Method Article

Injeção de espermátide redonda em camundongo

DOI:

10.3791/65898

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January 26th, 2024

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1Center of Reproductive Medicine, First Hospital of Jilin University, 2Center of Prenatal Diagnosis, First Hospital of Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método para realizar a injeção redonda de espermátides (ROSI) em camundongos, uma técnica com aplicações clínicas promissoras e utilidade para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As espermátides redondas, caracterizadas por seu conteúdo genético haplóide, representam as células precursoras dos espermatozóides maduros. Através da técnica inovadora de injeção redonda de espermátides (ROSI), os oócitos podem ser fertilizados com sucesso e desenvolvidos em fetos viáveis. Em um marco inovador alcançado em 1995, o primeiro feto de camundongo nasceu por meio da tecnologia ROSI. Desde então, o ROSI emergiu como uma ferramenta fundamental para desvendar os intrincados mecanismos que regem o desenvolvimento embrionário e possui um potencial significativo em várias aplicações, incluindo a aceleração da geração de camundongos e a produção de camundongos geneticamente modificados. Em 1996, um marco foi alcançado quando o primeiro feto humano nasceu por meio da tecnologia ROSI. No entanto, as aplicações clínicas desse método têm mostrado um padrão flutuante de sucesso e fracasso. Até o momento, a tecnologia ROSI não encontrou ampla aplicação na prática clínica, principalmente devido à sua baixa eficiência de nascimento e validação insuficiente da segurança fetal. Este artigo fornece um relato abrangente dos métodos precisos de realização de ROSI em camundongos, com o objetivo de lançar uma nova luz sobre a pesquisa básica e suas potenciais aplicações clínicas.

Introduction

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O estágio final da espermatogênese envolve a transformação de uma espermátide redonda em um espermatozóide totalmente desenvolvido, caracterizado por estruturas distintas de cabeça, pescoço e cauda alongada1. Essa transformação engloba mudanças significativas na morfologia celular, como a condensação da cromatina no núcleo, a substituição de histonas por protamina, a formação de acrossomos, o desenvolvimento da bainha mitocondrial, a migração e perda de centríolos, a formação da estrutura da cauda e a remoção de resíduos celulares2.

Em 1992, o primeiro feto humano nasceu com sucesso por meio da tecnologia de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)3. Desde então, os pesquisadores têm explorado o potencial de utilizar espermátides redondas, que compartilham a mesma composição genética haplóide dos espermatozóides maduros, para fertilizar oócitos e sustentar gestações viáveis 2,4. Posteriormente, em 1996, o primeiro feto humano concebido por meio da tecnologia de injeção redonda de espermátides (ROSI) foi entregue 5,6. Vale a pena notar que os estudos envolvendo ICSI e ROSI em camundongos ficaram atrás daqueles em humanos devido à suscetibilidade da membrana do oócito do camundongo a danos durante o processo de injeção. Este problema foi resolvido com sucesso com a introdução do dispositivo de quebra de membrana Piezo. Consequentemente, em 1995, nasceu o primeiro mouse concebido por meio da tecnologia ROSI. Além disso, pesquisas sobre ROSI em vários outros animais também estão em andamento 7,8.

Atualmente, a pesquisa sobre ROSI se concentra principalmente nos seguintes aspectos: aplicação clínica, elucidação de mecanismos e estratégias para aumentar a eficiência do desenvolvimento, juntamente com aplicações mais amplas da tecnologia ROSI. No contexto das aplicações clínicas, apesar do nascimento do primeiro feto humano ROSI por meio de ROSI em 1996, o progresso foi marcado por uma série de sucessos e fracassos 9,10,11,12. Até o momento, a tecnologia ROSI não alcançou uma implementação clínica generalizada, em grande parte devido à sua baixa eficiência e à necessidade de validação adicional em relação à segurança de fetos concebidos por meio da tecnologia ROSI. Estatísticas incompletas indicam que, globalmente, menos de 200 fetos humanos concebidos por ROSI nasceram. Um ponto de virada na compreensão do potencial da tecnologia ROSI ocorreu em 2015, quando Tanaka e colegas relataram o nascimento bem-sucedido de 14 fetos por meio da tecnologia ROSI, incutindo confiança renovada em sua aplicação clínica e viabilidade13,14. A tecnologia ROSI é uma promessa substancial para enfrentar os desafios da biologia reprodutiva, particularmente em pacientes com azoospermia não obstrutiva. Além de suas aplicações clínicas, o ROSI serve como uma ferramenta valiosa para estudar os intrincados mecanismos do desenvolvimento embrionário15 , 16 , 17 .

Numerosos estudos em animais foram conduzidos para investigar os fatores subjacentes que contribuem para a baixa eficiência do ROSI em alcançar o desenvolvimento embrionário completo. Esses fatores abrangem a escolha de métodos de ativação assistida de oócitos (AOA) e seus tempos, anormalidades na estabilidade genômica e, particularmente, anormalidades nas modificações epigenéticas. É importante reconhecer que as espermátides redondas são células germinativas imaturas, diferindo significativamente dos espermatozóides maduros em vários aspectos fisiológicos. Mizuki Sakamoto e colegas indicaram que H3K27me3, derivado de espermátides redondas, está associado à cromatina que é menos acessível e leva a uma expressão gênica prejudicada em embriões ROSI18. Em um estudo relacionado de Jing Wang e colegas, defeitos de reprogramação em embriões ROSI nos estágios pró-nucleares foram predominantemente associados à expressão incorreta de uma coorte dos genes responsáveis pela ativação do genoma zigótico menor19. Eles também descobriram que a introdução de um inibidor seletivo da histona lisina metiltransferase 2 eucromática, A366, poderia potencialmente aumentar a taxa geral de desenvolvimento em aproximadamente duas vezes.

O camundongo é um dos animais modelo mais valiosos para estudar o desenvolvimento embrionário. Este artigo explica como realizar o ROSI em camundongos. Este protocolo abrangente abrange a seleção de camundongos adequados, procedimentos detalhados de indução da ovulação, técnicas de AOA, técnicas de injeção e a preparação de camundongos substitutos. Além disso, apresentamos uma análise comparativa dos efeitos de dois regimes de injeção na eficiência do nascimento: AOA seguido de ROSI (A-ROSI; primeiro regime) e ROSI seguido de AOA (ROSI-A; segundo regime). Nosso objetivo é incentivar os pesquisadores a realizar experimentos de ROSI em camundongos com maior precisão, oferecendo suporte mais robusto para sua aplicação clínica e a pesquisa fundamental de mecanismos de desenvolvimento embrionário.

Protocol

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Os camundongos B6D2F1 (C57BL / 6 x DBA / 2), C57BL / 6 e ICR usados neste experimento foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Pequim, China). Todos os tratamentos com animais aderiram aos procedimentos e padrões experimentais aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais do Primeiro Hospital da Universidade de Jilin (número de aprovação: 20200435).

1. Preparação dos reagentes relevantes

  1. Adquira alguns reagentes comercialmente e prepare os reagentes restantes.
    1. Obtenha o M2, um sistema tampão para processamento in vitro de espermátides redondas (RS), espermatozóides e oócitos do fornecedor.
    2. Prepare o meio C.L. Chatot, C.A. Ziomek e B.D. Bavister (CZB) livre de Ca 2+ para AOA seguindo o protocolopublicado anteriormente 20.
    3. Obtenha o meio otimizado de potássio simplex suplementado com aminoácidos (KSOMaa) para cultura de embriões do fornecedor.
    4. Prepare a hialuronidase, com uma concentração de trabalho de 0,1% (1 g / L), dissolvendo 0,1 g de hialuronidase em 1 mL de água embrionária. Pegue 10 μL de solução concentrada de armazenamento e dissolva em 990 mL de M2, que pode ser armazenado a 4 ° C por 1 semana.
    5. Prepare polivinilpirrolidona (PVP), com peso molecular médio de 360.000 e concentração mássica de 12%, dissolvendo 1,2 g de PVP em 10 mL de M2. A solução resultante pode ser conservada a 4 °C durante 1 semana.
    6. Conservar a solução-mãe de citocalasina B (CB) (2 μL), solúvel em 18 μL de DMSO a -20 °C. Pegue 5 μL da solução concentrada de armazenamento e dissolva em 995 mL de M2. A solução resultante pode ser conservada a 4 °C durante 1 semana.

2. Preparação de oócitos

  1. Aclimatar camundongos B6D2F1 fêmeas, com idade entre 6 e 8 semanas, ao novo ambiente por pelo menos 1 semana. Injete por via intraperitoneal 7,5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) às 17h, seguida de 7,5 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) 48 h depois. Certifique-se de que nenhum contato com camundongos machos ocorra após a injeção.
    NOTA: O horário especificado (17h) não é obrigatório. É apenas para conveniência de trabalho. As 14 horas após as 17h são 7h, quando os oócitos estão prontos e a injeção é realizada, portanto, o horário da injeção está programado para a manhã. A hora de início da injeção pode ser ajustada de acordo com a programação diária do laboratório.
  2. Após 14 h de injeção de HCG, eutanasiar os camundongos usando o método de luxação cervical. Abra a cavidade abdominal e localize o útero. Identifique os ovários ao longo do útero e corte as trompas de falópio perto dos ovários usando uma tesoura. Repita o mesmo procedimento do outro lado e coloque as trompas de falópio em M2, que é pré-aquecido a 37 °C com antecedência.
  3. Sob um microscópio vertical (10x), localize a parte aumentada da trompa de Falópio, mostrando uma aparência transparente e inchada. Use uma seringa de 1 mL para prender a trompa de Falópio enquanto corta a parte aumentada, coletando complexos de cumulus coronal de oócitos (OCCCs).
  4. Coloque os OCCCs na solução operacional M2 pré-aquecida contendo 0,1% de hialuronidase e remova as células da granulosa soprando suavemente através de uma pipeta oral.
    NOTA: Mantenha os CCCs em hialuronidase a 0,1% por um curto período, aproximadamente 2 min, se necessário.
  5. Após remover as células da granulosa, transfira o oócito para KSOMaa, enxágue 3x e coloque em uma incubadora de dióxido de carbono para uso posterior (37 ° C, 5% CO2).

3. Preparação de espermátides redondas e espermatozóides

  1. Coletar espermátides redondas e espermatozóides do testículo e epidídimo de camundongos C57BL/6 machos (8-10 semanas), respectivamente.
    1. Para espermatozóides, eutanasiar os camundongos por luxação cervical. Abra a cavidade abdominal, localize o epidídimo próximo ao testículo e excise suavemente com uma tesoura.
    2. Coloque o epidídimo em meio M2 e excise suavemente usando uma seringa de 1 mL para permitir que os espermatozóides fluam sob um microscópio vertical (10x).
    3. Sifão os espermatozóides que fluem e a suspensão de M2 no fundo de um tubo contendo 0,5 mL de M2, permitindo que os espermatozóides fluam rio acima naturalmente. Deixe-os de lado para uso posterior.
    4. Para espermátides redondas, remova os testículos da cavidade abdominal e coloque-os em M2. Corte suavemente a membrana branca usando uma seringa de 1 mL e esprema os túbulos seminíferos enrolados sob um microscópio vertical (10x).
    5. Extirpar cuidadosamente os túbulos seminíferos usando duas seringas de 1 mL. Extrair a suspensão e filtrar com um peneiro de 400 malhas (38 μm).
  2. Centrifugar as células filtradas, rejeitar o sobrenadante e adicionar 200 μL de Hoechst 33342 para coloração, seguido de incubação a 37 °C durante 10 min.
  3. Realize a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para distinguir espermátides redondas de outros tipos de células. Coloque as células coradas em um tubo de citometria de fluxo e faça uma triagem redonda de espermátide.
    1. Diferentes modelos de máquinas de citometria de fluxo têm diferentes parâmetros regulatórios e podem ser comunicados com suporte técnico durante a operação. Como primeiro passo, ajuste a tensão e selecione a população de células de acordo com a dispersão direta (FSS) e a dispersão lateral (SSC; consulte a Tabela Suplementar 1).
    2. Para a segunda etapa, remova as aderências celulares de acordo com o FSC e acione a largura do pulso.
    3. Como terceiro passo, selecione as espermátides haploides redondas alvo. Hoechst 33342 liga-se ao DNA e células com diferentes ploidia exibem diferentes intensidades de fluorescência. Defina o comprimento de onda de excitação para 355. Selecione dois canais de detecção, 460/50 e 670/30, sob laser de comprimento de onda 355 para classificar espermátides redondas. Em seguida, conservar as espermátides redondas separadas num frigorífico a 4 °C para utilização posterior.
      NOTA: Também é possível selecionar diretamente espermátides redondas com base em sua morfologia ao microscópio, mas é necessário treinamento para garantir a precisão da seleção.

4. Injeção redonda de espermátide (ROSI)

  1. Realize o procedimento ROSI usando um microscópio invertido com um sistema de micromanipulação.
  2. Na etapa inicial de preparação, faça as agulhas de retenção e injeção de acordo com o procedimento descrito anteriormente21. Mantenha o diâmetro interno da agulha de injeção entre 6-7 μm, projetada para a extração de espermátides redondas, e para a agulha de retenção, tenha um diâmetro interno de 20 μm para prender o oócito.
  3. Na etapa de preparação subsequente, crie um recipiente de injeção colocando 10 μL de gotículas M2 contendo CB para amolecer os oócitos e 10 μL de gotículas M2 para armazenar espermátides redondas. Use gotículas de PVP para umedecer e limpar as agulhas de injeção.
    NOTA: Adicionar CB aqui não é uma etapa necessária, mas adicionar CB pode melhorar muito a taxa de sobrevivência após a injeção.
  4. Extraia as espermátides redondas usando uma agulha de injeção.
  5. Gire o oócito com uma agulha de retenção, posicionando o corpo polar do oócito na posição de 12 ou 6 horas.
  6. Coloque a agulha de injeção cuidadosamente na posição de 3 horas no oócito, aderindo firmemente à zona pelúcida. Use um dispositivo PiezoXpert para criar um orifício na zona pelúcida. Ajuste a força de pequeno para grande, que é aproximadamente intensidade = 5 e velocidade = 15 aqui.
  7. Avance suavemente a agulha de injeção através da zona pelúcida e entre no oócito horizontalmente. Ao passar pelo centro do oócito, aplique um piezo (intensidade = 1 e velocidade = 1), resultando na ruptura da membrana do oócito e na injeção gradual da espermátide redonda no citoplasma do oócito.
  8. Retire a agulha de injeção e aspire uma pequena quantidade da membrana do oócito perto da abertura para selá-la. Esta etapa é crucial, pois a falha na vedação resultaria em vazamento citoplasmático e morte do oócito.
    NOTA: Vale a pena notar que o ROSI exigiu AOA antes ou depois da injeção de espermátides redondas, que discutimos nas seções subsequentes.

5. Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)

  1. Execute as mesmas etapas para ICSI e para ROSI, com a única diferença sendo o diâmetro da agulha de injeção de ICSI, que mede 9-10 μm.
  2. Coloque espermatozóides em uma pista de PVP para reduzir sua velocidade de natação e facilitar a extração de espermatozóides.
  3. Realize a separação da cabeça e cauda dos espermatozóides para ICSI. Aspire os espermatozóides da cauda e posicione o pescoço dos espermatozóides precisamente na boca da agulha de injeção. Aplique um piezo (vários piezo podem ser usados conforme necessário, intensidade = 5 e velocidade = 15) para separar a cabeça e a cauda dos espermatozóides.

6. Ativação assistida de oócitos (AOA)

  1. De acordo com o protocolo, prepare um meio CZB sem cálcio e magnésio.
  2. Utilizar cloreto de estrôncio hexa-hidratado (SrCl26H2O), com um peso molecular de 266,62, a uma concentração de 10 mM. Para prepará-lo, dissolva 0,26662 g de SrCl26H2O em 1 mL de água embrionária. No momento do uso, adicione 10 μL de solução de armazenamento concentrado a 990 μL de meio CZB livre de Ca2+ e use imediatamente.
  3. Colocar os ovócitos no meio CZB livre de Ca2+ contendo SrCl26H2O para ativação; cada gota tem um volume de 20 μL e 20 oócitos são colocados de cada vez. Incubar por 20 min.
  4. Simultaneamente, estabeleça um grupo para ativação da partenogênese sem injetar espermátides redondas ou espermatozóides. Deve-se notar que o grupo de ativação da partenogênese é mostrado sem análise estatística, e o grupo controle é ICSI.

7. Transferência de embriões

  1. Alojar os camundongos machos e fêmeas ICR ligados em uma proporção de 1:2. Na manhã seguinte, examine os camundongos fêmeas quanto à presença de um tampão vaginal e selecione aqueles com tampão vaginal para transplante.
  2. Injete os embriões transferidos que consistem em embriões de 2 células na manhã anterior e transfira-os na tarde seguinte.
  3. Faça uma incisão nas costas da rata, exponha a gordura branca e os ovários e localize a parte aumentada da trompa de Falópio sob um microscópio vertical (10x).
  4. Use uma seringa de 1 mL para criar uma abertura na parte aumentada da trompa de Falópio e aspire os embriões através de uma pipeta oral. Introduza suavemente os embriões na direção do útero. Suturar a ferida, utilizando modelos 4 x 10 de agulhas curvas com linha, com espessura de 5-0 (0,09-0,11 mm). A sutura é feita em duas camadas, sendo uma camada para o peritônio e uma camada para a pele externa.
  5. Para camundongos substitutos, realize cesarianas com base no cronograma experimental. Eutanasiar os camundongos pelo método de luxação cervical, desinfetar com álcool e abrir a cavidade abdominal. Abra o útero com cuidado e rapidez e abra a cavidade amniótica para mostrar o feto e a placenta. Retire o cordão umbilical e corte do lado próximo ao feto; O feto foi alimentado pelo mesmo período de camundongos lactantes.
    NOTA: Devido à necessidade de calcular as taxas de natalidade, a cesariana é mais precisa em relação à capacidade de produção. No parto natural, a prole pode ser comida pela mãe, resultando em estatísticas imprecisas. A cesariana é realizada em camundongos substitutos transplantados no estágio inicial, e a cesariana por eutanásia é realizada antes do parto.

8. Análise estatística

  1. Use o GraphPad Prism 5 para analisar. Os dados são expressos em média ± DP; P < 0,05 indica diferença estatística e P < 0,01 indica diferença estatística significativa.

Results

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Iniciamos nossa investigação examinando o efeito do AOA na capacidade de desenvolvimento dos embriões. Uma ilustração esquemática do desenho experimental é mostrada na Figura 1A. Antes da injeção de espermatozóides, os oócitos foram submetidos a AOA (A-ICSI) ou permaneceram sem tratamento (ICSI). Dados detalhados sobre o desenvolvimento embrionário são apresentados na Tabela 1. Os resultados não revelaram diferenças significativas nas taxas de clivagem, blastocisto ou natalidade entre os grupos A-ICSI e ICSI (P > 0,05; Figura 1B). Esses achados indicam que AOA usando 10 mM SrCl2 por 20 min não afetou o potencial de desenvolvimento dos embriões.

Foi relatado anteriormente que não havia diferenças perceptíveis na eficiência de desenvolvimento de embriões ROSI selecionados por FACS ou por exame visual direto ao microscópio22. Nossos experimentos empregaram a tecnologia FACS para identificar RS (Figuras 2A, B). Ao microscópio, as espermátides redondas de camundongos tinham aproximadamente 10 μm de diâmetro e exibiam uma estrutura nucléolo semelhante a uma protrusão no meio (Figura 2C). Postulamos que a seleção por meio do FACS é mais precisa do que o exame visual direto ao microscópio. Além disso, a literatura apóia a exploração direta da RS por meio de diferenças morfológicas. Os embriões ROSI foram gerados usando dois métodos distintos: o grupo A-ROSI, onde os oócitos foram submetidos a AOA antes da injeção de espermátide redonda, e o grupo ROSI-A, onde os oócitos foram submetidos a AOA após a injeção de espermátide redonda. O diagrama esquemático do desenho experimental é mostrado na Figura 1C. Notavelmente, não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de clivagem e blastocisto entre os grupos A-ROSI, ROSI-A e ICSI (P > 0,05; Figura 1D). As taxas de blastocisto dos grupos A-ROSI, ROSI-A e ICSI foram significativamente maiores do que as do grupo de ativação (P < 0,05; Figura 1D). No entanto, a taxa de natalidade do grupo ROSI foi menor do que a do grupo ICSI, independentemente de os oócitos terem sido ativados antes ou depois da injeção (P < 0,05; Figura 1D). É importante ressaltar que a taxa de natalidade do grupo A-ROSI foi ligeiramente maior do que a do grupo ROSI-A (Figura 1D). Mais detalhes sobre os dados de desenvolvimento embrionário são apresentados na Tabela 1.

figure-results-1
Figura 1: Os embriões ROSI apresentaram eficiência de desenvolvimento reduzida em comparação com os embriões ICSI. (A) Ilustração esquemática do protocolo experimental avaliando o efeito da ativação no desenvolvimento embrionário da ICSI. Azul = Os oócitos não foram ativados; Amarelo = Oócitos foram ativados. (B) Eficiência de desenvolvimento de embriões derivados de A-ICSI e ICSI. (C) Ilustração esquemática do protocolo experimental para geração de diferentes tipos de embriões. (D) Eficiência de desenvolvimento de embriões derivados de A-ROSI, ROSI-A, A e ICSI. **, P < 0,01. Abreviaturas: A= Ativação E= Dia embrionário; ROSI= Injeção redonda de espermátide; ICSI= Injeção intracitoplasmática de espermatozoides. As barras de erro mostram o desvio padrão. A comparação das taxas é realizada por meio do teste qui-quadrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: As espermátides redondas foram selecionadas por meio de classificação por citometria de fluxo. (A) Um diagrama de classificação por citometria de fluxo foi utilizado para a seleção das espermátides redondas. (B) Imagens representativas mostrando a seleção de espermátides redondas. Barra de escala: 10 μm. Abreviaturas: FSC = Dispersão direta; SSC = dispersão lateral; 355 é o comprimento de onda de excitação; 460/50 e 670/30 são dois canais de detecção sob laser de comprimento de onda 355. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

GruposDesenvolvimento pré-implantaçãoDesenvolvimento pós-implantação
ReplicaTaxa de clivagem (%)Taxa de blastocisto (%)Embriões de 2 células transferidos/ Nº. dos destinatáriosTaxa de natalidade (%)
A-ICSI599.33 (149/150)75.17 (112/149)49/548.98 (24/49)
A-ROSI599.33 (149/150)73.83 (110/149)44/518.18 (8/44) **
ROSI-A598.00 (147/150)64.63 (95/147)45/513.33 (6/45) **
Ativação5100.00 (150/150)12.00 (18/150) **51/50.00 (0/51) **
ICSI598.00 (147/150)73.47 (108/147)46/552.17 (24/46)

Tabela 1. A eficiência do desenvolvimento de embriões derivados de diferentes grupos.

Tabela Suplementar 1. A proporção de diferentes populações de células classificadas por citometria de fluxo. A parte P3 é composta por espermátides redondas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

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Ativação assistida de oócitos
Um pré-requisito crítico para ROSI é a AOA, uma vez que as espermátides redondas sozinhas não podem iniciar a ativação do oócito. Atualmente, o método mais estabelecido em camundongos envolve o uso de cloreto de estrôncio23,24, enquanto a aplicação humana mais avançada emprega ativação elétrica13,14. O momento da ativação do oócito também é de grande importância. Conforme relatado na literatura, a abordagem de ativação mais ideal em camundongos envolve inicialmente ativar o oócito e, em seguida, injetar a espermátide redonda25. Isso contrasta com o processo de fertilização convencional, onde os espermatozoides entram inicialmente nos oócitos, liberando posteriormente a fosfolipase C ζ para ativar o oócito26. Pesquisas especializadas conduzidas por Satoshi Kishigami e colegas enfatizam a capacidade diferencial do ROSI de formar um núcleo masculino em oócitos pré ou pós-ativados. Para atingir uma taxa de produção de descendentes eficiente, ambos os tipos de injeção devem ser realizados antes que os oócitos entrem na fase G125.

O diâmetro da agulha de injeção
No contexto do ROSI, é importante observar que um diâmetro maior da agulha de injeção não se traduz necessariamente em melhores resultados. A agulha de injeção utilizada tem um diâmetro de 6-7 μm, ligeiramente menor que uma espermátide redonda. Portanto, quando uma espermátide redonda é aspirada, a membrana celular é submetida a um efeito de compressão, potencialmente levando à exposição direta do núcleo. Essa exposição direta pode ser propícia à despolimerização e à subsequente formação do pronúcleo masculino27.

Tratamento de vedação
Os oócitos de camundongos exibem menos viscosidade citoplasmática em comparação com outras espécies. Mesmo uma pequena brecha na membrana celular pode fazer com que o citoplasma flua facilmente, resultando em degeneração do oócito28. Para mitigar o risco, após injetar a espermátide redonda no citoplasma do oócito e retirar a agulha de injeção, é imperativo aspirar uma pequena porção da membrana celular próxima à abertura da membrana celular do oócito para selar o espaço, semelhante ao procedimento da ICSI21. Este processo de selagem reduz significativamente o risco de degeneração do oócito.

Aplicação do ROSI como modelo
Além das aplicações clínicas, a tecnologia ROSI tem várias outras aplicações como modelo. Pode acelerar a geração de camundongos vezes29, resgatar a letalidade feminina resultante de uma deleção Xist herdada paternalmente em camundongos17, gerar camundongos após injeção redonda de espermátides em blastômeros partenogenéticos haplóides de duas células15, gerar descendentes de camundongos transgênicos16 e preservar a fertilidade em crianças adolescentes antes do tratamento do câncer30,31. A pesquisa diligente sobre ROSI em camundongos pode contribuir substancialmente para os avanços na pesquisa em saúde reprodutiva.

Limitações do artigo
Este artigo serve como um guia metodológico com várias limitações, incluindo a ausência de uma seleção comparativa direta de RS sob um microscópio para injeção e uma percepção de falta de inovação.

Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesses financeiros ou outros.

Acknowledgements

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Estendemos nossa gratidão a Wenjie Zhao por sua inestimável assistência na classificação de espermátides redondas por meio de citometria de fluxo e a Fang Wang por sua experiência em transferência de embriões de camundongos. Este trabalho recebeu apoio parcial da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jilin (No. YDZJ202301ZYTS461). Agradecemos à Bullet Edits Limited pela edição linguística e revisão do manuscrito.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl22H2O SigmaC7902 Preparação do CZB
Glicose SigmaG6152Preparação do CZB
HEPES-Na (básico) SigmaH3784 Preparação do CZB
Hoechst 33342Beyotime C1025FACS
gonadotrofina coriônica humana (HCG)Ningbo Second Hormone CompanyHCGDrogas promotoras de ovulação
HialuronidaseSigma H3506Removendo células da granulosa ao redor do oócito
KCl SigmaP5405Preparação de CZB
KH2PO4 SigmaP5655 Preparação do CZB
KSOMaaCaisson LabsIVL04-100MLMeio otimizado de potássio simplex suplementado com aminoácidos
L-glutamina SigmaG8540 Preparação do CZB
Fluido operacionalM2SigmaM7167-50ML
MgSO47H2O SigmaM1880Preparação do CZB
Na2-EDTA2H2O SigmaE5134 Preparação do CZB
NaCl SigmaS5886Preparação de CZB
NaHCO3SigmaS5761 Preparação do CZB
Na-lactato 60% xarope d = 1,32 g/LSigmaL7900 Preparação do CZB
Na-piruvato SigmaP4562Preparação do CZB
Pontas de broca piezo (ICSI) Eppendorf piezoXpertRuptura de membrana piezoelétrica
égua grávida gonadotrofina sérica (PMSG)Ningbo Second Hormone CompanyPMSGDrogas promotoras de ovulação
PVA SigmaP8136Preparação de CZB

References

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