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Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

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DOI:

10.3791/66003

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16 de fevereiro de 2024

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1Neural Dynamics Laboratory, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo de gravação personalizado e eletrodos para registrar potenciais de campo locais e investigar o fluxo de informações no hipocampo e no córtex pré-frontal do camundongo.

Resumo

A técnica de registro de potenciais de campo local (LFPs) é um método eletrofisiológico usado para medir a atividade elétrica de populações neuronais localizadas. Ele serve como uma ferramenta crucial na pesquisa cognitiva, particularmente em regiões do cérebro como o hipocampo e o córtex pré-frontal. As gravações LFP duplas entre essas áreas são de particular interesse, pois permitem a exploração da comunicação de sinais inter-regionais. No entanto, os métodos para realizar essas gravações raramente são descritos, e a maioria dos dispositivos de gravação comerciais são caros ou carecem de adaptabilidade para acomodar projetos experimentais específicos. Este estudo apresenta um protocolo abrangente para realizar gravações de LFP de eletrodo duplo no hipocampo de camundongos e no córtex pré-frontal para investigar os efeitos de drogas antipsicóticas e moduladores de canais de potássio nas propriedades de LFP nessas áreas. A técnica permite a medição das propriedades do LFP, incluindo espectros de potência dentro de cada região do cérebro e coerência entre os dois. Além disso, um dispositivo de gravação personalizado e de baixo custo foi desenvolvido para esses experimentos. Em resumo, este protocolo fornece um meio de registrar sinais com altas relações sinal-ruído em diferentes regiões do cérebro, facilitando a investigação da comunicação de informações inter-regionais dentro do cérebro.

Introdução

Os potenciais de campo local (LFPs) referem-se à atividade elétrica registrada no espaço extracelular, refletindo a atividade coletiva de um grupo localizado de neurônios. Eles exibem uma gama diversificada de frequências, abrangendo desde ondas lentas em 1 Hz até oscilações rápidas em 100 Hz ou 200 Hz. Bandas de frequência específicas têm sido associadas a funções cognitivas, como aprendizado, memória e tomada de decisão 1,2. Alterações nas propriedades da LFP têm sido usadas como biomarcadores para vários distúrbios neurológicos, incluindo demência e esquizofrenia 3,4. A análise dos registros de LFP pode oferecer informações valiosas sobre os mecanismos patológicos subjacentes associados a essas condições e possíveis estratégias terapêuticas.

A gravação LFP dupla é uma técnica usada para medir a atividade elétrica localizada dentro e entre duas regiões cerebrais específicas. Essa técnica oferece uma oportunidade valiosa para investigar a intrincada dinâmica neural e a comunicação de sinais que ocorrem dentro e entre regiões cerebrais distintas. Estudos anteriores revelaram que a detecção de alterações nas propriedades neuronais de regiões cerebrais individuais pode ser complexa, mas mudanças na comunicação cortical inter-regional podem ser observadas 5,6. Portanto, a utilização da gravação LFP dupla oferece um meio potente para resolver esse problema.

A conectividade hipocampo-pré-frontal desempenha um papel crucial na modulação das funções cognitivas, e a disfunção tem sido associada a vários distúrbios neurológicos 7,8. Gravações de eletrodos duplos dessas regiões podem fornecer informações sobre essas interações. Infelizmente, há informações limitadas disponíveis sobre métodos para realizar gravações LFP de eletrodo duplo entre essas áreas. Além disso, os dispositivos de gravação disponíveis comercialmente são geralmente caros e carecem de adaptabilidade a projetos experimentais específicos. O método convencional para registrar LFPs envolve o uso de um cabo blindado para conectar o dispositivo de gravação a eletrodos implantados no cérebro de um animal. No entanto, essa abordagem é suscetível a artefatos de movimento e ruído ambiental, impactando a qualidade e a confiabilidade dos sinais registrados.

Este protocolo descreve um procedimento abrangente para realizar gravações LFP de eletrodo duplo no hipocampo e córtex pré-frontal de camundongos, usando um headstage personalizado de baixo custo que pode ser colocado na cabeça do animal. Esses métodos permitem que os pesquisadores investiguem padrões oscilatórios específicos da região dentro de duas regiões cerebrais discretas e explorem a troca de informações inter-regionais e a conectividade entre essas áreas.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Florey (Universidade de Melbourne, nº 22-025UM) de acordo com o código australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos. Camundongos machos C57BL/6 (8 semanas), obtidos no Animal Resources Centre (Austrália), foram usados para o presente estudo.

1. Projeto e fabricação de headstage

NOTA: A placa PCB do headstage é uma placa compacta de quatro camadas de 14 mm x 12 mm projetada para ser colocada diretamente na cabeça do animal. Ele utiliza um chip amplificador comercial (consulte a Tabela de Materiais), e todos os arquivos de design e Gerber estão disponíveis online (link do GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

  1. Forneça as seguintes especificações ao fabricante: Espessura da placa: 0,6 mm; Rastreamento/espaçamento mínimo: 4 mils; Tamanho mínimo do furo: 0,2 mm.
  2. Durante o processo de montagem do PCB, siga esta ordem:
    1. Solde o chip do amplificador na placa usando uma pistola de ar quente ajustada a 350 °C.
    2. Solde os componentes passivos.
    3. Solde o conector SPI e o conector do eletrodo (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Inspecione a solda sob um microscópio para garantia de qualidade. Prenda o conector SPI no lugar usando epóxi para maior estabilidade.
  4. Use software de gravação de terceiros e uma placa de controle (consulte a Tabela de Materiais) para aquisição de sinal. Consulte o guia do usuário do software para obter instruções detalhadas.
  5. O headstage projetado suporta 8 canais. No software, habilite os canais 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 e 23 para gravação.

2. Fabricação de eletrodos

  1. Corte os fios de tungstênio revestidos com PFA (consulte a Tabela de Materiais) em comprimentos específicos para diferentes tipos de eletrodos: eletrodo do córtex pré-frontal (12 mm), eletrodo do hipocampo (10 mm) e eletrodo de aterramento (6 mm).
  2. Corte o tubo de latão (consulte a Tabela de Materiais) em segmentos de 3 mm.
  3. Remova 2 mm do revestimento na extremidade de cada fio usando um isqueiro e, em seguida, solde firmemente o fio do eletrodo ao tubo de latão. O tubo de latão tem um diâmetro interno de 0,45 mm e um diâmetro externo de 0,60 mm.
  4. Para o eletrodo de aterramento, solde um parafuso de aço inoxidável M1.2 (consulte a Tabela de Materiais) ao eletrodo. Aplique fluxo à base de ácido fosfórico no parafuso para melhorar a soldagem. Após a soldagem, limpe o parafuso com álcool.
    NOTA: Use luvas para proteção durante o processo de soldagem.

3. Procedimento cirúrgico

  1. Anestesiar o camundongo em uma câmara de anestesia com isoflurano a 3% e fluxo de oxigênio de 1 L/min.
  2. Coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento e prenda-o em uma estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Ajuste a taxa de manutenção do isoflurano para 2,5-3% e reduza o fluxo de oxigênio para 500 mL / min. Usando a pinça do dedo do pé, verifique se o animal ainda está sob anestesia profunda.
  4. Injete carprofeno por via subcutânea a 0,5 mg/kg e aplique pomada para os olhos para proteção dos olhos.
  5. Raspe e esterilize a cabeça do camundongo usando iodopovidona e etanol a 80%.
  6. Faça uma incisão de 8 mm ao longo da linha média do couro cabeludo, removendo o tecido conjuntivo na área da incisão.
  7. Aplique peróxido de hidrogênio para limpar a superfície do crânio, tomando cuidado para não tocar na pele ao redor.
  8. Alinhe os pontos de referência bregma e lambda no mesmo nível para um posicionamento preciso do eletrodo (bregma e lambda são onde a sutura sagital cruza as suturas coronal e lambdoide).
  9. Faça furos para eletrodo de referência/aterramento, parafusos de ancoragem (broca de 0,9 mm) e eletrodos ativos (broca de 0,3 mm) nas coordenadas especificadas.
  10. Conecte o eletrodo feito sob medida (etapa 2) ao braço da estrutura estereotáxica e certifique-se de que esteja perpendicular ao cérebro.
  11. Implante o eletrodo na área CA1 do hipocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    NOTA: AP, ântero-posterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral.
  12. Repita o implante do eletrodo no córtex pré-frontal (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
  13. Prenda os eletrodos com um adesivo poderoso e cimento dentário disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
  14. Implante dois parafusos de ancoragem de 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) para evitar movimento.
  15. Posicione o eletrodo de referência/terra em contato direto com a dura-máter, 2 mm posterior e 2 mm unilateral ao ponto de referência lambda.
  16. Conecte o lado do tubo de latão dos eletrodos a um conector de soquete multicanal (consulte a Tabela de Materiais) com o eletrodo de aterramento no meio.
  17. Use tubo termorretrátil de 0.8 mm na parte externa do pino do meio para isolamento.
  18. Prenda os eletrodos, parafusos de ancoragem e conector com adesivo e cimento dentário.

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Para aliviar a dor pós-operatória, injete carprofeno na dose de 5-10 mg / kg por via subcutânea a cada 12-24 horas com base em uma avaliação da dor por um período de três dias.
  2. Forneça ao animal um período de recuperação de uma semana antes de iniciar qualquer registro ou procedimento experimental.

5. Procedimento de registo

  1. Manuseie o animal por 15 min, duas vezes ao dia, por três dias consecutivos.
  2. Pegue os ratos fechando suavemente a mão ao redor deles sem aplicar pressão excessiva.
  3. Coloque a placa do palco na cabeça do animal por 30 minutos uma vez por dia durante três dias consecutivos.
  4. No dia da gravação, aclimatar o animal à sala de gravação por 30 min.
  5. Coloque o animal em uma pequena câmara de gravação dentro de uma gaiola de Faraday para reduzir a interferência elétrica externa. Anexe o headstage personalizado para gravação.
  6. Abra o software de gravação e selecione uma taxa de amostragem de 2.00 kHz. Desative todos os canais, exceto 13 e 20, selecionando cada canal e pressionando a barra de espaço.
  7. Na janela de largura de banda do hardware, defina a largura de banda inferior para 2 Hz e a largura de banda superior para 100 Hz.
  8. Na janela de filtragem de software, ajuste o filtro passa-baixa para 100 Hz e o filtro passa-alta para 2 Hz.
  9. Escolha o caminho de armazenamento clicando em Selecionar nome do arquivo e, em seguida, clique em Gravar.
  10. Comece cada sessão de gravação com um período de habituação de 10 minutos, seguido por uma gravação de EEG basal de 15 minutos.
  11. Após a gravação inicial, administre o medicamento por injeção intraperitoneal e continue gravando por mais 30 minutos sem demora.
    NOTA: Consulte a seção Resultados para obter detalhes sobre os medicamentos usados.

Resultados

Os resultados aqui mostrados demonstram os efeitos de vários fármacos nas propriedades dos potenciais de campo local (LFPs) testados em quatro coortes de camundongos machos C57BL/6 (n = 8 para cada coorte; idade: 8 semanas; peso: 24,0 ± 0,42 g). As drogas testadas incluíram o antipsicótico clozapina, os moduladores dos canais de potássio 4-aminopiridina (4-AP) e retigabina, bem como a solução salina do veículo controle.

Conforme mostrado na Figura 1, o camundongo foi colocado em uma pequena câmara de gravação e os LFPs foram coletados do hipocampo (HIP) e do córtex pré-frontal (PFC) usando um headstage personalizado. Como este estudo se concentrou principalmente no exame das bandas de frequência e gama, o sinal gravado primeiro foi submetido à filtragem passa-banda inicial dentro de uma faixa de frequência de 2 a 100 Hz, seguida de amostragem em 2000 Hz. O sinal foi então seccionado em várias épocas de 2 s. Quaisquer épocas que exibissem artefatos de movimento pronunciados foram identificadas e posteriormente excluídas dos processos de análise subsequentes. Os espectros de potência dos LFPs no HIP e no PFC, bem como a coerência do HIP-PFC, foram medidos usando um método de análise baseado em multi-taper9. A análise usou cinco cones Slepian e a largura de banda de tempo foi definida como três para atingir a concentração espectral ideal. Uma janela deslizante de 1 s e um tamanho de passo de 100 ms foram usados para gerar os espectrogramas de tempo-frequência e o curso de tempo da coerência HIP-PFC.

Como mostrado na Figura 2 e na Figura 3, a administração de solução salina não produziu efeitos perceptíveis nos espectros de potência das LFPs em HIP e PFC, nem na coerência HIP-PFC. Tanto a retigabina quanto a clozapina demonstraram reduções claras na potência da banda gama (30-100 Hz) no HIP e PFC, bem como na coerência do HIP-PFC da banda gama. Em contraste, o 4-AP exibiu os efeitos opostos, caracterizados pelo aumento da potência da banda gama no HIP e PFC, juntamente com um aumento da coerência dentro da banda gama entre HIP e PFC.

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Figura 1: Esquema da configuração experimental. Eletrodos foram implantados no hipocampo (HIP) e no córtex pré-frontal (PFC) para registro de potenciais de campo local. O animal foi colocado em uma pequena câmara de gravação e um headstage personalizado foi conectado ao conector do eletrodo. Cada sessão de gravação começou com uma sessão de linha de base de 10 minutos, seguida por uma sessão de drogas de 30 minutos. Os efeitos da solução salina, clozapina, 4-AP e retigabina foram testados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O impacto dos medicamentos antipsicóticos e moduladores dos canais de potássio na atividade eletrofisiológica contínua no hipocampo (HIP) e no córtex pré-frontal (PFC). O espectrograma normalizado dos potenciais de campo locais no HIP e PFC, juntamente com a coerência HIP-PFC, exibiu efeitos tempo-dependentes para todos os fármacos estudados. Os medicamentos foram administrados por injeção intraperitoneal no tempo t = 15 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: O impacto de drogas antipsicóticas e moduladores dos canais de potássio na densidade do espectro de potência em HIP e PFC. O 4-AP aumentou significativamente a potência da banda gama em ambas as regiões do cérebro, enquanto a clozapina e a retigabina suprimiram a potência da banda gama em ambas as regiões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve o procedimento para a construção de um headstage personalizado projetado especificamente para o registro simultâneo de potenciais de campo local duplo (LFPs) no hipocampo (HIP) e no córtex pré-frontal (PFC). As etapas detalhadas fornecidas neste protocolo oferecem informações suficientes para os pesquisadores examinarem minuciosamente a comunicação do sinal dentro de cada região e entre o HIP e o PFC.

O headstage projetado sob medida utiliza um chip amplificador comercial. Embora a configuração atual suporte a gravação de 8 canais, o headstage pode ser facilmente adaptado para acomodar a capacidade total de 32 canais, proporcionando assim potencial para capacidade de canal expandida adequada para gravação de matriz de eletrodos. Considerando o baixo custo do headstage, uma opção é fixar permanentemente a prancha na cabeça do animal. Essa abordagem oferece a vantagem de minimizar os artefatos de movimento e reduzir o nível geral de perturbação causada pelo movimento.

O eletrodo feito sob medida demonstra gravação estável de LFPs a longo prazo, mantendo boa qualidade de sinal por um período de 3-5 meses. Outra abordagem viável envolve o emprego de placas de circuito flexíveis à base de poliimida como feixes de eletrodos10,11. Essas placas de circuito flexíveis podem ser integradas ao headstage de gravação para permitir a gravação multicanal. Este método oferece a vantagem de simplificar a preparação do eletrodo e os procedimentos cirúrgicos. O peso do implante com e sem o headstage é muito leve, com 0,198 g e 0,812 g, respectivamente, tornando-o adequado para camundongos muito jovens.

Uma limitação da técnica de registro atual é a potencial interferência causada pelo cabo suspenso, que pode interferir no comportamento natural do animal durante os experimentos. Para resolver esse problema, soluções alternativas, como a utilização de um cartão SD para armazenamento de dados ou a implementação de um módulo transmissor de sinal sem fio, podem ser consideradas.

Uma etapa essencial e crítica do protocolo envolve o posicionamento preciso do eletrodo. É crucial garantir o posicionamento preciso e consistente do eletrodo para permitir a comparabilidade entre os experimentos. Para verificar a localização do eletrodo, a histologia deve ser realizada12. Uma técnica útil para melhorar o posicionamento adequado do eletrodo no HPC é registrar enquanto o eletrodo está inserido verticalmente, pois ritmos fortes e disparo neuronal indicarão o posicionamento correto. É aconselhável utilizar camundongos adultos com mais de 8 semanas, pois a qualidade do sinal pode diminuir com o tempo ou resultar em posicionamento incorreto à medida que os camundongos envelhecem. Levar em consideração essas considerações ajudará a manter a confiabilidade e a validade dos resultados experimentais.

Em conclusão, o protocolo apresentado neste artigo fornece uma estrutura para estudar a comunicação de sinais entre regiões cerebrais distintas. Ele permite que os pesquisadores explorem a dinâmica neuronal e as interações dentro e entre essas regiões.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de latão Albion Alloys, EUADiâmetro interno de 0,45 mm
Carprofeno Rimadyl, Pfizer Saúde Animal 
Chip amplificador comercialIntantechRHD 2132
de controleIntantechRHD
Cimento dentário Parafuso
Heat shrinks
Harwin, AU1.27 mm pitch, soquete
de tungstênio revestidos com PFA A-M SYSTEMS, EUADiâmetro interno de 150 µ m 
Chip de fluxo à base de ácido fosfóricoQuikCQ4LF-0.5
Software de gravaçãoIntantechRHX Software
Quadro estereotáxicoWorld Precision InstrumentsInstrumento
Super colaUHUUltra rápido
Placa Sistema de gravação de aço inoxidável Panduit de 0,8 mm de diâmetro Paledur Ferramentas de relógio Ferramentas de relógio e parafuso de relógio Conector de soquete multicanal PCB fios de gravaçãoestereotáxico do mouse

Referências

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