Detecção em tempo real de afinidade dinâmica entre biomoléculas usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR)

Summary

O presente estudo tem como objetivo elucidar o princípio e a metodologia da tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR), que encontra aplicações versáteis em vários domínios. Este artigo descreve a tecnologia SPR, sua simplicidade operacional e sua notável eficácia, com o objetivo de promover uma maior conscientização e adoção dessa tecnologia entre os leitores.

Abstract

A tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) é um método preciso e sensível para detectar vírus, proteínas moleculares patogênicas e receptores, determinar tipos sanguíneos e detectar adulteração de alimentos, entre outras detecções biomoleculares. Essa tecnologia permite a identificação rápida de possíveis ligações entre biomoléculas, facilitando a triagem rápida e não invasiva de vários indicadores sem a necessidade de rotulagem. Além disso, a tecnologia SPR facilita a detecção em tempo real para triagem de drogas de alto rendimento. Neste programa, o campo de aplicação e os princípios básicos da tecnologia SPR são brevemente introduzidos. O processo de operação é descrito em detalhes, começando com a calibração do instrumento e a operação básica do sistema, seguida pela captura de ligantes e análise multiciclo do analito. A curva em tempo real e os resultados experimentais da ligação da quercetina e da calicosina à proteína KCNJ2 foram elaborados. No geral, a tecnologia SPR fornece um método altamente específico, simples, sensível e rápido para triagem de medicamentos, detecção em tempo real de farmacocinética relacionada, detecção de vírus e identificação ambiental e de segurança alimentar.

Introduction

A tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) é uma técnica de detecção óptica que elimina a necessidade de rotular o analito. Ele permite o monitoramento dinâmico e em tempo real da afinidade de ligação quantitativa, cinética e termodinâmica. Essa capacidade de alto rendimento é altamente sensível e reprodutível, permitindo a medição de várias taxas de abertura, taxas de desligamento e afinidade. Além disso, a pequena quantidade de amostra necessária aumenta ainda mais a utilidade desse método ^1,2. O método de detecção biomolecular de respos....

Protocol

NOTA: A curva de detecção experimental completa indica que o processo experimental pode ser categorizado em oito estágios distintos.

1. Preparação da amostra e do tampão

1. Prepare os chips do sensor antes do experimento.
   1. Trate os chips com a solução de piranha (30% H₂O₂: H₂SO₄ = 1: 3; v / v) por 2 min. Em seguida, limpe bem o cavaco com uma grande quantidade de água deionizada e depois mergulhe-o em etanol anidro, deixando-o secar naturalmente.
   2. Em seguida, mergulhe o chip durante a noite em uma solução de 11-mercapto....

Results

Para determinar se a proteína está fixada na superfície do chip, a ordenada (sinal de resposta) do mapa do sensor SPR (Figura 1) é usada, enquanto o deslocamento angular da curva SPR é obtido. A Figura 2 e a Figura 3 mostram a curva SPR da interação entre quercetina e calicosina com a proteína recombinante KCNJ2 na superfície imobilizada da proteína recombinante KCNJ2 após a redução do controle em concentrações que variam de 3,9 μM .......

Discussion

O ciclo de análise da SPR é dividido em quatro etapas. O primeiro estágio, a linha de base, envolve a injeção do tampão. Em seguida, vem o segundo estágio, a captura de ligantes. O chip sensor COOH é ativado com EDC/NHS (1:1) a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. O chip é então desativado usando cloridrato de etanolamina-NaOH 1 M a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. Passando para o terceiro estágio, o método de analito multiciclo. O analito é injetado no canal a uma taxa de fluxo de 20 μL / min.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloridrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)	Reagente de Nan Jing, Nanjing, China	C08296594
Etanol anidro	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	Solução de
	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	49781
Solução de bloqueio	Bosheng Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China	110050
Ácido bromoacético	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	17000
Calicosina	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd., Xangai, China	PM10036
Epicloridrina	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China
Cloridrato de etanolamina	Yuanye Biotech Co., Ltd., Xangai, China	S44235
Glicina-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	3587191
H2SO4	Nantong Zona de Desenvolvimento Industrial de alta tecnologia, China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Humano) Proteína Recombinante	Abnova, West Meijie Technology Co., Ltd., Pequim, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	SX0603
N-Hidroxisuccinimida (NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Xangai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Chip Sensor COOH	Nicoya
Acetato de Sódio	Merck Chemical Technologies Ltd., Xangai, China	229873