Um Guia Prático para a Evolução Quase-Contínua Assistida por Fagos e Robótica

PRANCE é uma combinação de duas poderosas técnicas de evolução dirigida. O primeiro é o PACE¹, uma técnica molecular que acopla rodadas de diversificação e seleção gênica ao rápido ciclo de vida do bacteriófago M13, permitindo que rodadas rápidas de evolução ocorram continuamente em cultura de fagos líquidos. Essa seleção é impulsionada pelo uso de um circuito gênico codificado por plasmídios que acopla a função da proteína em evolução à expressão de pIII, a proteína da camada da cauda de M13, necessária para a propagação do fago, ilustrada na Figura 1. Em nível experimental, a diluição contínua da cultura do fago-líquido permite a seleção contínua. A estringência de seleção pode, portanto, ser modulada tanto no nível do circuito gênico quanto no nível experimental, controlando a taxa de diluição da cultura do fago. O PACE pode, portanto, ser aplicado a qualquer desafio de engenharia de biomoléculas para o qual exista um sensor molecular capaz de detectar a atividade desejada em bactérias E. coli para induzir a expressão de pIII. Aplicações incluem a evolução da ligação proteína-proteína ^2,3,4, ligação proteína-DNA⁵, solubilidade proteica⁶ e inúmeras funções enzimáticas específicas⁷. O segundo é a Evolução Acelerada por Robótica ^8,9, que usa um controlador de feedback para eliminar dois modos de falha comuns da evolução dirigida: a extinção, que ocorre quando o ambiente é muito rigoroso, e a falta de evolução, que ocorre quando o ambiente é muito brando. Ao contrário da passagem seriada de fagos como feita no PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)^7,10, a evolução "quase contínua" acelerada por robótica envolve pipetagem rápida que mantém as culturas na fase média logarítmica, permitindo que as populações experimentem ciclos contínuos de infecção e propagação. Quando essas duas tecnologias são usadas juntas, elas são chamadas de PRANCE, para Phage e Robotics-assisted Near-continuous Evolution⁸, que permite uma evolução contínua robusta, multiplexada e rápida. PRANCE tem sido usado para desenvolver polimerases, tRNAs e amino-acila tRNA sintetase e para fazer controle de feedback durante essas evoluções para melhorar sua velocidade e confiabilidade⁸.

Existem vários detalhes da configuração de hardware e software para PRANCE que permitem o uso de bacteriófago em um robô de manipulação de líquidos. Em vez de usar o software padrão fornecido pelo fabricante do robô, usamos um pacote de software de código aberto baseado em python¹¹, que permite a execução rápida e simultânea e, portanto, a capacidade de manter os biorreatores semicontínuos na fase mid-log. O tempo de afastamento do pesquisador pode ser estendido para vários dias com a autoesterilização rotineira de vários componentes no convés, e isso é conseguido com o controle automático de bombas que podem branquear e enxaguar esses componentes. A contaminação cruzada por fago pode ser eliminada pelo uso de um robô de manuseio de líquidos que não usa pontas de ajuste de força e ajuste cuidadoso das configurações de manuseio de líquidos.

1. Configuração de hardware

NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral dos componentes de hardware de um sistema PRANCE e a Figura 3 para obter fotos desses componentes fisicamente montados.

1. Obtenha o hardware primário para o sistema PRANCE, incluindo um instrumento de manuseio de líquidos, um leitor de placas e bombas auxiliares.
   NOTA: Todos os sistemas PRANCE até o momento foram implementados em instrumentos de manuseio de líquidos de médio a grande porte equipados com braços de pipetagem de 8 canais endereçáveis individualmente, um braço de pipetagem de pistão único de 96 pontas, uma pinça robótica para mover placas, uma estação de lavagem integrada para esterilização de pontas e um leitor de placas integrado capaz de medições de absorbância e luminescência.
2. Configure as estratégias de aquecimento dependendo do modelo e das características do robô de manuseio de líquidos. Use um suporte de placa aquecido ou um controle de clima robô mediado por aquecedor.
3. Estabeleça uma estação de lavagem de pontas para permitir a reutilização da ponta.
   NOTA: Até à data, os sistemas PRANCE têm utilizado estações de lavagem prontas para uso, embora, em princípio, este componente possa ser facilmente construído a partir de componentes de baixo custo.
4. Estabelecer uma fonte de cultura bacteriana mantida em fase logarítmica através da instalação de um biorreator em tempo real funcionando a 37 °C como quimiostático/turbidostato. Alternativamente, pare uma cultura bacteriana log-fase de pelo menos 1 L de volume pré-cultivado a 37 °C em fase logarítmica (OD₆₀₀ entre 0,25 e 0,45) a 4 °C em um refrigerador próximo. Certifique-se de que a cultura, refrigerada ou quente, seja agitada regularmente usando uma placa agitadora ou uma placa de agitação para evitar a sedimentação.
5. Configure as bombas preferidas para integração robótica com o software e os drivers necessários. Implemente o software para permitir que as bombas forneçam quantidades definidas de líquido na ordem de 10-100 mL.
   NOTA: Consulte a Tabela de materiais para bombas usadas nesta implementação e o site do fabricante para obter o software usado para operar essas bombas e documentação sobre como configurá-las. Esse software para as bombas usadas na configuração do PRANCE ilustrada neste manuscrito é fornecido de código aberto no seguinte repositório GitHub, https://github.com/dgretton/std-96-pace o PRANCE requer pelo menos um coletor de três bombas capaz de bombear três canais separados (entregar bactérias ao reservatório bacteriano, entregar água sanitária ao reservatório bacteriano e drenar reservatório bacteriano para resíduos), com a velocidade de cada um calibrado e controlado independentemente. No passado, as pessoas usaram bombas de tanque de peixes e matrizes de bombas hidropônicas, embora, em princípio, qualquer bomba peristáltica controlável por píton possa ser usada. As funções essenciais incluem a capacidade de usar uma garra robótica para transferir placas para dentro ou para fora do leitor, para iniciar uma medição do leitor de placas e para acessar medições.
6. Imprima em 3D os componentes de deck personalizados necessários para o sistema PRANCE, incluindo, no mínimo, o coletor de reservatório/distribuição bacteriano ("waffle"), conforme encontrado no Arquivo Suplementar 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Fixe esses contêineres no convés e calibre suas posições usando o software padrão Liquid Handling Robot. Conecte o reservatório ao conjunto de bombas.
   NOTA: Consulte a documentação do fabricante do robô para obter detalhes de como realizar a calibração, pois ela será dependente do robô. As impressoras 3D baseadas em resina são as mais indicadas; um exemplo do tipo de impressora utilizado é dado na Tabela de Materiais; A resina transparente padrão foi usada com as configurações padrão da impressora.
7. Equipar o sistema com dreno compatível com as recomendações de biossegurança locais.
8. Coloque material de laboratório no convés do Robô de Manuseio de Líquidos, conforme exemplificado na Figura 4.
9. Siga os procedimentos de segurança padrão, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual padrão de laboratório (ou seja, jaleco, luvas e proteção ocular).

2. Preparação do software

1. Instale o software de código aberto usado para controlar robôs de manuseio de líquidos com python¹¹, disponível no repositório PyHamilton de código aberto. https://github.com/dgretton/pyhamilton
2. Modifique e calibre o arquivo de layout do deck para o software do robô Liquid Handling para refletir com precisão as posições do material de laboratório no deck do robô, conforme mostrado na Figura 4.
   NOTA: A configuração usada aqui usa o software fornecido pelo fabricante do robô de manuseio de líquidos, de acordo com a documentação fornecida.
3. Execute o programa do método do robô PRANCE no modo de simulação.
   1. Abra a linha de comando com os seguintes comandos (no sistema operacional Windows), como mostra a Figura 5.
      Tecla Windows + R
      Digite: cmd
   2. Altere o diretório pai para o diretório do programa de método do robô. Digite um comando como abaixo com o caminho correto, conforme mostrado na Figura 5.
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   3. Chame o programa do método do robô com Python com o sinalizador do modo de simulação, como mostrado na Figura 5.
      py robot_method.py --simular
   4. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberta quando o programa for executado (Figura 5).
      NOTA: Certifique-se de que o método PRANCE possa ser executado sem erros na simulação antes de avançar. Torna-se óbvio se o script é capaz de operar no modo de simulação sem erros, pois ele completará vários loops do programa principal sem que o tratamento de erros do sistema seja chamado, o que encerra o loop do programa principal.
4. Execute o programa do método do robô PRANCE com o modo de simulação desativado.
   1. Abra a linha de comando no diretório apropriado (Figura 5).
      Tecla Windows + R
      Digite: cmd
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   2. Chame o programa de método robô com Python sem sinalizadores:
      py robot_method.py
   3. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberta quando o programa for executado.
   4. Confirme se o PyHamilton pode controlar o instrumento e fazer com que ele inicialize.
5. Estabeleça sincronização de dados em tempo real.
   NOTA: Até o momento, os sistemas PRANCE têm usado computadores em rede que permitem aos usuários monitorar os arquivos de log e gráficos de medição do leitor de placas em tempo real por meio de software de compartilhamento remoto de arquivos ou por meio de uma área de trabalho remota.
6. Desative as atualizações automáticas.

3. Preparação pré-corrida

1. Certifique-se de que as fontes de cultura bacteriana em fase logarítmica estejam disponíveis para todas as culturas necessárias para a execução planejada e que estejam sendo ativamente agitadas para evitar a sedimentação. Use um quimiostato ativo/turbidostat ou uma cultura pré-cultivada refrigerada parada de crescimento.
2. Atualize o arquivo de manifesto do controlador com os detalhes de qual volume (faixa de 0-500 μL) de qual cultura bacteriana deve ser bombeada para cada poço da lagoa de 96 poços por ciclo de programa. Isso permite o controle preciso da taxa efetiva de diluição da lagoa. Isso pode ser visto na Figura 6.
   1. Calcule a taxa de diluição da lagoa usando a planilha DilutionCalculator.xlsx (fornecida como Arquivo Suplementar 2), como pode ser visto na Figura 7.
3. Atualize o arquivo robot_method.py com a altura da lagoa pretendida. Para seguir esse protocolo, use 14 (em unidades milimétricas ) como o valor padrão para a variável fixed_lagoon_height no programa. Isso corresponde a um volume de lagoa de 550 μL no sistema, mas pode diferir dependendo da placa particular de 96 poços de profundidade usada.
4. Coloque as pontas de pipeta filtradas limpas no convés do robô em suas posições designadas e tape as prateleiras de ponta nos suportes de ponta para garantir a estabilidade durante a corrida.
5. Coloque placas limpas de poço de 96 profundidades no convés do robô em suas posições designadas.
6. Coloque placas leitoras limpas de 96 poços no convés do robô em suas posições designadas.
7. Certifique-se de que a bandeja do leitor de placas não esteja ocupada por uma placa pré-existente.
8. Verifique se as bombas estão conectadas ao computador e atribuídas ao endereço correto.
9. Limpe as linhas da bomba ativando as bombas para bombear água sanitária e, em seguida, água.
10. Conecte as linhas de bomba às fontes e saídas apropriadas, prestando muita atenção para garantir que as linhas corretas estejam conectadas às culturas bacterianas relevantes.
11. Reabastecer tanques/baldes contendo água sanitária/água para lavagem de reservatório bacteriano e ponta de pipeta.
12. Certifique-se de que todos os componentes no convés, especialmente os elementos móveis, estejam estabilizados em suas posições designadas.
13. Ativar aquecedores de acordo com a implementação local para a temperatura alvo (ou seja, 37 °C; Gráfico 8).
14. Execute o arquivo do Protocolo de Esterilização UV por 10 minutos para operar a lâmpada de esterilização UV integrada nos robôs de manuseio de líquidos, conforme fornecido pelo fabricante (Figura 9).
    1. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberta quando o programa for executado.
    2. Execute o arquivo com a opção parametrizada para 600 s.
15. Verifique se o software Robot Run Control está fechado.
    Observação : O programa de método de robô falhará se houver instâncias existentes do software Run Control em execução.

4. Integração de hardware e software

1. Conduza uma "corrida de água", onde o programa do método do robô PRANCE é executado durante a noite com substituição de água para todas as culturas e reagentes úmidos.
   NOTA: Este teste pode ser executado à temperatura ambiente.
   1. Complete a preparação pré-corrida conforme detalhado acima com o controller_manifest e robot_method configurados para uma taxa de diluição efetiva da lagoa de 1 volume/h , conforme mostrado na Figura 5 e na Figura 6.
   2. Conecte a linha "bactérias em" a um recipiente com água para substituir as bactérias de fase logarítmica para a corrida de água.
      NOTA: Corantes alimentares podem ser adicionados às fontes de água para rastrear o movimento do líquido durante o experimento.
   3. Abra a linha de comando no diretório apropriado.
   4. Chame o programa do método robô com Python com o novo sinalizador de execução (py robot_method.py --new) e insira os argumentos solicitados, incluindo o nome do arquivo de log (TestRun), número de poços de lagoa (16), duração do ciclo (30), número de ciclos por medição da placa do leitor (4) e volume do indutor (volume do indutor é 0 μL para este teste, durante uma evolução em que a mutagênese é induzida com arabinose, este valor pode ser de 10 μL), como mostrado na Figura 5.
   5. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberto quando o programa for executado depois que os argumentos forem fornecidos.
      NOTA: O método PRANCE pode ser iniciado usando uma placa de lagoa vazia, e o volume líquido das lagoas se equilibrará com o volume final ao longo dos primeiros seis ciclos.
2. Realizar uma "corrida somente para bactérias", onde o protocolo PRANCE é executado durante a noite apenas com cultura bacteriana à temperatura alvo, mas sem bacteriófagos.
   1. Complete a preparação pré-corrida conforme detalhado acima com o controller_manifest e robot_method configurados para uma taxa de diluição efetiva da lagoa de 1 volume/h, conforme mostrado na Figura 5 e na Figura 6. Certifique-se de que os aquecedores estão ligados para uma temperatura alvo de 37 °C.
   2. Conecte a linha "bactérias em" à fonte selecionada de bactérias em fase logarítmica.
   3. Abra a linha de comando no diretório apropriado.
   4. Chame o programa do método robot com Python com o novo sinalizador de execução (py robot_method.py --new) e insira os argumentos solicitados, conforme detalhado anteriormente na seção 4.1.4.
   5. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberto quando o programa for executado depois que os argumentos forem fornecidos.
3. Execute um "teste de infecção", onde fagos portadores de uma proteína evoluída são desafiados a se propagar em bactérias que necessitam dessa proteína.
   NOTA: Decidir com antecedência quais lagoas serão inoculadas com fago e quais lagoas não serão inoculadas e, assim, servir como lagoas de controle de não fago para detectar contaminação cruzada.
   1. Complete a preparação pré-execução, conforme detalhado acima, com o controller_manifest e robot_method configurados para uma taxa de diluição efetiva de 1 volume/h, conforme mostrado na Figura 5 e na Figura 6. Certifique-se de que os aquecedores estão ligados para uma temperatura alvo de 37 °C.
   2. Conecte a linha "bactérias em" à fonte selecionada de bactérias em fase logarítmica.
   3. Abra a linha de comando no diretório apropriado.
   4. Chame o programa do método robot com Python com o novo sinalizador de execução (py robot_method.py --new) e insira os argumentos solicitados conforme detalhado anteriormente na seção 4.1.4.
   5. Selecione o botão PLAY no canto superior esquerdo da janela Robot Run Control que será aberto quando o programa for executado depois que os argumentos forem fornecidos.
   6. Antes de adicionar bacteriófago, execute o método por 2-3 h para equilibrar o volume e a DO de bactérias nas placas da lagoa.
   7. Inocular as lagoas com fago com 10^{a 6} pfu/mL de bacteriófago no final de um ciclo de corrida quando o programa estiver dormindo (por exemplo, 5,5 μL de alíquota de fago a 10^{a 8} pfu/mL, conforme determinado por ensaio de placa ou qPCR), em uma lagoa de 550 μL.
   8. Execute o programa durante a noite e, em seguida, verifique o título de fago nos poços da lagoa por ensaio de placa ou qPCR.

Resultados do teste de infecção
Este teste revelará problemas com cultura bacteriana, clonagem e titulação de fagos, estabilidade de temperatura do equipamento, configurações de manuseio de líquidos e integração de leitores de placas. Um teste de infecção fagogênica bem-sucedido revelará infecção fagogênica clara e rápida em lagoas inoculadas com fago, e nenhum sinal em lagoas sem fago. A Figura 10 mostra alguns resultados representativos de um teste de infecção fagogênica. Os resultados experimentais também podem ser comparados com as Figuras 1d e 1c deste artigo PRANCE8, dependendo se uma configuração de "PRANCE quente" (alimentado por um turbidostático bacteriano vivo) ou "PRANCE frio" (alimentado por cultura de fase média de log refrigerada) está sendo implementada. Este teste pode revelar vários problemas comuns. Problemas com a preparação de cultura bacteriana muitas vezes podem resultar em infecção fraca ou ausente. As bactérias só podem ser infectadas de forma ideal pelo fago M13 quando estão na fase média e a 37 °C. Em outras temperaturas e estádios de crescimento, apresentam expressão mais fraca do pilus e, portanto, são menos suscetíveis à infecção por fagos12. A inoculação com fago de baixo título ou fago com mutações na espinha dorsal pode resultar em sinal atrasado ou ausente. Problemas com as configurações de ganho do leitor de placas para fluorescência ou luminescência serão revelados por este teste.

Figura 1: Esquema do circuito genético que funciona durante o teste de infecção do aparelho PRANCE. Quando a RNA polimerase T7, codificada no genoma do fago, infecta o hospedeiro de Escherichia coli , ela é transcrita e se liga no AP no promotor T7, o que leva à transcrição da proteína do fago pIII e da proteína luxAB, que, por sua vez, facilita a propagação do fago e a produção de luminescência. Abreviações: PRANCE = Evolução Quase-contínua assistida por Fago-e Robótica; AP = plasmídeo acessório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquema dos componentes físicos do sistema PRANCE. Uma geladeira armazena culturas agitadas, que são então movidas para o convés do robô por uma série de bombas, para o reservatório bacteriano, "o waffle". O robô de manuseio de líquidos é usado para mover culturas bacterianas do "waffle" usando a cabeça de pipetagem para os poços de retenção para aquecer até a temperatura de incubação e, em seguida, para as lagoas onde ocorre a incubação principal. Tanto os poços de retenção quanto as lagoas são placas padrão de poço profundo de 2 mL. O robô coleta amostras em placas leitoras de uso único, que por sua vez são movidas para um leitor de placas para medição. Abreviação: PRANCE = Evolução Quase-Contínua Assistida por Fagos e Robótica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O aparelho robótico PRANCE. (A) Configuração PRANCE. (I) Filtro HEPA e aquecedor externo. (II) Geladeira de cultura. (III) Gabinete do robô principal. (IV) Leitor de placas. (V) Bombas e tanques. (B) Gabinete do robô. (VI) Bombas de cultura principais. (VII) Tanques de água, resíduos e água sanitária. (VIII) Lavadoras de bombas. (C) Gabinete do robô. (IX) Braço de pipetagem robô e pinça. (X) Ponteiras de pipeta. (XI) Componente impresso em 3D para permitir a distribuição da cultura no robô ("o waffle"). (XII) Placas para amostragem no leitor de placas. (XIII) Baldes para lavagem de pontas. (XIV) "Lagoas": vasos de cultura onde ocorre a cultura evolutiva. Abreviações: PRANCE = Evolução Quase-contínua assistida por Fago-e Robótica; HEPA = ar particulado de alta eficiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Layout do deck. (A) Representação 3D do layout do deck no software de controle do robô. (B) Fotografia dos componentes do convés. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Captura de tela da linha de comando com parâmetros de exemplo (acima) e executar software de controle (abaixo). O botão de reprodução está localizado no canto superior esquerdo e pode ser clicado com um mouse ou acionado com uma tela sensível ao toque, dependendo da implementação local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: O arquivo de manifesto do controlador conforme configurado para execuções de teste. Lagoas contendo cultura #0 estariam nas colunas 1 e 3 da placa de 96 poços profundos. As colunas restantes estariam vazias. As linhas A, B, D e E da placa de poço de 96 profundidades são marcadas na coluna direita para infecção por fago (1), as outras fileiras (0) são controles sem fago. Esta instância do manifesto controlador resultaria no programa diluindo a lagoa com 210 μL de cultura a cada ciclo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Cálculo da taxa efetiva de diluição da lagoa utilizando a planilha DilutionCalculator. Consulte Arquivo suplementar 2 para a planilha DilutionCalculator. Como visto nesta figura, uma lagoa de 550 μL diluída por 210 μL de cultura fresca a cada ciclo de 30 min, com amostras de 150 μL para medição da placa leitora a cada quatro ciclos, corresponderá a uma taxa de diluição efetiva de 1,0 volume/h (após cada 1 h, 50% do líquido original da lagoa no início da hora permanecerá) Clique aqui para ver uma versão maior deste figura.

Figura 8: Sistema de aquecimento do robô. O aquecedor é ativado conectando a fonte de alimentação conforme indicado pelo círculo vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Configurações do protocolo de descontaminação UV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Medição de um teste de infecção executado no sistema PRANCE. Amostras são coletadas durante a corrida e medições de luminescência e absorbância são feitas. Para cada lagoa, as medidas de luminescência são divididas pela medida de absorbância correspondente e plotadas em função do tempo. As lagoas que foram infectadas com Phage são coloridas em verde, enquanto as lagoas de controle não infectadas são coloridas em preto. Abreviação: PRANCE = Evolução Quase-Contínua Assistida por Fagos e Robótica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: arquivo STL para impressão 3D dos componentes de deck personalizados necessários para o sistema PRANCE, incluindo, no mínimo, o coletor de reservatório/distribuição bacteriano ("waffle"). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Planilha DilutionCalculator. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos a revelar.