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Artigo de método

Otimizando a cultura de células epiteliais primárias de lente de camundongo: um guia abrangente para tripsinização

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DOI:

10.3791/65912

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21 de junho de 2024

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Resumo

As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.

Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.

Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.

Introdução

A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo continuamente fibras da lente ao longo da vida.

A catarata caracteriza-se pela turvação progressiva do cristalino, resultando em distorção e espalhamento da luz, levando ao comprometimento da visão 3,4. Os mecanismos precisos subjacentes à formação da catarata são complexos e multifatoriais, envolvendo vários processos celulares e moleculares, como radiação UV, dano oxidativo e glicação 5,6. Descobriu-se que as LECs contribuem significativamente para o desenvolvimento da catarata, tornando-as um foco vital de pesquisa 1,2,7,8,9.

Além disso, uma das questões mais prementes em oftalmologia atualmente é a incidência relativamente alta de opacificação da cápsula posterior (PCO), também conhecida como catarata secundária. A PCO continua sendo a complicação mais comum após a cirurgia de catarata, afetando até 20-40% dos pacientes adultos e 100% das crianças dentro de 5 anos após a cirurgia10. A PCO é causada principalmente pelas LECs residuais que permanecem na bolsa capsular após a extração da catarata. Essas células sofrem uma transformação fisiopatológica multifacetada, envolvendo não apenas a transição epitélio-mesenquimal (EMT), mas também a diferenciação das LECs em fibras do cristalino, resultando em uma população celular que é uma mistura de LECs, fibras e miofibroblastos11,12,13. As células transformadas proliferam e migram através da cápsula posterior do cristalino, levando à deficiência visual. A compreensão do comportamento e dos mecanismos de controle das LECs em modelos de cultura pode fornecer informações valiosas sobre a prevenção e o manejo da PCO. Portanto, este protocolo de cultivo de LECs apresenta-se como uma ferramenta vital para os pesquisadores oftalmológicos com o objetivo de estudar, compreender e, finalmente, combater essa complicação pós-operatória prevalente.

Para desvendar os meandros da biologia LEC e seu papel na formação de catarata e PCO, é essencial estabelecer sistemas de cultura de células primárias robustos e reprodutíveis. A cultura primária de LEC fornece aos pesquisadores um ambiente controlado para estudar as funções, sinalização e características moleculares de LECs. Além disso, permite a investigação de processos celulares e dos efeitos de diferentes condições experimentais, fornecendo informações valiosas sobre a fisiologia e patologia do cristalino.

Pesquisas anteriores enriqueceram nosso entendimento sobre as técnicas de cultura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Embora esses estudos tenham empregado várias metodologias e produzido achados significativos sobre o comportamento e as características do LEC, um protocolo de videogravação abrangente e acessível para a cultura de LECs está ausente na literatura atual. Essa limitação pode dificultar a capacidade de pesquisadores iniciantes em reproduzir com precisão as técnicas e pode levar a inconsistências e variações nos resultados experimentais. Ao fornecer um protocolo de gravação de vídeo, este artigo de pesquisa visa preencher essa lacuna e fornecer um recurso padronizado que possa aumentar a reprodutibilidade e facilitar a transferência de conhecimento no campo da cultura LEC.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.

1. Preparo do meio de cultura e dissecção do cristalino

  1. Preparar o meio de cultura adicionando 50 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,1 mL de 50 mg/mL de gentamicina a 450 mL de DMEM.
  2. Eutanasiar humanamente camundongos C57BL/6J com menos de 2 semanas.
    OBS: Nós sacrificamos usando o método de inalação de CO2 . Uma taxa de fluxo ótima para sistemas de eutanásia por CO2 deve deslocar 30% a 70% do volume da câmara ou gaiola/min.
  3. Remova suavemente as pálpebras usando tesouras cirúrgicas e aplique uma pressão delicada com pinças curvas em lados opostos da cavidade ocular, fazendo com que o olho se projete para fora. Faça uma incisão cuidadosa na córnea usando a faca de catarata e extraia cuidadosamente o cristalino usando pinças curvas, garantindo que não haja danos ao cristalino ou à sua cápsula.
    NOTA: Tenha cuidado ao executar estas etapas para manter a integridade da cápsula da lente. Devido à natureza delicada da lente, é importante usar ferramentas de dissecação com pontas curvas e rombas para minimizar o risco de danos à lente.
  4. Utilize pinças curvas com pontas rombas para transferir as lentes para uma placa de cultura de tecido plástico de 60 mm preenchida com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecida e estéril de Dulbecco contendo 10 μg/mL de gentamicina.
  5. Enxaguar suavemente as lentes com solução de DPBS contendo 10 μg/mL de gentamicina para remover quaisquer detritos ou contaminantes potenciais, preparar as lentes para processamento posterior e manter um ambiente de cultura estéril.
  6. Para obter um número adequado de LECs, agrupe quatro lentes para uma placa de cultura de 24 poços e seis lentes para uma placa de cultura de 6 poços.

2. Isolamento de LECs

  1. Após concluir o processo de enxágue, coloque a lente em um pedaço de papel de filtro, deixando-a secar.
  2. Quando a lente estiver adequadamente seca, transfira-a cuidadosamente para a tampa de uma placa de Petri em preparação para a remoção da cápsula da lente.
  3. Gire a lente para cima, garantindo que o segmento anterior esteja voltado para cima. Ao usar a pinça para segurar a cápsula anterior, empregue a pinça capsulorrexis na mão dominante para criar uma pequena ruptura na cápsula. Puxe suavemente as duas ferramentas em direções opostas para remover a cápsula e coloque-a em DPBS até que todas as dissecações da lente sejam concluídas.
    NOTA: Para evitar discrepâncias, os pesquisadores devem dissecar prontamente cada cápsula epitelial do cristalino e armazená-las temporariamente em DPBS. Somente após o término de todas as dissecções, as cápsulas são transferidas coletivamente para tripsina mantidas a 37 °C, garantindo uma exposição sincronizada e uniforme.
  4. Transfira cuidadosamente a cápsula da lente para uma placa de 6 poços. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05% em cada poço para iniciar o processo de digestão enzimática.
  5. Agite suavemente a solução de tripsina para garantir uma permeação uniforme. Coloque a placa em uma incubadora de cultura celular e deixe a cápsula ser digerida por 8-10 min a 37 °C.
    NOTA: Esta etapa facilita a quebra do tecido da cápsula do cristalino e a subsequente liberação de células epiteliais individuais.
  6. Após a incubação, pique cuidadosamente a cápsula do cristalino digerido usando uma tesoura dissecante para quebrar quaisquer aglomerados de tecido restantes e promover a separação celular.
    NOTA: O rigor na picagem do tecido é enfatizado para garantir a liberação eficiente de células das cápsulas da lente digerida.
  7. Adicionar 0,5 mL do meio de cultura contendo FBS a 10% para extinguir a tripsina. Transfira as amostras de tecido para um tubo de centrifugação e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
  8. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Use 1 mL de meio de cultura para ressuspender as células e semear as células em uma placa de 24 poços.
  9. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias.

3. Subcultura de LECs

  1. Assim que as células atingirem a confluência, retire o meio da placa de cultura. Proceder à lavagem das células 2x com 1 mL de DPBS.
  2. Adicionar 200 μL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora durante 5 minutos.
  3. Após a incubação, remova as células da incubadora e inspecione-as ao microscópio para confirmar se elas se desprenderam da placa de cultura e começaram a flutuar.
  4. Adicionar 1 mL de meio de cultura e pipetar suavemente as células 3-5x para separar todas as células.
  5. Transfira as células para tubos de centrífuga e centrifugação a 1.000 × g por 5 min.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células no meio de crescimento completo.
  7. Se necessário, conte o número de células usando um hemocitômetro.
  8. Subdividir a suspensão celular na proporção de 1:2 ou 1:3 para fins de subcultivo.
  9. Quando a cultura voltar a se tornar confluente, repita os procedimentos supracitados.
    NOTA: LECs florescem em condições de cultura de alta densidade. Evite diluir excessivamente as células, pois isso pode dificultar seu crescimento.

4. Armazenamento e expedição

NOTA: O número de célula ideal para armazenamento é ~1 × 106.

  1. Lave bem as células 3x com 1 mL de DPBS. Após a lavagem, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA e colocar as células na incubadora por 5 min.
  2. Adicionar 2 mL de meio de cultura completo e transferir a suspensão celular para o tubo de centrífuga e centrifugar a 1.000 × g por 5 min.
  3. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de congelamento composto por SFB 90% e DMSO 10%, visando densidade celular de 1 × 106 células/mL. Transfira a suspensão celular para o criovial.
  4. Mover imediatamente as células para um ambiente de -20 °C por 1 h, seguido de -80 °C durante a noite, antes do armazenamento permanente em nitrogênio líquido.
    NOTA: Se o azoto líquido não estiver disponível, as células podem ser armazenadas a -80 °C após uma hora inicial a -20 °C.
  5. Se for necessário um envio, envie as células no criovial em um pacote com gelo seco para entrega durante a noite.
  6. Após o recebimento das células, garanta a rápida recuperação e coloque as células na subcultura. Se a cultura imediata não for viável, transferir as células para nitrogênio líquido para armazenamento prolongado.
    NOTA: Se as células forem enviadas, certifique-se de que as amostras estejam profundamente enterradas no gelo seco para evitar danos potenciais causados por flutuações de temperatura.

5. Validação de LECs

  1. Placa LECs em pratos de cultura de 35 mm com copos de cobertura e cultivá-los por aproximadamente 48 h.
  2. Lave as células 2x com PBS e fixe as células com metanol frio por 10 min a -20 °C.
  3. Lavar as células fixas por 3 x 5 min com PBS e incubar as células fixas com tampão de bloqueio por 1 h à temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica.
  4. Após o bloqueio, incubar as células durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários (αA-cristalino, γ-cristalino e anticorpos PROX1) diluídos individualmente na proporção de 1:50 em tampão diluente.
  5. Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e incubar as células com o anticorpo secundário diluído 1:100 em tampão diluente por 1 h.
  6. Lavar as células por 3 x 5 min com PBS e corá-las com 5 μg/mL Hoechst 33342 em PBS por 10 min à temperatura ambiente para visualizar os núcleos.
  7. Lavar as células por 2 x 5 min com PBS para remover o excesso de solução corante e capturar imagens fluorescentes das células usando um microscópio de fluorescência usando o canal DAPI para núcleos e canal FITC para αA-, γ-cristalinos e PROX1.

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Resultados

Como mostrado na Figura 2, seguindo esse protocolo, LECs primárias de camundongos C57BL/6J aderiram às placas em um período de 4 h. Notadamente, havia resquícios visíveis de outros tecidos, como cortes da cápsula posterior e células de fibras do cristalino. No entanto, esses elementos não intencionais não se prenderam ao prato e, portanto, poderiam ser removidos com a mudança do meio de cultura. Posteriormente, entre o terceiro e o quinto dia, as LECs iniciaram sua fase de proliferação. O cr...

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Discussão

O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarata e PCO, um...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina-EDTAThermo Fisher#25300054Para dissociação de LECs
Alexa Fluor 488 Anticorpo Secundário Jackson ImmunoResearch# 715-545-150Para validação celular
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch111-605-003Para validação celular
Tampão de diluição de anticorposLicor# 927-60001Para validação celular
Faca de segurança BeaverBeaver-Visitec International# 3782235Para dissecção
de lentesTampão de bloqueioLicor#927-60001Para validação celular
Pinça CapsulorhexisTitan Medical InstrumentsTMF-124Para isolamento da cápsula da lente
DMEMSigma AldrichD6429Para LECs meio de cultura
DMSOSigma Aldrich#D2650Para fazer meio de congelamento 
salina tamponada com fosfato de DulbeccoThermo Fisher#J67802Para dissecção de lentes
Pinças DumontInstrumento Cirúrgico RobozRS-4976Para isolamento de cápsula de lente
EpiCGS-a (opcional)ScienCell4182Para meio de cultura LECs
FBSSigma AldrichF2442Para meio de cultura LECs
Gentamicina (50  mg/mL)Sigma-AldrichG1397Para meio de cultura LECs
Solução Hoechst 33342Thermo Fisher#62249Para validação celular
Tesoura de micro-dissecaçãoInstrumento Cirúrgico Roboz RS-5983Para dissecção de lentes
Pinças Micro-dissecadorasInstrumento Cirúrgico Roboz RS5137 Para dissecção de lentes
PROX1 anticorpoThermo Fisher11067-2-APPara validação celular
Vannas micro-dissecando molaRoboz Instrumento CirúrgicoRS-5608Para isolamento de cápsula de lente
α Anticorpo A-cristalinoSanta Cruzsc-28306Para validação celular 
anticorpo de γ-cristalinoSanta Cruzsc-365256para validação celular
Solução tesoura

Referências

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