Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.
Artigo de método
Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.
A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura fisiológica dinâmica composta por células endoteliais microvasculares, astrócitos e pericitos. Ao coordenar a interação entre o trânsito restrito de substâncias nocivas, a absorção de nutrientes e a depuração de metabólitos no cérebro, a BHE é essencial na preservação da homeostase do sistema nervoso central. A construção de modelos in vitro do BBB é uma ferramenta valiosa para explorar a fisiopatologia de distúrbios neurológicos e criar tratamentos farmacológicos. Este estudo descreve um procedimento para criar um modelo in vitro de células BBB monocamada por semeadura de células bEnd.3 na câmara superior de uma placa de 24 poços. Para avaliar a integridade da função de barreira celular, o voltímetro de células epiteliais convencional foi usado para registrar a resistência elétrica transmembrana de células normais e hipóxicas induzidas por CoCl2 em tempo real. Antecipamos que os experimentos acima fornecerão ideias eficazes para a criação de modelos in vitro de BBB e drogas para tratar distúrbios de doenças do sistema nervoso central.
A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares1. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais 2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervo....
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NOTA: Células endoteliais derivadas do cérebro de camundongos.3 (bEnd.3) foram inoculadas nas câmaras de uma placa de 24 poços para construir um modelo in vitro simples de BBB sob condições específicas de meio. O TEER das células normais e hipóxicas foi medido pelo medidor TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparação da solução
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Este protocolo permitiu o registro das mudanças nos valores de resistência das células de acordo com os parâmetros estabelecidos no resistor transendotelial. A viabilidade de células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas com diferentes concentrações de CoCl2 foi avaliada pelo ensaio CCK-8. O maior dano celular produzido pela CoCl2 foi representado pela menor viabilidade celular. Verificamos que 300 μM de CoCl2 foi significativamente citotóxico in vitro, e essa concentração fo.......
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Um dos órgãos corporais mais desenvolvidos, o cérebro controla uma ampla gama de processos fisiológicos intrincados, incluindo memória, cognição, audição, olfato e movimento27. O cérebro é um dos órgãos mais complicados e doentes do corpo humano ao mesmo tempo. A ocorrência de muitas doenças do sistema nervoso central apresenta tendência crescente ano após ano devido a fatores como poluição do ar, padrões alimentares irregulares e outros fatores 27,28,29.
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Os autores não têm nada a revelar.
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82104533), do Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012) e do Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa transwell de 24 poços | Corning (Corning 3470, 0,33 cm2, 0,4 µ m) | 10522023 | |
| 75 % de etanol | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2023052901 | |
| placa de 96 poços | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 células | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Kit de contagem de células-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Placa de cultura de células (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cloreto de cobalto (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| meio de águia modificado de Dulbecco (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Soro bovino fetal | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contém colágeno IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Leitor de microplacas | Dispositivos moleculares | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicilina-Estreptomicina (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| hipoclorito de sódio | ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd | 2022091501 | |
| Medidor de resistência transmembrana | World Precision Instruments LLC | VOM3 (versão 1.6) |
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