Um modelo para exposição experimental de humanos a larvas de carrapatos Ixodes scapularis

Os carrapatos duros (Ixodidae: Acari) são ectoparasitas que se alimentam de sangue obrigatório que ocorrem em todo o mundo e são capazes de transmitir uma ampla gama de patógenos, incluindo bactérias, vírus e parasitas, de grande importância médica e veterinária. Os carrapatos ixodídeos devem permanecer presos ao hospedeiro por dias para completar uma refeição de sangue e têm a capacidade de permanecer presos à pele, evitando o reconhecimento, impedindo a coagulação sanguínea local e facilitando a alimentação a longo prazo ^1,2,3. Estudos em animais demonstraram que hospedeiros não permissivos adquirem resistência a picadas de carrapatos com exposições repetidas a carrapatos, o que pode levar a uma diminuição da capacidade de transmitir um patógeno, enquanto os carrapatos podem parasitar repetidamente hospedeiros permissivos. A resistência adquirida ao carrapato depende da natureza da resposta imune do hospedeiro 4,5,6,7.

As doenças transmitidas por carrapatos são uma ameaça crescente nos Estados Unidos (EUA), com o número de casos relatados mais do que dobrando entre 2004 e 2016 ^8,9. Devido às mudanças climáticas, as distribuições geográficas de diferentes carrapatos continuam a se expandir^10,11. As principais doenças transmitidas por carrapatos nos EUA incluem doença de Lyme, anaplasmose, erliquiose, febre maculosa, rickettsiose, babesiose, tularemia e doença do vírus Powassan⁸. A doença de Lyme, causada pela infecção por Borrelia burgdorferi sensu lato, é a doença transmitida por carrapatos mais comum nos EUA e na Europa¹². Com aproximadamente 476.000 indivíduos diagnosticados com doença de Lyme anualmente nos EUA, há um fardo econômico e de saúde pública para os indivíduos e para a sociedade 13,14,15.

Ixodes scapularis (o carrapato de patas pretas ou veado) é o principal vetor da doença de Lyme, bem como anaplasmose, babesiose, doença de Borrelia miyamotoi e doença do vírus Powassan nos EUA. Outras espécies de carrapatos medicamente importantes nos EUA incluem Amblyomma americanum (carrapato estrela solitária), Dermacentor variabilis (carrapato de cachorro americano), Ixodes pacificus (carrapato de patas pretas ocidental), Dermacentor andersoni (carrapato de madeira das Montanhas Rochosas), Ixodes cookei (carrapato da marmota), Dermacentor occidentalis (carrapato da costa do Pacífico), Rhipicephalus sanguineus (carrapato marrom do cão) e Amblyomma maculatum (carrapato da Costa do Golfo)¹⁶.

O desenvolvimento de um método para expor voluntários de pesquisa a picadas de carrapatos apoia estudos usando o vetor natural para buscar evidências de infecção, um procedimento conhecido como xenodiagnóstico 17,18,19,20,21, e para aprender mais sobre a imunidade induzida pela exposição a carrapatos, o que pode contribuir para a descoberta de uma vacina anti-carrapato ^5,6,7. O procedimento aqui descrito foi desenvolvido e utilizado no primeiro estudo de pesquisa em humanos utilizando larvas de Ixodes scapularis criadas em laboratório para xenodiagnóstico de infecção por B. burgdorferi após antibioticoterapia (NCT01143558), publicado em 2014¹⁹. O sistema foi usado com sucesso em um estudo de fase 2 que investigou se um xenodiagnóstico positivo se correlacionava com a persistência dos sintomas após o tratamento com antibióticos da doença de Lyme (NCT02446626) e em um estudo que explorou a resposta do hospedeiro a picadas de carrapatos (NCT05036707).

Este protocolo de procedimento descreve o processo de criação do curativo de contenção, o procedimento de colocação de carrapatos e o procedimento de remoção de carrapatos, bem como os cuidados no local necessários para manter o curativo de contenção. Os detalhes sobre a colônia de carrapatos I. scapularis livre de patógenos e os procedimentos de exposição a carrapatos usados para os estudos citados acima foram descritos anteriormente^19,22. Esta metodologia oferece uma ferramenta de pesquisa flexível que pode ser adaptada para estudar diferentes aspectos da resposta do hospedeiro humano a picadas de carrapatos, a eficácia dos medicamentos de prevenção de carrapatos, bem como a doença de Lyme e outras doenças transmitidas por carrapatos.

A exposição de voluntários a picadas de carrapatos é um método experimental e deve ser conduzido de acordo com um protocolo de pesquisa clínica aprovado pelas autoridades reguladoras relevantes. Os estudos clínicos (NCT01143558, NCT02446626 e NCT05036707) foram aprovados pelos respectivos conselhos de revisão institucional, conduzidos sob isenções de dispositivos experimentais concedidas pela Food and Drug Administration dos EUA e realizados de acordo com as diretrizes de Boas Práticas Clínicas. Além disso, esses estudos foram registrados com ClinicalTrials.gov e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

1. Preparação do curativo de contenção

1. Para criar um modelo de medição, fotocopie o curativo de contenção hidrocolóide de 3" x 3" ao longo da lateral das linhas de medição (Figura 1A e Tabela de Materiais).
2. Corte o modelo fotocopiado ao longo da linha de 1". Em seguida, corte ao longo da linha de 2", criando um círculo de 2" com um centro de 1" (Figura 1B).
3. Usando este modelo, corte o curativo de espuma não adesiva para criar um círculo de 2" com um centro de 1" (Figura 2A, B e Tabela de Materiais).
4. Usando o mesmo modelo, corte um círculo de 2" no centro do curativo hidrocolóide extrafino de 4" x 4" (Figura 2C,D).
5. Corte a camada hidrocolóide do curativo de contenção de 3" x 3" na linha de 11/2".
6. Puxe para trás o forro de papel da camada hidrocolóide do curativo de contenção para expor o adesivo. Coloque o curativo de espuma cortado dentro do círculo de 2" do adesivo (Figura 3A). Isso garantirá que o curativo de espuma se estenda além da abertura do curativo de contenção. Recoloque o forro de papel na camada hidrocolóide do curativo (Figura 3B).
   NOTA: Essas medidas foram usadas para estudos envolvendo até 10 carrapatos larvais de I. scapularis . Para estudos envolvendo até 30 larvas de carrapatos I. scapularis , o gabarito para o centro de espuma foi cortado entre as marcações de 1" e 11/2" para permitir uma área maior para colocação. As medidas do curativo de contenção podem ser adaptadas de acordo com o desenho do estudo.

2. Colocação de ticks

1. Armazenamento de carrapatos
   1. Armazene os carrapatos larvais de I. scapularis em uma geladeira de grau médico com a temperatura ajustada para 9-10 °C.
   2. Armazene os carrapatos em um frasco coberto com uma tampa de malha para permitir o fluxo de ar adequado. Embale o frasco de carrapatos em um saco plástico lacrado com uma esponja levemente umedecida para manter a umidade e evitar a dessecação.
2. Colocando os carrapatos
   1. Remova os carrapatos da geladeira para permitir que aqueçam até a temperatura ambiente. Os carrapatos podem se tornar ativos em menos de 15 minutos fora da geladeira.
   2. Posicione uma folha branca ao redor da área de posicionamento para visualizar facilmente qualquer marca solta inadvertidamente.
   3. Umedeça uma gaze de 4 "x 4" com água limpa ou soro fisiológico e use-a para limpar a pele do local de colocação. A área deve ser seca ou deixada secar ao ar.
      NOTA: Ao selecionar o local do corpo para a colocação do carrapato, considere áreas que não restrinjam as atividades diárias do voluntário e onde a integridade do curativo possa ser facilmente monitorada pelo participante. Não coloque os carrapatos em áreas onde possam ser esmagados devido à pressão direta (por exemplo, nas costas). Avalie os pelos corporais do participante e, se necessário, apare cuidadosamente os pelos excessivos do corpo com uma tesoura no local do adesivo, evitando danos à pele. Evite usar uma lâmina de barbear para depilação, pois pode aumentar o risco de lesões e infecções na pele.
   4. Quando a pele estiver seca, remova o revestimento adesivo do lado hidrocolóide do curativo preparado e fixe-o firmemente na pele no local de colocação, garantindo que a camada de malha permaneça aberta.
   5. Quebre o cotonete de madeira (consulte a Tabela de Materiais) ao meio para expor as pontas irregulares.
   6. Abra cuidadosamente o frasco de carrapatos.
   7. Usando a extremidade irregular do cotonete de madeira, transfira os carrapatos ativos do frasco e coloque-os na pele dentro do curativo de contenção ( Figura 4A ). Peça a um membro adicional da equipe que monitore o local de colocação do carrapato para garantir que os carrapatos permaneçam dentro do curativo de contenção. Use fita adesiva para prender os carrapatos que escapam do frasco durante este processo.
      NOTA: Quebrar um cotonete de madeira e usar a extremidade irregular é eficaz para manipulação e transferência de carrapatos sem causar danos aos carrapatos. Um pequeno pincel com cerdas macias em uma cor clara também funciona para transferir carrapatos do recipiente para o local da pele.
   8. Uma vez colocado o número especificado de carrapatos para o estudo, remova o revestimento adesivo da camada de malha do curativo de contenção e feche-o sobre a abertura.
   9. Depois de garantir que o adesivo esteja bem preso, aplique o curativo hidrocolóide extrafino de 4" x 4" preparado sobre o curativo de contenção para segurança adicional (Figura 4B).
      NOTA: Informações adicionais sobre a colônia de carrapatos I. scapularis livre de patógenos e a duração dos procedimentos de exposição ao carrapato usados nos estudos citados podem ser encontradas nas seções de métodos dos estudos publicados^19,22.

3. Cuidados com o local

1. Forneça uma cobertura de barreira de água e fita hipoalergênica de 2" (consulte a Tabela de Materiais) para o participante da pesquisa.
2. Forneça instruções para cuidar do local de contenção de carrapatos.
   1. Verifique periodicamente o curativo e monitore as bordas para uma adesão segura à pele. Aplique fita adicional para reforçar as bordas do curativo conforme necessário.
   2. Não coce o local do curativo e evite abrir ou remover o curativo durante o período do estudo.
   3. Evite tomar banho ou mergulhar na água. Além disso, evite banhos quentes e limite a duração do banho. Antes de tomar banho, proteja o curativo de contenção com a tampa de barreira de água fornecida e remova-o após terminar o banho. Seque suavemente o curativo e inspecione-o para garantir que permaneça seguro.
   4. Evite atividades que possam causar transpiração intensa e comprometer a integridade do curativo (por exemplo, exercícios aeróbicos, caminhadas prolongadas).

4. Remoção de carrapatos

1. Preparação de frascos de coleta
   1. Rotule os frascos de coleta de carrapatos com os identificadores desejados (por exemplo, código do estudo, data).
   2. Se for necessária a preservação de carrapatos vivos, faça furos na tampa dos frascos com uma agulha de 20 G. Use uma camada de malha de náilon ou poliéster junto com a tampa para selar o frasco. Coloque um pequeno pedaço de esponja úmida em um saco lacrado com o frasco de carrapatos para manter a umidade.
2. Removendo os carrapatos
   1. Coloque lençóis brancos ao redor do local do curativo e certifique-se de que uma bacia de coleta esteja ao seu alcance.
   2. Usando lenços umedecidos com álcool, remova cuidadosamente o curativo da pele.
   3. Depois de totalmente removido, coloque o curativo na bacia de coleta e examine-o quanto à presença de carrapatos destacados.
   4. Avalie o local de colocação em busca de carrapatos anexados. Os carrapatos que se alimentaram até a repleção se desprenderão (Figura 5A). Para os carrapatos restantes anexados, use uma pinça de ponta fina para remoção (Figura 5B).
   5. Limpe a pele com lenços umedecidos com álcool ou água e sabão.

O estudo demonstrou que o procedimento é seguro e bem tolerado, sendo o evento adverso primário prurido leve no local das picadas, observado em 58% dos procedimentos. Não houve eventos adversos graves relacionados ao procedimento quando se utilizou carrapatos larvais limpos de I. scapularis criados em laboratório19. Nos 43 procedimentos realizados, o percentual médio de recuperação dos carrapatos presos em relação aos carrapatos colocados foi de 45% ± 27% (DP), com percentual mediano de 40% (Figura 6).

A duração exata para os carrapatos larvais de I. scapularis se ligarem aos humanos permanece incerta, pois o tempo desde a colocação do carrapato até a fixação do carrapato não foi observado rotineiramente. Em um caso em que um voluntário de pesquisa foi observado por 2 horas e meia, nenhum dos carrapatos havia se fixado até o final do período. Leva de 4 a 5 dias desde a colocação para que as larvas de carrapatos I. scapularis se alimentem até a reposição19.

Figura 1: Medidas do curativo de contenção. (A) Uma fotocópia do curativo de contenção. (B) O modelo de medição do curativo de contenção criado cortando a fotocópia nas marcações desejadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Criação de curativos de reforço não adesivos e hidrocolóides. (A) Usando o gabarito de medição do curativo de contenção para cortar o curativo de espuma. (B) Um círculo de 2" com um curativo de espuma central de 1". (C) Usando o modelo de medição de curativo de contenção para cortar o curativo hidrocolóide. (D) Um curativo hidrocolóide de 4" x 4" com um centro de 2". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Curativo de contenção. (A) O curativo de espuma no lado adesivo da camada hidrocolóide do curativo de contenção. (B) Curativo de contenção usado para alimentação de carrapatos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Colocação de carrapatos. (A) Transferência de carrapatos para o voluntário de pesquisa. (B) Fixação do curativo de contenção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coleção de ticks. (A) Ticks repletos destacados. (B) Remoção de carrapatos anexados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Recuperação de carrapatos larvais ingurgitados de Ixodes scapularis . Cada ponto representa a porcentagem de carrapatos larvais de I. scapularis ingurgitados recuperados usando o protocolo descrito. A porcentagem média de carrapatos recuperados foi de 45 ± 27 (DP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Dra. Adriana Marques possui uma patente US 8.926.989 B2; e é um consultor científico não remunerado da Global Lyme Alliance e da American Lyme Disease Foundation. Siu Ping Turk e Aleah Eschman não têm uma associação que possa representar um conflito de interesses. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica endosso do governo dos EUA.