Artigo de método

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

DOI:

10.3791/65922

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26 de abril de 2024

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1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, 4HUN-REN-DE Cell Biology and Signaling Research Group

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Resumo

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A imunoterapia baseada em anticorpos monoclonais direcionada a antígenos tumorais é agora um pilar do tratamento do câncer. Um dos mecanismos clinicamente relevantes de ação dos anticorpos é a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), em que o anticorpo se liga às células cancerosas e engaja o componente celular do sistema imunológico, por exemplo, células natural killer (NK), para matar as células tumorais. A eficácia dessas terapias poderia ser melhorada pela identificação de compostos adjuvantes que aumentam a sensibilidade das células cancerosas ou a potência das células imunes. Além disso, interações medicamentosas não descobertas em pacientes com câncer comedicados para condições prévias ou sintomas associados ao câncer podem determinar o sucesso da terapia com anticorpos; portanto, tais interações medicamentosas indesejadas precisam ser eliminadas. Com esses objetivos em mente, criamos um modelo de ADCC para câncer e descrevemos aqui um protocolo simples para encontrar drogas moduladoras do ADCC. Uma vez que modelos 3D, como esferoides de células cancerosas, são superiores a culturas 2D na previsão de respostas in vivo de tumores a terapias anticâncer, co-culturas esferoides de células de câncer de mama HER2+ JIMT-1 que expressam EGFP e NK92. Linhagens celulares CD16 foram montadas e induzidas com trastuzumabe, um anticorpo monoclonal clinicamente aprovado contra o câncer de mama HER2-positivo. Esferoides JIMT-1 foram deixados formar em placas de 96 poços repelentes de células com fundo U. No dia 3, células NK e trastuzumabe foram adicionados. Os esferoides foram então corados com Annexin V-Alexa 647 para medir a morte celular apoptótica, que foi quantificada na zona periférica dos esferoides com um microscópio automatizado. A aplicabilidade de nosso ensaio para identificar moléculas moduladoras do ADCC é demonstrada mostrando que o Sunitinibe, um inibidor da tirosina quinase do receptor aprovado pelo FDA contra câncer metastático, abole quase completamente o ADCC. A geração dos esferoides e os pipelines de aquisição e análise de imagens são compatíveis com a triagem de alto rendimento para compostos moduladores de ADCC em esferoides de células cancerosas.

Introdução

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Os esferoides tumorais multicelulares (STCM) são modelos tridimensionais (3D) amplamente utilizados que se formam devido à tendência das células aderentes em se agregarem e representam uma importante ferramenta para obter informações mecanicistas sobre a biologia das células cancerosas. Eles podem ser gerados a partir de uma ampla gama de tipos celulares por inúmeras técnicas, tais como culturas 3D baseadas em líquido e andaimes1. Sua principal vantagem sobre os modelos 2D monocamada é que eles recapitulam as principais características dos tumores in vivo , ou seja, a organização estrutural e a hipóxia, mimetizando o comportamento biológico das células tumorais, especialmente os mecanismos que levam ao escape terapêutico e à resistência adrogas2. Assim, uma vez que os TCM podem melhorar a previsibilidade da toxicidade e sensibilidade a drogas, eles são amplamente utilizados para estudar cânceres em 3D e poderiam melhorar o desenvolvimento de drogas eficazes para diferentes tipos decâncer3.

Para estudar qualquer doença, há uma necessidade crítica de modelos relevantes e convenientes. A criação de modelos para estudos de imunologia do câncer é um desafio porque o sistema imunológico consiste em vários tipos celulares. Cada tipo de célula tem vários subtipos e um amplo espectro de estados de ativação. Esses diferentes tipos de células imunes interagem com células cancerosas e outros componentes tumorais, influenciando o resultado da doença. Os métodos de cultura de células in vitro 2D falham em recapitular essas interações celulares complexas, pois não têm traduzibilidade e são incapazes de prever a ação de um fármaco no nível do sistema (por exemplo, em tecidos)4,5. Além disso, os modelos de camundongos também têm limitações severas devido às diferenças fundamentais entre os sistemas imunológico humano e murino. Sistemas de cultura 3D podem, portanto, preencher as lacunas atuais nos modelos disponíveis, fornecendo um método alternativo e melhorando nossa compreensão da imunologia do câncer6. Especificamente, modelos esferoides podem ser usados para testar imunoterapias, principalmente para avaliar a eficiência da triagem de drogas e anticorpos terapêuticos para aumentar a infiltração de células imunes e efeitos antitumorais contra os alvos esferoides7. Além disso, o potencial dos TCMS compostos por células em diferentes estados metabólicos e proliferativos para estudar as interações entre células do estroma (por exemplo, linfócitos, macrófagos, fibroblastos) e células cancerosas e para o desenvolvimento de novas estratégias anticâncer tem sido amplamentedemonstrado8. Assim, há uma necessidade vital de corroborar plataformas preditivas e precisas para impulsionar o processo de teste de drogas, levando em consideração a fisiopatologia do microambiente tumoral.

O câncer de mama (CB) é o câncer mais frequente diagnosticado em mulheres no mundo. A classificação clínica dessa doença heterogênea baseia-se na presença de receptores transmembrana, por exemplo, receptores de estrogênio (RE) e progesterona (RP) (coletivamente chamados de receptores hormonais, HR), juntamente com a superexpressão ou amplificação da proteína/oncogene receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Com base na expressão imunoistoquímica desses receptores, quatro subtipos são comumente reconhecidos: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) e triplo-negativo câncer de mama (HR-/HER2-). O grupo HER2+ constitui 10-15% dos casos de CB e é caracterizado por alta expressão de HER2 com ausência de RE e RP, tendo pior prognóstico em relação aos tumores luminais e necessitando de drogas específicas direcionadas contraa proteína HER2/neu9.

O desenvolvimento de CB é um processo de várias etapas, sendo o diagnóstico precoce essencial para o sucesso do tratamento da doença10. No entanto, apesar das opções personalizadas de tratamento do BC recentemente surgidas (por exemplo, terapias endócrinas e de anticorpos anti-HER2), o CB continua a desafiar os oncologistas. Assim como a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia, essas terapias personalizadas também podem ter efeitos adversos graves e os pacientes podem desenvolver resistência a esses agentes, tornando-se um desafio a longo prazo determinar a melhor estratégia11,12. Assim, uma melhor compreensão da interação entre o tumor e seu microambiente é essencial e espera-se que forneça novas direções para o desenvolvimento de novos tratamentos que levem em conta as especificidades dos diferentes subtipos de CB13. Uma nova onda de imunoterapias, tais como conjugados de drogas de anticorpos, terapias adotivas de células T, vacinas e novos anticorpos monoclonais direcionados a HER2 (mAbs) estão sendo estudados em uma ampla população de pacientes com tumores que expressam HER214.

O trastuzumabe, por exemplo, representa uma modalidade de tratamento eficiente para HER2+ CB. Como parte de seu modo de ação, o trastuzumabe medeia atividades dependentes do receptor gama cristalizável de fragmentos (FcγR). Os FcγRs distinguem-se pela sua afinidade pelo fragmento Fc e pela resposta imune que iniciam. A ativação do FcγRIIIa (CD16A) em células natural killer (NK) é crucial para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), enquanto o desencadeamento de FcγRIIa (CD32A) e FcγRIIIa em macrófagos induz fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)15. Estudos em modelos animais mostraram que camundongos sem receptores FcγRI (CD64) e FcγRIII (CD16) foram incapazes de iniciar respostas imunes protetoras contra antígenos tumor-específicos, revelando que o ADCC é provavelmente um importante mecanismo de ação para o mAb Trastuzumabe16.

Uma vez que as células NK recorrem ao Abs ligado às células tumorais para a morte de células cancerosas pelo ADCC, a expressão dos receptores Fc é crítica para um tratamento eficaz com Trastuzumabe17 (Figura 1). Além disso, sua ação é eficientemente balanceada por uma estimulação de receptores ativadores e inibitórios, por exemplo, receptores Killer-cell immunoglobulin-like (KIR)18.

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Gráfico 1. Mecanismo do ADCC no contexto de uma resposta antitumoral. O receptor Fcγ de uma célula natural killer (NK) reconhece a região Fc de um anticorpo, que anteriormente se ligou a um antígeno de superfície em uma célula cancerosa. Essa sinapse imunológica leva à degranulação da célula NK, que libera mediadores citotóxicos como granzimas e perforina. Essas moléculas contribuem para a formação de poros na membrana celular e ativam vias apoptóticas causando morte celular programada da célula-alvo (imagem criada com Biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O desenvolvimento de imunoterapia para HER2+ BC representa um campo em evolução. Neste caso, deve-se considerar interações entre vários componentes do sistema imunológico. Além disso, publicações anteriores testaram extensivamente terapias combinadas envolvendo todos os tipos de terapias tradicionais, imunes ou celulares para identificar combinações sinérgicas19.

Vários modelos 3D de HER2+ BC já foram usados para a descoberta de drogas. Por exemplo, Balalaeva e col. utilizaram esferoides SKBR-3 superexpressando HER2 para avaliar a citotoxicidade da imunotoxina direcionada para HER2 4D5scFv-PE4020. Em outro estudo, um sistema de cultura HER2+ BC baseado em Matrigel 3D foi estabelecido para medir o crescimento celular em resposta ao trastuzumabe e agentes endócrinos21. Esses estudos destacam a importância de modelos esferoides tumorais de células cancerosas HER2 superexpressarem uma estratégia eficaz para melhorar clinicamente as respostasterapêuticas22.

Nosso grupo identificou previamente o Sunitinibe, um inibidor multidirecionado da tirosina quinase, como um inibidor do ADCC dependente de trastuzumabe em células JIMT-1 HER2+ BC em um ensaio de cultura 2D. O estudo revelou que o Sunitinib induz autofagia e prejudica a função de morte das células NK, diminuindo a expressão de HER2 e aumentando a fixação superficial das células JIMT-17.

Aqui estabelecemos um novo modelo 3D esferoide de ADCC (células cancerosas NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) para ser usado para aplicações de triagem de alto rendimento e, a fim de validar os achados acima mencionados, Sunitinib foi usado como um composto modelo. Primeiro, geramos EGFP expressando células JIMT-117 e crescemos esferoides a partir dessas células. O ADCC foi induzido por células NK juntamente com trastuzumabe, e os esferoides foram mantidos em cultura na presença ou ausência de compostos teste por 24 h (Figura 2). A quantificação do ADCC baseia-se na detecção de morte de células cancerosas apoptóticas (coloração da Anexina V) usando um sistema de Análise de Alto Conteúdo.

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Gráfico 2. ADCC em um sistema de co-cultura esferoide 3D. Nossas configurações experimentais são baseadas em um sistema esferoide 3D que pode modelar com mais precisão o microambiente in vivo em comparação com modelos 2D. As células de câncer de mama JIMT-1 EGFP foram semeadas em um fundo repelente de células côncavas para formar um aglomerado celular de forma redonda, chamado esferoide. O ADCC foi então iniciado com a adição do NK92. células natural killer CD16 (relação E:T = 20:1) e um anticorpo monoclonal anti-HER2, o trastuzumabe. O modelo experimental mostrou-se eficiente e facilmente aplicável para a identificação de compostos modificadores do ADCC (imagem criada com Biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Demonstramos que a aquisição de dados dessa maneira pode ser feita em tempo real e é estatisticamente robusta para o uso em rastreamento de alto conteúdo na descoberta de medicamentos contra o câncer. É importante ressaltar que este modelo permite uma validação estendida de um conjunto maior de compostos, e pode ser aplicado a vários ensaios de interesse.

Protocolo

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1. Configuração do modelo esferoide de proteína fluorescente reforçada por JIMT-1 (EGFP)

  1. Para formar um fundo repelente de células em forma de U, revestir a placa de 96 poços com solução de agarose-PBS a 0,5% (30 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante aproximadamente 30-45 min.
  2. Lavar as células JIMT-1-EGFP duas vezes com 2 mL de PBS estéril (a geração da linhagem celular JIMT1-EGFP foi relatada em publicação anterior17). Utilizar frascos de cultura de tecidos T25 e meio JIMT-1 (meio DMEM/F-12 suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB), 0,3 U/mL de insulina (100 UI/mL, Humulin R) e penicilina-estreptomicina a 1%) para a cultura celular.
  3. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA ao balão e incubá-lo por 10 min em incubadora de CO2 .
  4. Toque no balão para verificar se as células JIMT-1 se destacaram após o tempo de incubação.
  5. Use 2 mL de meio JIMT-1 para interromper a digestão e coletar a suspensão celular em um tubo de 15 mL.
  6. Contar as células em uma câmara de Bürker com azul de tripano a 0,4% (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular) e ajustar o número de células para 20.000 células/mL.
  7. Pipetar 100 μL da suspensão celular (2000 células/poço) para cada poço da placa de 96 poços (pré-revestida com solução de agarose-PBS a 0,5%, conforme indicado no ponto 1.1).
  8. Permitir que as células se agrupem durante um tempo de incubação de 3 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2 .
  9. Verifique regularmente o tamanho e a forma dos esferoides com um microscópio invertido.

2. Revestimento da placa HCS

NOTA: Para evitar a fixação de esferoides JIMT-1-EGFP à superfície de vidro da placa, o revestimento da placa de Triagem de Alto Conteúdo (HCS) é crucial (caso contrário, a análise de alto conteúdo não seria possível).

  1. No dia 3 após a indução dos esferoides, revestir a placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços com Pluronic-F127 (0,5% em DMSO, 50 μL/poço) e incubar a placa por 45 min à temperatura ambiente.
  2. Aspirar a solução de revestimento e lavar os poços duas vezes com meio livre de soro DMEM/F-12 (100 μL/poço).

3. Transferência de esferoides para a placa HCS

  1. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira os esferoides em triplicatas para a placa HCS de 96 poços com fundo de vidro.

4. Pré-tratamento de esferoides JIMT-1 EGFP com compostos de ensaio

  1. Adicionar o composto de ensaio (por exemplo, Sunitinib diluído em DMSO a uma concentração de 40 μM) pipetando 10 μL/poço e adicionar 10 μL de meio JIMT-1 fresco aos poços de controlo (CTL).
  2. Incubar a placa durante 1 h numa incubadora CO2 a 37 °C.

5. Indução do ADCC pela adição das células efetoras

NOTA: As células CD16.176V.NK92 (doravante denominadas células NK) foram cultivadas em α-MEM suplementado com 20% de SFB, 1% de MEM-NEAA, 1% de Na-piruvato, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 100 UI/mL de IL-2.

  1. Recolher as células NK do balão num tubo de 15 ml. Contar as células com azul de tripano (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular) e ajustar a densidade celular para a razão efetor / alvo (E:T) de 20:1 (40.000 células NK/poço).
  2. Manchar as células NK com 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL em 1 mL de meio α-MEM NK) e colocá-las em uma incubadora CO2 a 37 °C por 1 h.
  3. Centrifugar as células NK a 150 x g por 3 min à temperatura ambiente duas vezes para lavar o excesso do corante com 1 mL de meio α-MEM.
  4. Ressuspender o pellet de células NK em 1 mL de meio JIMT-1 fresco.
  5. Adicionar as células NK coradas juntamente com o anticorpo anti-HER2 (Ab) (trastuzumabe, dissolvido em H2O destilado estéril) aos esferoides alvo do JIMT-1 pipetando 55 μL/poço de células NK coradas com CTB e 55 μL/poço de 10 μg/mL Ab em meio JIMT-1 (o volume total de tratamento adicionado para o ADCC é de 110 μL/poço e a concentração final de Sunitinib é de 20 μM).
    NOTA: Para a seleção da concentração de Ab e da relação E:T, nos baseamos em nossa publicação anterior17. Experimentos preliminares foram realizados com diferentes relações E:T e concentrações de trastuzumabe para avaliar qual foi o mais efetivo na indução de ADCC em esferoides (Figura Suplementar S1).
  6. Adicionar 110 μL/poço de meio JIMT-1 fresco para poços de controle (CTL).
  7. Incubar a placa durante 24 h numa incubadora de CO2 a 37 °C.
    NOTA: Como as células NK92 são conhecidas por exercerem funções citotóxicas não específicas, para controle use células JIMT-1 co-incubadas com ambas as células NK isoladamente e com um controle de isótipo ou um F(ab')2 Ab. Já o F(ab')2-trastuzumabe (TR-F(ab')2) foi utilizado como LCT negativo. O fragmento TR-F(ab')2 foi preparado conforme relatado por Tóth et al.19 e adicionado no mesmo volume que o trastuzumabe juntamente com células NK conforme descrito em 5.5. A concentração foi ajustada para 6,6 μg/mL, correspondendo a uma concentração equimolar com Trastuzumabe23.

6. Coloração de esferoides da anexina V-647

  1. Para medir a morte celular apoptótica, corar os esferoides com conjugado Annexin V-Alexa Fluor 647 por 1 h em meio JIMT-1 (1:100) por pipetagem de 50 μL/poço.

7. Exames por imagem

NOTA: A placa é imageada em 24 h após a adição das células efetoras NK às células alvo. Para geração de imagens, um analisador de alto conteúdo e um software de análise de imagem são usados.

  1. Selecione o tipo de microplaca na lista de placas usando a opção Tipo de placa . Use a placa de triagem de alto conteúdo (HCS) de 96 poços.
  2. Selecione o foco automático de dois picos, pois o ensaio é realizado em placas com objetiva de 10x com abertura numérica de 0,3 (NA), usando as opções Autofocus e Objective , respectivamente. Escolha o modo confocal com a opção Modo Opcional e aplique o Binning 2 usando a opção Binning .
  3. Para esferoides de imagem, selecione os canais apropriados usando a opção Seleção de canal . Para detectar as células JIMT-1 transduzidas por EGFP escolha EGFP (tempo de integração 200 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 2,0 μm; ex: 488 nm em: 500-550 nm), e para detectar células apoptóticas use Alexa 647 (tempo de integração 100 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 10,0 μm; ex: 640 nm em: 650-760 nm). Para visualizar as células NK dentro dos esferoides, escolha o seguinte canal: DAPI (tempo de integração 100 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 2,0 μm; ex: 405 nm em: 435-480 nm).
  4. Na opção Seleção de layout , selecione pilhas Z, pois as células nos esferoides tendem a estar em diferentes planos focais do microscópio. 10 planos (com distância de 10 μm) são suficientes para cobrir toda a região esferoide. Defina os valores do primeiro plano e do último plano em 0 μm e 90 μm, respectivamente.
    NOTA: Antes de iniciar a medição, imagens de amostra podem ser tiradas com a função de instantâneo para verificar as configurações corretas.
  5. Defina o número de poços e campos para geração de imagens usando a opção Definir layout .

8. Análise de alto conteúdo (ACS)

NOTA: Analise as imagens com o software Harmony ou exporte imagens para análise usando um software de terceiros preferido. Para a análise da eficiência do ADCC, a intensidade de fluorescência da Anexina V 647 é medida. As células-alvo mortas pelo ADCC aparecem na área periférica dos esferoides. Portanto, as células positivas da Anexina V são medidas neste "anel" esferoide. Para validar esse método, foram realizadas análises com diferentes parâmetros para avaliar qual era o mais confiável e que produzia os melhores resultados (Figura Suplementar S2). Um poço ADCC é mostrado no vídeo para demonstrar passo-a-passo o processo de análise de imagens.

  1. Identifique os esferoides pela fluorescência EGFP das células JIMT-1 usando a opção Localizar regiões de textura e filtre-os por tamanho (> 25.000 μm2).
  2. Remova objetos de borda pela opção Selecionar População .
  3. Uma vez que as células positivas (apoptóticas) da anexina V aparecem na periferia dos esferoides, meça a intensidade da anexina neste "anel" apoptótico, seleccionado pela opção Seleccionar região (borda exterior -90%) para determinar a morte celular apoptótica.
  4. Expresse os valores de intensidade da anexina V como intensidade média.

Resultados

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EGFP expressando células JIMT-1 foram geradas, e esferoides foram cultivados a partir dessas células. O sunitinibe foi usado como um composto de teste, pois foi demonstrado anteriormente que afeta o curso do ADCC17. Os esferoides foram deixados aglomerar por 72 h. No dia 3, 10 μg/mL de trastuzumabe (ou equimolar 6,6 μg/mL TR-F(ab')219) e células NK (20:1) foram adicionados aos esferoides na presença ou ausência de 20 μM de Sunitinib (1 h pré-tratamento), por um tempo total de 24 h. JIMT-1 isolado e JIMT-1 co-incubado com células NK (20:1) foram usados como CTLs. Esferoides foram corados com Anexina V 647 por 1 h para detectar morte celular apoptótica e foram então fotografados com um Analisador de Alto Conteúdo.

Como indicado pela coloração da Anexina V, a adição de células NK juntamente com trastuzumabe às células JIMT-1 causou morte celular nos esferoides tumorais. Células positivas para anexina (apoptóticas) emergiram na zona periférica dos esferoides, como pode ser visto na Figura 3A. Por outro lado, a adição isolada de células NK não resultou em apoptose de células tumorais. Para distinguir entre a capacidade do Trastuzumabe de recrutar ADCC e seu efeito biológico direto, TR-F(ab')2 sem capacidade funcional de ligação FcR foi usado como um controle negativo do Trastuzumabe. Como o TR-F(ab')2 mostrou-se ineficaz nesse modelo (Figura 3B), é provável que o efeito seja mediado pelo ADCC. Além disso, o pré-tratamento com Sunitinib reduziu a coloração de Anexina V nos esferoides, confirmando a resistência ao ADCC induzida por Sunitinibe e revelando a prevenção de morte celular apoptótica em esferoides JIMT-1 co-incubados com células NK e Trastuzumabe.

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Gráfico 3. Detecção de compostos efetores do ADCC em um modelo esferoide 3D. Esferoides tumorais foram gerados com células JIMT-1-EGFP. Após um tempo de incubação de 3 dias, os esferoides foram transferidos para uma placa HCS, previamente revestida com Pluronic F-127 para impedir a fixação celular. No dia seguinte, 10 μg/mL de Trastuzumabe (TR) (ou 6,6 μg/mL de TR-F(ab')2 equimolar como CTL negativo) e NK92. Células CD16 (pré-coradas com Cell Tracker Blue) foram adicionadas aos poços (relação E:T de 20:1), na ausência ou na presença de 20 μM de Sunitinibe (SOL). Esferoides JIMT-1 isolados e esferoides JIMT-1 co-incubados com células NK (20:1) foram usados como CTLs. (A) Após um tempo de incubação de 24 h, a Anexina V 647 (cor vermelha) foi usada para corar os esferoides por 1 h para visualizar as células apoptóticas. (B) Imagens de 3 esferoides/condição foram obtidas e analisadas quanto à intensidade de fluorescência da Anexina V 647 na área periférica dos esferoides (região do anel). O histograma mostra 4 experimentos independentes (média±MEV). Os dados foram analisados com o teste de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: não significante). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estes dados confirmam que o Sunitinib inibe o ADCC. Espera-se que os compostos de reforço do ADCC sejam identificados de forma semelhante. Em resumo, nosso ensaio HCS pode ser adequado para a identificação de compostos que afetam o ADCC.

Figura suplementar S1. Otimização da relação E:T e da concentração de trastuzumabe. Células JIMT-1-EGFP foram usadas para gerar esferoides. No dia 3, os esferoides foram transferidos para uma placa HCS e células NK foram adicionadas em diferentes relações E:T (20:1, 40:1 e 60:1) com 10, 20 e 50 μg/mL de trastuzumabe (TR) para ver qual era o tratamento mais eficaz que poderia induzir a morte celular nos esferoides. Controle (JIMT-1-EGFP) foi tratado com meio de cultura de células JIMT-1. (A) Após 24 h, as células foram coradas com Anexina V 647 (cor vermelha) por 1 h e a morte celular apoptótica foi medida com HCA. Os histogramas mostram 3 experimentos independentes (média±MEV). As colunas representam a intensidade da Anexina V 647 em torno dos esferoides JIMT-1. (B) Imagens de 3 esferoides/condição foram analisadas para a intensidade do Anexo V 647 da região do anel. Os dados foram analisados por ANOVA one-way seguida do teste post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: não significante). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2. Avaliação da apoptose de células JIMT-1 em esferoides. Células JIMT-1-EGFP foram usadas para gerar esferoides. No dia 3, os esferoides foram transferidos para uma placa HCS e pré-tratados com 20 μM de Sunitinib (SUN) por 1 h, em seguida, células NK foram adicionadas na relação E:T de 20:1 com 10 μg/mL de Trastuzumabe. Após 24 h, as células foram coradas com Anexina V 647 por 1 h e a morte celular apoptótica foi medida com HCA. Imagens de 3 esferoides/condição foram analisadas para a intensidade da Anexina V 647 (controle: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 células NK+10 μg/mL Trastuzumabe, ADCC+SOL: 20 μM Sunitinibibe+20:1 células NK+10 μg/mL Trastuzumabe). As colunas representam a intensidade da Anexina V 647 em torno dos esferoides JIMT-1 ( anel) (A), em todo o esferoide (B) e em todo o poço (C). Os histogramas mostram 3 experimentos independentes (média±MEV). Os dados foram analisados por ANOVA one-way seguida do teste post-hoc de Tukey (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: não significante). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Apesar das melhorias significativas no tratamento da CB nas últimas décadas, os pacientes ainda desenvolvem regularmente resistência aos medicamentos ou experimentam efeitos colaterais negativos24. A alta morbidade e mortalidade ligadas à CB exigem uma investigação contínua sobre os mecanismos moleculares subjacentes, assim como plataformas robustas de triagem para identificar novas moléculas acionáveis para o desenvolvimento terapêutico25. Essas estratégias requerem ensaios translacionais baseados em cultura celular. Sistemas de cultura tumoral 3D, como esferoides e organoides tumorais, emergiram recentemente como modelos de baixo custo e fácil implementação que representam aspectos chave da fisiopatologia tumoral mais de perto do que as culturas convencionais de monocamadas. Uma dessas características é a interação espacialmente coordenada entre várias células imunes associadas ao tumor e células cancerosas. Isso torna os modelos de co-cultura 3D ferramentas superiores para a triagem de drogas voltadas para moduladores que atuam em células imunes para o tratamento de neoplasias malignas26.

Neste trabalho, introduzimos um novo modelo esferoide para ADCC dependente de trastuzumabe mediado por células NK contra células de carcinoma de mama JIMT-1 e descrevemos um fluxo de trabalho automatizado de imagem e análise para a avaliação da morte de células cancerosas mediadas por células NK. O procedimento foi implementado para um imageador de alto conteúdo e um software de análise de imagens que permitem monitorar a capacidade relevante para a doença das células NK de induzir apoptose de células cancerosas. O inibidor multidirecionado de tirosina quinase Sunitinib como um composto indutor de resistência ao ADCC dependente de trastuzumabe em células JIMT-1 em ensaios de cultura de células 2D foi previamente identificado. O sunitinibe prejudica a função de morte das células NK e induz autofagia, downregulation da expressão de HER2 e aumenta a aderência das células JIMT-17. A fim de validar nosso pipeline de análise de esferoides para identificação de compostos, testamos o Sunitinib como um composto modelo e estamos mostrando que ele pode prejudicar significativamente a capacidade das células NK de matar os esferoides de células cancerígenas reproduzindo o efeito que demonstrou em monocamada.

Nosso método é simples, compreendendo o crescimento de esferoides em placas de cultura de tecidos de 96 poços revestidas com agarose, uma transferência única dos esferoides formados para uma microplaca de fundo de vidro adequada para aplicações de HCS e HCA, a adição de compostos de teste e as células NK coradas separadamente ativadas para matar pela administração de Trastuzumabe, uma coloração de morte celular de etapa única e a análise de microscopia. Nenhuma manipulação severa é aplicada aos poços após o início da co-cultura dos dois tipos celulares e do tratamento medicamentoso para não comprometer a integridade dos esferoides. O ensaio leva apenas 4 dias para ser realizado. O revestimento do fundo de placas de cultura de tecidos de 96 poços com 1% de agarose de baixa fusão como parte do procedimento é uma alternativa barata ao uso de placas de fixação ultrabaixa para evitar que as células JIMT-1 aderam à superfície da placa e promover a organização espontânea das células tumorais em esferoides. Como a captura de imagens não é possível através da almofada de agarose e da superfície plástica em forma de U, os esferoides precisaram ser transferidos para a placa de imagem. Crucial foi a passivação da superfície de vidro da placa HCS com o surfactante bio-inerte, Pluronic-F127, antes da transferência esferoide. Sem essa etapa, os esferoides se espalham no fundo dos poços, dificultando a imagem e a análise.

Uma linhagem de células tumorais humanas expressando de forma estável EGFP foi usada para a formação de esferoides17. O marcador codificado geneticamente oferece fluorescência sustentada durante todo o protocolo, em vez de colorações celulares. A análise não supervisionada da textura do sinal EGFP fornece a base para o reconhecimento do núcleo compacto dos esferoides, que compreende todo o esferoide sem indução de morte celular. Quando células NK foram adicionadas e ADCC foi induzido, a desintegração acentuada dos contornos às vezes representou um desafio para o algoritmo de análise de imagem para delinear o contorno do esferoide. Como as células positivas para anexina V foram encontradas principalmente na periferia dos esferoides, esse problema foi contornado avaliando-se a morte celular em uma região anular periférica gerada pelo módulo de segmentação de imagem embutido do software, estendendo o núcleo esferoide bem definido. O fator de expansão que define o limite externo dessa área foi escolhido para abranger a penumbra de células moribundas, trituradas e dispersas em todos os casos após curadoria visual de centenas de imagens esferoides. A determinação da fluorescência total da área do anel apoptótico nas projeções máximas das imagens Z-stack produziu erros experimentais mais baixos e um efeito ADCC mais pronunciado do que medir toda a área esferoide ou toda a área do poço (Figura Suplementar S2). Etiquetas fluorescentes foram escolhidas para marcar as células BC (EGFP) e detectar morte celular (Alexa 647) para evitar a necessidade de separação do canal. Optou-se por uma leitura final baseada na marcação fluorescente para fosfatidilserina exposta, um marcador apoptótico, em oposição ao monitoramento da diminuição da fluorescência do EGFP para determinar a viabilidade dos esferoides ao longo do tempo, o que poderia ser outra opção. A coloração com anexina permitiu uma identificação mais precisa e sensível da morte celular. Em princípio, é possível melhorar a atual abordagem de coloração unidimensional complementando-a com marcadores adicionais de morte celular mais precisos que podem identificar a modalidade de morte celular (por exemplo, substratos de caspase fluorescente) e o tipo de célula pereceu.

Esse método pode ser alterado com alterações mínimas para estudar outros tipos de células imunes efetoras (macrófagos, células T e células imunes que expressam receptores de antígenos quiméricos [CAR]) e moléculas ativadoras (por exemplo, citocinas, interleucinas). Visando simplicidade, robustez e curto tempo de processamento, não esgotamos as possibilidades que o HCA pode oferecer para este ensaio. Os protocolos de imagem e análise são passíveis de adição de etiquetas fluorescentes adicionais. Este ensaio é adaptável para estudar esferoides mais complexos, adicionando diferentes tipos de células e usando sondas fluorescentes multiplexadas para distinguir esses tipos celulares e marcadores fluorescentes específicos para ligá-los a eventos celulares em curso 4,5. O protocolo pode ser adaptado a qualquer imageador HC e as imagens podem ser analisadas com qualquer software de análise de imagem incorporando um módulo de análise de textura.

Aspecto chave da importância deste protocolo, é o uso de esferoides. Assim, uma série de parâmetros deve ser considerada. Sabe-se que células em cultura 3D apresentam resposta atenuada aos compostos quando comparadas às células cultivadas em monocamadas 21,22. O uso de culturas de células 2D não permite prever a faixa efetiva de concentrações de um agente testado em todo o organismo. Ao montar nosso modelo 3D, testamos concentrações de compostos e relações E:T mais altas do que as relatadas em 2D. Por exemplo, o protocolo foi otimizado aumentando a relação E:T de 2:1 usado em nosso ensaio 2D ADCC17, para 20:1 para os esferoides do câncer. A lógica por trás disso poderia ser que as drogas eram incapazes de penetrar efetivamente no núcleo dos esferoides e afetavam principalmente as células das camadas externas. Por outro lado, o aumento da concentração de trastuzumabe não aumentou ainda mais a resposta do ADCC (Figura Suplementar S1). Essa seleção pode diferir entre linhas de célula e destino. Assim, seria interessante testar esse protocolo em outras linhagens celulares, por exemplo, uma linhagem celular não-HER2 BC, levando em consideração que o nível de expressão de HER2 é um importante determinante da resposta doADCC20.

Em resumo, nosso novo método representa uma plataforma rápida e robusta para analisar o efeito de compostos em um modelo 3D de imunocâncer com potencial para ser usado para triagem de drogas de alto rendimento. Isso destaca a relevância do uso de esferoides HER2+ BC e NK92. As células CD16 melhoram ainda mais a compreensão dos mecanismos moleculares do trastuzumabe, proporcionando assim uma oportunidade de antecipar a eficácia do ADCC dependente de trastuzumabe no potencial terapêutico in vivo27. A busca por novos imunomoduladores antitumorais pode se beneficiar muito deste ensaio. O método pode ser estendido para testes personalizados de quimiossensibilidade de culturas de células tumorais derivadas do paciente. Nós demonstramos que as co-culturas 2D tradicionais usadas nos testes de morte de células imunes e ADCC podem ser convertidas em ensaios esferoides 3D, potencialmente aumentando sua relevância translacional.

Divulgações

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Os autores declararam não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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LV recebeu financiamento do National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 e K147482. Este projeto recebeu financiamento da Rede Húngara de Investigação HUN-REN. As células CD16.176V.NK-92 foram obtidas do Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Filadélfia, PA, em nome da Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), são protegidos por patentes em todo o mundo, e foram licenciados pela Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Os autores agradecem a György Vereb e Árpád Szöőr pela ajuda no uso da linhagem celular NK-92 e do TR-F(ab')2, e pelo aconselhamento técnico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microplacas Cell Carrier Ultra com fundo de vidro de 96 poçosPerkinElmer, Waltham, MA, USALLCpara medições de esferoides
Placas de cultura de tecidos de 96 poçosTPP92096para semeadura de células
&alfa;-MEM médioSigmaM8042em meio NK
AgaroseSigmaA9539para semeadura de esferoides
Anexina V-Alexa Fluo 647 conjugadoInvitrogen-ThermoFisher ScientificA23204para medição de apoptose com células HCS
CD16.176 V.NK-92Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Filadélfia, PA em nome da Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)ATCC CRL-2407para cultura de células
Cell Tracker BlueInvitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA)C2110para coloração de células NK
DMEM / F-12 mediumSigmaD8437em JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418para revestimento de placa HCS antes de transferir os esferoides Soro
fetal bovino (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1-EGFP e NK medium
GlutamineGibco35,050– 061em NK medium
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUApara análise estatística
Harmony softwarePerkinElmer, Waltham, MA, USApara HCA
IL-2Proleukin, Novartis Hungá ria Kft., Budapeste, HungriaPHC0026em meio NK
Insulina (Humulin R)Eli LillyHI0219JIMT-1-EGFP médio
JIMT-1 célulaspara cultura de células
MEM Aminoácidos não essenciais (MEM-NEAA)Gibco11,140- 050em meio NK
Na-piruvatoLonzaBE13-115Eem meio NK
Opera Phenix Equipamento de análise de alto conteúdoPerkinElmer, Waltham, MA, EUAHH14001000para HCA
PBS (solução salina tamponada com posfato)LonzaBE17-517Qpara lavar as células
Penicilina-EstreptomicinaBioseraLM-A4118JIMT-1-EGFP e meio NK
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFPInvitrogen, (Prof. Jó zsef Tfigure-materials-1zsé r, Universidade de Debrecen)para a linha celular JIMT-1-EGFP
Pluronic-F127SigmaP2443para revestir a placa HCS antes da transferência dos esferóides
Malato de sunitinibeSigmaAldrichPZ0012para tratamentos
Trastuzumabe Ab (anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado)Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapeste, HungriaNDC-63459-303-43para tratamentos
Trastuzumab-F(ab')2Presente do Prof. Gyö rgy Vereb e Á rpá d Szö figure-materials-2r Departamento de Biofísica e Biologia Celular, Universidade de Debrecenpara tratamentos
Solução de azul de tripano a 0,4%SigmaT8154para contagem de células
Tripsina-EDTA 1X em PBSBioseraLM-T1706para descolamento de células
6055302 de câncer de mama

Referências

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