parietal. Use um marcador para marcar Baihui (GV 20).
2. Raspe a área da cabeça ao redor do ponto de acupuntura do rato usando um aparador (geralmente um aparador de barba masculino elétrico).
3. Antes da cirurgia, desinfete os pontos de acupuntura e a pele ao redor aplicando uma solução de iodo a 0,5% em movimentos circulares, começando do centro e movendo-se para fora. Posteriormente, execute um processo de desinfecção tripla: use o iodóforo 3x, cada um seguido de uma aplicação de álcool para garantir a descontaminação adequada e preparar o local para a técnica asséptica.
4. Use uma pinça para prender a sutura cirúrgica absorvível de 0,2 cm embebida em solução salina e coloque-a na extremidade frontal do tubo da agulha. Em seguida, conecte-o ao núcleo da agulha.
5. Aperte a área ao redor do Baihui (GV 20) com o polegar e o indicador em uma mão, enquanto segura a agulha com a outra.
6. Insira a agulha horizontalmente e rapidamente em um ângulo de 15° em relação à superfície da pele, 0,1 cm abaixo do ponto Baihui (GV 20), enquanto pinça a pele (Figura 3A).
7. Depois que a ponta da agulha atingir 0,1 cm acima do ponto Baihui (GV 20), empurre o núcleo da agulha enquanto retrai o tubo da agulha para implantar totalmente a sutura cirúrgica absorvível de 0,2 cm no tecido subcutâneo do ponto de acupuntura (Figura 3B).
8. Remova lentamente a agulha, certificando-se de que nenhuma sutura esteja exposta. Pressione o orifício da agulha com algodão seco estéril por 10 s para evitar sangramento. Se a rosca estiver fora do corpo depois de incorporar a linha nos pontos de acupuntura, extraia-a e opere novamente.

4. Operação de incorporação de rosca para Shenshu (BL 23)

1. O ponto de acupuntura Shenshu (BL 23) em ratos está localizado 5 mm lateralmente à^2ª vértebra lombar (Figura 2B). Primeiro, localize a^6ª vértebra lombar com base no tubérculo do quadril do rato. Em seguida, localize a^2ª vértebra lombar contando quatro corpos vertebrais para cima. Shenshu (BL 23) será 5 mm lateral a ele²³.
   NOTA: A combinação dos pontos de acupuntura Baihui (GV 20) e Shenshu (BL 23) é um conjunto frequentemente utilizado na teoria da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) para a prevenção e tratamento de distúrbios cerebrais. Conforme confirmado por pesquisas anteriores ^20,21, esse emparelhamento de pontos de acupuntura foi estabelecido por sua eficácia.
2. Use um marcador para marcar Shenshu (BL 23). Raspe a área das costas e da cintura ao redor do ponto de acupuntura do rato usando um aparador (geralmente um aparador de barba elétrico).
3. Antes da cirurgia, desinfete os pontos de acupuntura e a pele ao redor aplicando solução de iodo a 0,5% em movimentos circulares, começando do centro e movendo-se para fora. Posteriormente, execute um processo de desinfecção tripla: use o iodóforo três vezes, cada uma seguida de uma aplicação de álcool para garantir a descontaminação adequada e a preparação do local para a técnica asséptica.
4. Use uma pinça para prender a sutura cirúrgica absorvível de 0,5 cm embebida em solução salina e coloque-a na extremidade frontal do tubo da agulha. Em seguida, conecte-o ao núcleo da agulha.
5. Estique a pele com os dedos indicador e médio da mão pressionadora ou com os dedos polegar e indicador. Segure a agulha com a mão perfurante.
6. Insira rapidamente a agulha perpendicularmente no ponto 0.25 cm abaixo do Shenshu (BL 23). Veja a Figura 4A.
7. Após a ponta da agulha atingir 0,5 cm sob a pele, ajustar a ponta da agulha, tornando a direção de inserção centrípeta, formando um ângulo de 45° com a superfície da pele e inserir obliquamente 0,5 cm (Figura 4B).
   NOTA: É importante ter cuidado ao agulhar o Shenshu (BL 23), que está localizado perto do rim. A inserção profunda ou o levantamento e impulso repetidos da agulha podem causar danos. Portanto, recomendamos uma profundidade de inserção de cerca de 0,3-0,6 cm.
8. Empurre o núcleo da agulha enquanto retrai o tubo e implante totalmente a sutura cirúrgica absorvível de 0,5 cm no tecido muscular do ponto de acupuntura (Figura 4C).
9. Puxe lentamente a agulha, garantindo que nenhuma sutura seja exposta. Em seguida, pressione o orifício da agulha com algodão seco estéril por 10 s para evitar sangramento. Se a rosca estiver fora do corpo depois de incorporar a linha nos pontos de acupuntura, extraia-a e opere novamente.

5. Cuidados pós-operatórios

1. No pós-operatório, coloque o rato em uma almofada de aquecimento para pequenos animais ajustada a uma temperatura de 32°C para facilitar a recuperação da anestesia. Certifique-se de que o animal esteja totalmente consciente e que sua condição seja satisfatória antes de devolvê-lo ao seu recinto.
2. Após a cirurgia, observe sinais de respostas inflamatórias estéreis na área afetada dentro de uma semana. Esses sinais podem incluir vermelhidão, inchaço ou secreção semelhante a pus. Normalmente, esses sintomas não requerem nenhum tratamento. No entanto, se houver uma quantidade excessiva de exsudato, drene e desinfete a área afetada. Nesses casos, aplique pomada de eritromicina até que a ferida se recupere totalmente.

6. Teste comportamental e exame histológico

1. Após a intervenção, na semana 8, realizar o experimento Morris Water Maze (MWM) ^2,24 para avaliar suas capacidades de aprendizado e memória. Realize os testes de aprendizagem ao longo de 5 dias, com quatro testes por dia. Em seguida, administre um teste de sonda após 24 horas do último dia de aquisição.
2. Realize comparações estatísticas usando software de análise estatística. Analisar os dados comportamentais da capacidade de aprendizagem por análise de variância (ANOVA) unidirecional e teste post-hoc de Tukey. Avalie a significância dos dados de latência de escape por análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) de duas vias, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni. Um valor de p <0,05 é considerado significativo em todos os testes.
3. Após a avaliação comportamental, anestesiar os ratos como acima e eutanasiar com injeções intraperitoneais de 150 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico.
4. Fixe o cérebro do rato por meio de perfusão usando paraformaldeído a 4% perfundido através do sistema vascular²⁵.
   1. Inserção e fixação da agulha de gavagem
      1. Prepare uma agulha 12G e certifique-se de que esteja reta e adequada para passar pelo ventrículo do rato. Localize o ventrículo do rato, que normalmente é o ventrículo esquerdo, e insira a agulha através dele na aorta ascendente. Esta etapa requer precisão e uma boa compreensão da anatomia do rato.
      2. Uma vez que a agulha esteja no lugar, use um hemostático para prender a agulha de gavagem perto do ponto onde ela entra na aorta. Isso ajudará a prender a agulha e evitar que ela se mova.
      3. Certifique-se de que o grampo esteja apertado o suficiente para segurar a agulha com segurança, mas não tão apertado a ponto de danificar a aorta ou impedir o fluxo sanguíneo. A agulha de gavagem deve permanecer na aorta ascendente durante todo o procedimento para manter a perfusão adequada.
   2. Perfusão com soro fisiológico
      1. Prepare uma seringa de 50cc sem agulha para a perfusão. Prenda a outra extremidade da agulha de gavagem, que está fora do corpo do rato, à seringa cheia de solução salina normal.
      2. Faça uma pequena incisão para cortar o apêndice atrial direito para permitir que o sangue flua para fora do coração. Esta etapa garante que o sangue seja deslocado pela solução salina durante a perfusão.
      3. Comece a injetar a solução salina normal na aorta ascendente a uma taxa constante e constante. Isso eliminará o sangue e preparará os tecidos para a fixação.
      4. Monitore o fluido que sai do apêndice atrial direito e esteja preparado para trocar a seringa conforme necessário para manter uma perfusão contínua com solução salina fresca.
         colocado, prepare-se para perfundir com o fixador.
      5. Substitua a seringa contendo solução salina por outra contendo 4% de paraformaldeído, um fixador comumente usado em histologia. Prossiga com a perfusão usando o paraformaldeído para fixar os tecidos no lugar para posterior processamento e análise.
         NOTA: Ao longo deste procedimento, é crucial manter técnicas assépticas para prevenir infecções e manusear o rato com cuidado para minimizar lesões. Além disso, todo o pessoal envolvido deve ser treinado na técnica para garantir consistência e eficácia.
5. Retirar o cérebro do rato e colocá-lo num frasco de amostra contendo paraformaldeído a 4% durante 24-48 h a 4 °C ^25,26. Realize a desidratação com etanol e o tratamento com xileno passo a passo, seguido de cortes coronais contínuos convencionais (4-5 μm) para medição. Avaliar a morfologia e a perda de neurônios do hipocampo em cada grupo usando coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (200x).
   NOTA: Um exame de necropsia para avaliar lesões gastrointestinais (GI) não foi realizado nos roedores com base na ausência de sinais clínicos indicativos de distúrbios gastrointestinais durante todo o período experimental. Os animais não apresentaram reações adversas evidentes que sugerissem a presença de tais patologias.

Results

Este artigo apresenta o método de operação específico do TEAT em ratos semelhantes à doença de Alzheimer. Ele discute os elementos operacionais críticos do TEAT em pesquisas experimentais para fornecer uma referência para estudos futuros.

TEAT melhora a aprendizagem em ratos com doença de Alzheimer
Conforme ilustrado no fluxograma (Figura 5), durante o período de treinamento adaptativo, observou-se que os ratos de cada grupo observavam o ambiente circundante enquanto nadavam. A análise da velocidade de natação (Figura 6) não mostrou diferença significativa entre os grupos, indicando níveis basais consistentes de velocidade de movimento e percepção visual. Quaisquer diferenças observadas nos resultados experimentais não foram devidas a variações na capacidade de movimento ou percepção visual.

Os ratos foram submetidos a 5 dias de treinamento de busca de plataforma. Na Figura 7A, pode-se observar que as trajetórias de movimento de cada grupo de ratos diferiram nos estágios iniciais e finais do treinamento. No dia 2, a maioria dos grupos de ratos fugitivos nadou aleatoriamente. No entanto, no dia 5, os ratos do grupo de controle nadaram com a direção, enquanto os ratos do grupo modelo nadaram aleatoriamente ao longo da parede da piscina. O movimento dos ratos do grupo TEAT tornou-se mais denso no quadrante alvo. O experimento mediu a latência de escape, com latência mais curta indicando habilidades mais fortes. A Figura 7B mostra que o grupo modelo exibiu habilidades reduzidas de aprendizado e memória em comparação com o grupo controle. No entanto, o grupo TEAT mostrou uma melhora significativa no comprometimento da memória de referência espacial em ratos com patologia semelhante à DA.

TEAT melhora a memória espacial em ratos com doença de Alzheimer
No teste de sonda, o local onde o animal passa o tempo indica viés espacial²⁷. Os ratos usam quatro métodos principais para procurar plataformas: baseado em borda, baseado em random, baseado em tendência e baseado em linear²⁸. Os resultados indicam que cada grupo de ratos empregou diferentes estratégias de busca (Figura 8A). O grupo de controle usou principalmente estratégias de busca linear e direcional, sugerindo uma forte memória e capacidade de lembrar a localização da plataforma. Em contraste, os ratos do grupo modelo exibiram uma estratégia de busca principal semelhante a uma borda, indicando um declínio significativo em sua capacidade de memória. Eles não aprenderam a encontrar a plataforma ou lembrar sua localização. Os ratos do grupo TEAT mostraram uma estratégia de busca baseada em tendências. A densidade da trajetória foi maior no quadrante onde a plataforma original estava localizada, bem como nos quadrantes adjacentes. Isso indica uma melhoria de memória em comparação com o grupo de modelos.

As Figuras 8B e 8C mostram os resultados do tempo de permanência no quadrante da plataforma original e o número de vezes que os ratos cruzaram a plataforma. Os ratos do grupo modelo exibiram uma redução significativa no tempo de permanência no quadrante da plataforma original e no número de vezes que cruzaram a plataforma em comparação com o grupo controle (p <0,01). Em comparação com o grupo modelo, os ratos do grupo TEAT exibiram um aumento significativo no tempo de permanência no quadrante da plataforma original e no número de vezes que cruzaram a plataforma (p <0,01). Esses resultados sugerem que o TEAT pode melhorar o aprendizado espacial e o comprometimento da memória em ratos com patologia semelhante à DA.

O TEAT melhora o envelhecimento do hipocampo em ratos (Figura 9). Em comparação com o grupo controle, os ratos do grupo modelo exibiram alterações patológicas graves, incluindo uma redução significativa no número de células piramidais e seu arranjo irregular. Além disso, condensação nuclear, degeneração neuronal e outras anormalidades foram observadas. No entanto, após o tratamento com TEA, o número de células piramidais do hipocampo em ratos aumentou e ficou mais organizado. Embora alguns núcleos exibissem condensação, a morfologia celular geral parecia mais normal. As células foram mais densamente distribuídas e ordenadas, a coloração citoplasmática foi mais consistente e o edema ao redor das células foi significativamente reduzido. Notavelmente, células piramidais normais foram observadas.

Figura 1: Fluxograma do experimento. Após 1 semana de adaptação (semana 0), o estudo alocou 18 ratos em três grupos: Controle, Modelo e TEAT. Durante as semanas 1 a 7, o grupo controle recebeu injeções de solução salina, enquanto os grupos modelo e TEAT receberam D-galactose. O grupo TEAT também foi submetido à terapia de acupuntura com incorporação de fios nas semanas 2, 4 e 6. Todos os ratos foram submetidos ao teste do labirinto aquático de Morris na semana 8, seguido de eutanásia. Abreviaturas: Adaptar = adaptação, Con = grupo de controle, Mod = grupo modelo, TEAT = grupo de terapia de acupuntura com incorporação de fios, D-gal = D-galactose, MWM = o teste do labirinto aquático de Morris. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A localização do ponto de acupuntura. (A) O ponto de acupuntura Baihui (GV 20) em ratos. Ele está localizado no ponto médio direito do osso parietal. (B) O ponto de acupuntura Shenshu (BL 23) em ratos. Está localizado 5 mm lateral à segunda vértebra lombar. Abreviaturas: GV = Vaso Governador, um conceito da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) que se refere ao meridiano principal que corre ao longo da linha média do aspecto posterior do corpo, BL = Bexiga, representa o Meridiano da Bexiga, que na MTC corresponde ao meridiano Pé-Taiyang, um dos seis meridianos yang, correndo ao longo da parte de trás do corpo e pernas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Operação detalhada de incorporação de roscas do Baihui (GV 20). (A) A agulha é inserida horizontalmente em um ângulo de 15° em relação à superfície da pele, 0,1 cm abaixo do ponto de acupuntura Baihui (GV 20), com a pele comprimida para facilitar o procedimento. (B) Uma vez que a ponta da agulha atinge uma posição 0,1 cm acima do ponto de acupuntura Baihui (GV 20), o núcleo da agulha é empurrado enquanto retrai o tubo da agulha para implantar totalmente a sutura cirúrgica absorvível de 0,2 cm no tecido subcutâneo no ponto de acupuntura. Abreviaturas: GV = Vaso Governador, um conceito da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) que se refere ao meridiano principal que corre ao longo da linha média do aspecto posterior do corpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Operação detalhada de incorporação de fios de Shenshu (BL 23). (A) A agulha é rapidamente inserida perpendicularmente no ponto de acupuntura a uma profundidade de 0,25 cm abaixo do Shenshu (BL 23). (B) Uma vez que a ponta da agulha atinge uma profundidade de 0,5 cm abaixo da superfície da pele, a agulha é redirecionada para o centro do ponto de acupuntura, criando um ângulo de 45° com a pele e, em seguida, inserida obliquamente a uma profundidade de 0,5 cm. (C) Enquanto a haste da agulha é avançada, o tubo é retraído, garantindo a implantação completa de um segmento de 0,5 cm de sutura cirúrgica absorvível no tecido muscular no Shenshu (BL 23) Ponto de acupuntura. Abreviaturas: BL = Bexiga, significa o Meridiano da Bexiga, que na MTC corresponde ao meridiano Pé-Taiyang, um dos seis meridianos yang, correndo ao longo da parte de trás do corpo e das pernas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O fluxograma do teste WMW. O treinamento de adaptação antes do experimento é denotado como Dia 0, durante o qual as capacidades motoras dos ratos são observadas e a velocidade de natação é analisada estatisticamente. Segue-se uma fase de navegação local de cinco dias (dias 1 a 5), onde a latência de escape (latência de escape) é comparada e analisada entre os diferentes grupos. No dia 6, um teste de sonda espacial é realizado para avaliar o tempo gasto no quadrante-alvo (tempo de permanência do quadrante-alvo) e o número de travessias de plataforma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Comparação da velocidade de natação (m/s) entre os grupos. Esta figura delineia as velocidades médias de natação (em metros por segundo) de ratos em vários grupos experimentais, cada um compreendendo seis animais (n = 6). As barras de erro mostram o desvio padrão. Não foram obtidas diferenças entre os grupos, conforme indicado pela ns (p > 0,05). A análise estatística foi realizada por meio do software SPSS, com todos os dados aderindo a uma distribuição normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Os resultados da navegação de lugar da WMW. (A) Este painel apresenta os diagramas de trajetória de movimento representativos, ilustrando os caminhos de navegação de ratos dentro de cada grupo experimental durante os testes de navegação local. (B) A latência de escape, medida em segundos (s), é comparada entre os grupos, sendo cada grupo composto por seis ratos (n=6). A análise estatística foi realizada usando ANOVA de medidas repetidas de duas vias para avaliar os efeitos dentro dos sujeitos ao longo dos testes de navegação e as diferenças entre os sujeitos entre os grupos. Os dados estão em conformidade com as suposições de distribuição normal e são representados como a média do grupo ± desvio padrão. Diferenças significativas são indicadas por asteriscos (*p < 0,05, **p < 0,01) em comparação com o grupo controle e por hashtags (#p < 0,05, ##p < 0,01) em comparação com o grupo modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Os resultados da trilha de sondagem da WMW. (A) O painel exibe diagramas de trajetória de movimento representativos que capturam os comportamentos de exploração espacial de ratos no teste de sonda dentro de cada grupo experimental. (B) Este gráfico compara o tempo de permanência (em segundos, s) dentro do quadrante-alvo entre os grupos, refletindo a retenção de memória dos ratos sobre a localização da plataforma. (C) O gráfico ilustra a frequência (freq) com que os ratos cruzaram a área da plataforma, indicando seu desempenho de memória espacial. Cada grupo foi composto por seis ratos (n=6), e os dados foram analisados estatisticamente usando ANOVA de uma via para avaliar as diferenças entre os grupos. Os dados seguem uma distribuição normal e são apresentados como média ± desvio padrão. Diferenças significativas são indicadas por asteriscos (** p < 0,01) em comparação com o grupo de controle e por hashtags (#p < 0,05, ##p < 0,01) em comparação com o grupo modelo. **p < 0,01 vs. grupo controle, #p < 0,05 vs. grupo modelo, ##p < 0,01 vs. grupo modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Avaliação da coloração de hematoxilina e eosina da região CA1 do hipocampo em grupos de ratos com aumento de 200x. (A) O grupo controle exibe estrutura neuronal típica com células piramidais bem preservadas. (B) O grupo modelo exibe alterações patológicas pronunciadas, caracterizadas por uma diminuição acentuada na densidade de células piramidais, neurônios degenerados com coloração escura e arranjo desordenado. (C) O grupo TEAT demonstra arquitetura hipocampal aprimorada, com um número aumentado de células piramidais que são mais ordenadas e possuem uma morfologia mais normativa. Apesar da condensação nuclear ocasional, as células são mais densamente compactadas, exibem coloração citoplasmática uniforme e mostram uma redução significativa no edema pericelular. A presença de células piramidais normativas é notavelmente observada. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

Tempo de intervenção
A etiologia da DA é complexa e sua patogênese permanece incerta. Atualmente, não há tratamento eficaz para a doença e seu curso é irreversível. Portanto, a comunidade acadêmica chegou a um consenso sobre a importância de focar na prevenção e tratamento da DA. As estratégias de prevenção e tratamento da DA enfatizam a intervenção precoce, seguindo o conceito da MTC de tratar as condições antes que elas ocorram, enfatizando o tratamento antes de seu início, transmissão e recorrência. A pesquisa acumulada em humanos^29,30 e roedores^31,32 mostrou que a intervenção precoce com acupuntura e moxabustão pode alcançar resultados significativos sem efeitos colaterais aparentes, tornando-se um método potencial promissor para prevenir e tratar a DA. Portanto, este estudo administrou tratamento durante o processo de modelagem. O TEAT foi implementado no início da injeção intraperitoneal D-gal.

Seleção de pontos de acupuntura
A DA é uma doença neurodegenerativa grave que afeta principalmente as regiões cerebrais responsáveis pela memória, linguagem, raciocínio e comportamento social. O cérebro (Nao) é considerado o mar de medula (Sui) na MTC. A medula (Sui) é feita de essência (Jing), uma substância única na MTC que se acredita ser a força, vitalidade e resistência constitucionais essenciais do corpo. A essência (Jing) é armazenada principalmente nos rins (Shen). Se a essência do rim (Shen Jing) estiver fraca, o cérebro (Nao) pode não ter nutrição e pode ocorrer comprometimento cognitivo. Portanto, a MTC sugere que tonificar os rins e beneficiar a essência (Jing) pode ajudar a melhorar a função cerebral. O cérebro pode ser diretamente influenciado por certos meridianos, como o vaso governador (GV) e o meridiano da bexiga do pé Taiyang (BL), à medida que entram no cérebro. A combinação do vaso governador (GV) e do meridiano vesical do pé Taiyang (BL) utilizado para prevenção e tratamento da DA é altamente utilizada^33,34. Baihui (GV 20) é um ponto de acupuntura localizado no vértice da cabeça e faz parte do vaso Governador. De acordo com a literatura, em estudos que utilizaram acupuntura e moxabustão para prevenção e tratamento da DA, o Baihui (GV 20) apresenta a maior frequência de ocorrência e é considerado um ponto crítico na fórmula³⁵. O Shenshu (BL 23) é um ponto de acupuntura no meridiano da bexiga do pé Taiyang. Está localizado 1,5 cun lateral à borda inferior do processo espinhoso da segunda vértebra lombar. Como o ponto de transporte de retorno do rim-Shu, pode fortalecer todos os aspectos dos rins, incluindo yin do rim, yang, essência (Jing) e qi. A acupuntura e a moxabustão em Baihui (GV 20) e Shenshu (BL 23) podem melhorar a função cognitiva e aliviar os sintomas da DA de várias maneiras ^36,37.

Intervalo de tempo
Os padrões operacionais do TEAT³⁸ determinam que o intervalo de tratamento e o curso do tratamento devem ser determinados com base na condição da doença e no local de operação selecionado, com um intervalo de 1 semana a 1 mês. O curso do tratamento pode variar de 1 a 5 vezes. Essa sugestão também pode ser seguida em pesquisas experimentais com animais. Com base na literatura revisada³⁹, o tratamento geralmente é administrado uma vez por semana ou a cada 2 semanas, com a maioria dos casos envolvendo 4-8 tratamentos consecutivos. O experimento teve duração de 49 dias, durante os quais os fios foram enterrados no^14º,^28º e^42º dias.

Ferramenta e métodos
Várias ferramentas de incorporação de fios são usadas na pesquisa experimental atual com animais. Estes incluem agulhas descartáveis de incorporação de fios nº 7⁴⁰ ou nº 9⁴¹, agulhas auto-reinventadas e agulha de punção lombar nº 12⁴². As agulhas auto-reinventadas usam seringas nº 5-7 como tubo e uma agulha filiforme apropriada para o núcleo da agulha. A ponta da agulha foi pré-alisada com antecedência. Por exemplo, em um estudo com ratos SD pesando 250 ± 20 g (idade do mês não especificada no texto), escolha a seringa nº 7 e a agulha filiforme de 0,30 x 0,40 mm^43,44. No entanto, as agulhas auto-reinventadas devem ser estritamente desinfetadas, tornando-as incapazes de serem amplamente utilizadas. Se a ponta da agulha for muito grande ou afiada, pode danificar os vasos sanguíneos e os nervos, aumentando a probabilidade de^hematomas. As agulhas de punção lombar, que têm um grande diâmetro e pontas afiadas, são mais propensas a danificar os vasos sanguíneos e os nervos. A agulha de incorporação descartável é a mais utilizada na prática clínica³⁹. É mais conveniente de usar e mais seguro de operar em comparação com agulhas auto-reinventadas e agulhas de punção lombar, tornando-o ideal para TEAT. Além disso, o objetivo do experimento é melhorar a saúde humana. Por conseguinte, os estudos em animais devem refletir a situação clínica. Portanto, é aconselhável usar agulhas descartáveis para incorporação de fios como ferramentas de incorporação de fios.

O categute foi o principal material de rosca usado no TEAT, mas devido à rejeição do tecido e ingredientes derivados de animais, foi substituído por suturas cirúrgicas absorvíveis biossintéticas. As suturas estão disponíveis em vários tamanhos e devem ser combinadas com a agulha, como a nº 7 para suturas 4-0 ou 3-0. Na pesquisa com animais, 3-0⁴¹, 4-0⁴⁶ e 5-0⁴⁷ são usados principalmente. A maioria das suturas tem 1-2 cm de comprimento. No entanto, os roedores têm corpos muito menores do que os humanos, portanto, há uma falta de tamanho apropriado para o tamanho do corpo. Portanto, os pesquisadores devem cortar as suturas em segmentos de 0,2 a 0,5 cm para torná-las adequadas para roedores. Portanto, recomenda-se que as suturas sejam enxaguadas com água destilada limpa e estéril ou soro fisiológico após o corte e antes da imersão para uso posterior ou aplicação imediata para reduzir o risco de infecção⁴⁶.

Alguns estudos propuseram requisitos detalhados para o método de incorporação, como inserir rapidamente agulhas no ponto de acupuntura de cerca de 0,5 cm abaixo do ponto de acupuntura em direção ao ponto de acupuntura⁴⁸. Isso é importante porque os roedores são pequenos. Além de ter tecido muscular abundante em seus membros inferiores, seu tecido subcutâneo e camadas musculares na cabeça, costas e abdômen são relativamente fracos. Portanto, a questão dos pontos de inserção e ângulo de inserção do TEAT na pesquisa com animais precisa ser enfatizada aqui. Ao realizar o TEAT nos membros inferiores de roedores, o agulhamento direto nos pontos de acupuntura é viável. Quanto ao corpo, recomenda-se inserir a agulha abaixo dos pontos de acupuntura (a distância pode ser ajustada de forma flexível de acordo com o comprimento do corpo da linha) usando agulhamento oblíquo (<45°) ou agulhamento plano (<15°) para evitar danos aos órgãos internos.

Potencial do TEAT para a prevenção e tratamento da doença de Alzheimer
Recentemente, pesquisas sobre TEAT estão surgindo, embora seus efeitos e mecanismos permaneçam indefinidos. Como mencionado acima, o TEAT pode melhorar os fatores de risco relacionados à DA, como obesidade^13,14, diabetes¹⁵, insônia¹⁶, osteoporose pós-menopausa¹⁷ e depressão¹⁸. Tem um efeito benéfico no aprendizado e no comprometimento da memória em ratos com DV¹⁹. O TEAT regula o metabolismo lipídico através da via PPAR para melhorar a lesão tecidual em ratos fatigados induzidos pelo exercício⁴⁹ e exerce efeitos anti-inflamatórios e analgésicos em camundongos intermitentes induzidos pelo estresse pelo frio através da via TRPV1⁵⁰. No presente estudo, demonstramos que o tratamento com incorporação de fios em ratos semelhantes à DA pode aliviar os prejuízos de aprendizagem e memória, melhorando a perda de memória espacial e reduzindo as células degeneradas nas regiões CA1 do hipocampo. No entanto, devido à falta de uniformidade e padronização da pesquisa atual em vários elementos críticos da operação do TEAT, incluindo o método de incorporação, a ferramenta de incorporação, o thread e o período de intervalo de incorporação, este artigo discute principalmente os elementos operacionais críticos do TEAT na pesquisa experimental. Esta pesquisa foi apenas uma exploração preliminar do efeito do TEAT na DA, que exigiu muito mais complemento e melhoria no esclarecimento da molécula exata e da interação entre eles. No entanto, ofereceu um novo teste para o inevitável processo de DA, que pode de alguma forma aliviar a pesada carga sobre o sistema público de saúde.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% de soro fisiológico, 4% de paraformaldeído, hematoxilina, eosina Y (solúvel em água), etanol absoluto, 0,01M PBS em pó, xileno, ácido clorídrico, parafina embebida, goma neutra	sinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 sutura cirúrgica absorvível	bodamedical (www.bodamedical.com)
70% de álcool, iodóforo, bola			Usado para desinfecção.
do sigma	C8383		do hidrato de cloral
, corrediças de vidro	O equipamento experimental Co. de Guangzhou Wuqiang, Ltd
Desidratador	Wuhan Junjie JT-12J desidratador
do tecido ESTEIRA LUXE DO CALOR DO TERMOSTATO		Zhenhua	para manter a temperatura corporal dos ratos.
		barba masculino elétrico
Balança eletrônica para pequenos animais (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
pomada de eritromicina	frontpharm
prato			Usado para colocar suturas absorvíveis cortadas.
Pote de esterilização a vapor de alta pressão (YM100Z)		equipamentos médicos Shanghai Sanshen	para esterilização de instrumentos cirúrgicos.
Máquina de gelo (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscópio (BX-53)	Leite em
Usado para o teste MWM.
Sistema de rastreamento de vídeo do labirinto aquático Morris e Software de Análise de Dados (Versão: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 agulha de embutir fios	bodamedical (www.bodamedical.com)
tesouras oftálmicas, bandejas, pinças
Patologia Microtome  (RM 2016)	LEICA, Alemanha
pentobarbital	Alemanha	P11011
marcador			Usado para marcar o ponto de acupuntura.
Facas de corte (R35)	Penas,
			Usado para lavar as mãos.
			estéreis