Treinando coelhos de laboratório para refinar os procedimentos de criação de rotina

Katharina Hohlbaum; Pia Kahnau; Jenny Wilzopolski; Carola Fischer-Tenhagen

doi:10.3791/66008

Artigo de método

Treinando coelhos de laboratório para refinar os procedimentos de criação de rotina

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DOI:

10.3791/66008

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16 de fevereiro de 2024

Katharina Hohlbaum¹ , Pia Kahnau¹ , Jenny Wilzopolski¹ , Carola Fischer-Tenhagen¹

¹German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), German Federal Institute for Risk Assessment

Neste artigo

Resumo

Protocolos de treinamento envolvendo reforço positivo para procedimentos de criação de rotina em coelhos foram desenvolvidos e provaram ser bem-sucedidos, pois os coelhos mostraram de forma confiável os comportamentos treinados no exame geral semanal. Pegar os coelhos com a caixa de transporte foi menos aversivo do que a técnica de manuseio convencional.

Resumo

Técnicas de manejo e treinamento não aversivas para animais de laboratório são necessárias para facilitar os procedimentos experimentais e de rotina de criação, melhorando o bem-estar animal e a qualidade científica. O treinamento com clicker foi utilizado para desenvolver protocolos de treinamento para coelhos para refinar os procedimentos estressantes de criação de rotina geralmente associados a levantá-los (ou seja, ser pego do chão) / contê-los (ou seja, ser segurado nos braços de um humano). Treze fêmeas de coelhos brancos da Nova Zelândia foram treinadas ao longo de três semanas. Todos os coelhos aprenderam os comportamentos de objetivo predefinidos: eles seguiram o bastão alvo, pularam na balança, entraram em uma caixa de transporte e empinaram enquanto colocavam as patas dianteiras na mão do treinador. Além disso, dez animais pularam do chão para o colo do treinador sentado e permitiram que o treinador levantasse as patas da superfície enquanto estava sentado no colo do treinador. Para alguns indivíduos, os protocolos tiveram que ser adaptados por etapas intermediárias adicionais. No final do treinamento, os coelhos mostraram de forma confiável os comportamentos de meta esperados, mesmo após intervalos de treinamento curtos e longos. Com poucas exceções, uma pessoa familiar que não seja o treinador poderia obter os comportamentos objetivos dos coelhos (generalização), embora mais sessões fossem necessárias para a generalização. No teste de abordagem voluntária, os coelhos preferiram interagir com o treinador na^1ª tentativa, mas passaram tanto tempo com uma pessoa desconhecida quanto com o treinador na^2ª tentativa. As observações comportamentais sugeriram que pegar os coelhos com a caixa de transporte, conforme descrito no protocolo, em vez de prendê-los com a nuca e levantá-los no braço, era menos aversivo. Em suma, os protocolos de treinamento foram viáveis e podem servir como uma estratégia de refinamento em instalações de animais de laboratório. No interesse do bem-estar dos animais, os protocolos de treino devem ser aplicados sempre que possível.

Introdução

Entre 2015 e 2019, mais de 49 milhões de animais foram utilizados para fins científicos na União Europeia (e na Noruega); 1.745.037 (3,5%) deles eram coelhos¹. Os coelhos são usados principalmente para pesquisa regulatória (por exemplo, controle de qualidade, toxicidade e outros testes de segurança, incluindo farmacologia) e produção de rotina de substâncias biológicas (por exemplo, produtos à base de sangue)². Embora sejam feitos esforços para substituir experimentos com animais por métodos sem animais, o uso de animais ainda é necessário para alguns desses propósitos. Sempre que um experimento com animais não puder ser substituído, é crucial reduzir o número de animais e refinar as condições experimentais, bem como as condições de alojamento e criação para minimizar o sofrimento. Russel e Burch descreveram essa estratégia como o princípio dos 3R (substituir, reduzir, refinar) em 1959³ e, em 2010, foi transposta para a Diretiva 2010/63/UE relativa à proteção dos animais de laboratório utilizados para fins científicos⁴. O papel do refinamento, às vezes chamado de 'Cinderela' dos 3Rs⁵, ganhou importância crescente. Embora a substituição e a redução sejam estratégias a longo prazo para atingir o objetivo final da diretiva de substituir totalmente as experiências com animais, o aperfeiçoamento permite a melhoria imediata do bem-estar dos animais⁵, o que, por sua vez, tem potencial para melhorar a qualidade científica⁶. As partes essenciais do refinamento são o manuseamento e a formação dos animais, tal como referido no anexo III da Diretiva 2010/63/UE. A Diretiva estipula que as instalações para animais devem projetar programas de habituação e treinamento para os animais de laboratório adaptados à espécie, procedimento e projeto⁴. O Apêndice A do ETS nº 123 sugere que o pessoal dos animais de laboratório gasta tempo "conversando, manuseando, treinando e cuidando dos animais"⁷.

Alguns procedimentos de manuseio causam estresse, especialmente para presas terrestres, como coelhos. Exemplos são ser encurralado, contido (ou seja, agarrado por um humano, segurado nos braços de um humano ou imobilizado por um dispositivo) e levantado (ou seja, levantado do chão) para uma inspeção de saúde ou procedimentos experimentais⁸. Uma pesquisa com foco em coelhos de estimação revelou que 57-61% deles lutaram ao serem levantados ^9,10 e alguns até mostraram agressão relacionada ao medo (ou seja, morder)¹¹. Isso enfatiza a necessidade de técnicas suaves de manuseio e treinamento. Já foi demonstrado para outros pequenos mamíferos, como camundongos, que técnicas de manuseio suave diminuem a ansiedade¹². Além disso, o manuseio suave em combinação com o treinamento reduz o estresse, a ansiedade e o comportamento semelhante à depressão em camundongos¹³. Em macacos rhesus e chimpanzés, as medidas fisiológicas relacionadas ao estresse foram menos afetadas quando eles foram previamente treinados em um procedimento^14,15. Pode-se supor que, se um animal pode optar por participar voluntariamente do treinamento, ele pode se envolver ativamente e controlar a situação, o que melhora o bem-estar do animal e também pode contribuir para dados científicos mais robustos e confiáveis¹⁶.

Muitos procedimentos de treinamento de animais dependem de princípios de condicionamento operante, particularmente o uso de reforço positivo e modelagem 17,18,19. O condicionamento operante requer que um animal provoque comportamentos que podem ser aumentados ou diminuídos²⁰. Existem quatro contingências comuns que são usadas para descrever o condicionamento operante: reforço positivo e negativo, bem como punição positiva e negativa^21,22. Em coelhos, a punição positiva é usada quando uma pessoa se aproxima (estímulo indesejado) de um animal para afastá-lo ou em direção a um determinado local²³. No contexto do manuseio de um coelho na mesa de exame, um exemplo de reforço negativo é a remoção da pressão (estímulo indesejado) no corpo do coelho quando o coelho fica parado; Um exemplo de punição negativa é retirar uma recompensa alimentar (estímulo desejado) quando o coelho começa a lutar. Nem punição positiva/negativa nem reforço negativo são recomendados no treinamento de animais. A punição causa efeitos emocionais negativos²⁴, como angústia como mostrado em cães²⁵. Em vez disso, o reforço positivo deve ser o método de escolha no treinamento de animais^25,26. O treinamento de reforço positivo (PRT) significa que um estímulo desejável (por exemplo, uma recompensa alimentar) é fornecido depois que o animal mostrou um comportamento desejado, o que aumenta a probabilidade de que o animal exiba o comportamento desejado novamente no futuro²⁷. O PRT geralmente envolve a aplicação de um reforçador condicionado. Um reforçador condicionado (reforçador secundário) geralmente é um estímulo neutro, como um som, que o animal aprende a associar a um reforçador incondicionado (reforçador primário, por exemplo, recompensa alimentar)²⁸. Após o animal apresentar o comportamento desejado, o reforçador condicionado é imediatamente apresentado, seguido da apresentação da recompensa alimentar²⁶. Um exemplo bem conhecido de PRT é o treinamento com clicker, onde um clicker é usado para produzir um clique como um reforçador secundário²⁶.

O treinamento deve seguir padrões previsíveis, o que é alcançado através da criação de um protocolo de treinamento. O protocolo de treinamento descreve como um comportamento objetivo pode ser alcançado passo a passo (ou seja, modelagem comportamental), enquanto cada etapa é definida por critérios objetivos e deve ser facilmente realizada²⁶. Se o treinamento seguir um protocolo específico, é possível que a equipe de animais de laboratório alterne com o treinamento dos animais. É importante notar que o pessoal precisa conhecer os princípios das técnicas de aprendizagem e treinamento para aplicá-los corretamente²⁶. O treinamento de animais geralmente incorpora modelagem comportamental. A modelagem comportamental à mão foi deliberadamente usada pela primeira vez por Skinner e colegas no início dos anos 1940²⁹. Em contraste, em trabalhos anteriores, Skinner se concentrou em "fazer pequenas mudanças no ambiente físico para implementar um programa de aproximação sucessiva"²⁹. Em um artigo publicado na Scientific American, ele explicou que reforçar um comportamento aumenta a probabilidade de que o comportamento seja repetido, o que "torna possível moldar o comportamento de um animal quase como um escultor molda um pedaço de argila"³⁰. Desde então, a modelagem tem experimentado uma importância crescente para animais em cativeiro 29,30,31,32. Para reproduzir e aprimorar protocolos de modelagem, é fundamental avaliar os protocolos de forma sistemática e objetiva 33,34,35,36.

Uma revisão sistemática e meta-análise publicada recentemente por Pfaller-Sadovsky et al. descobriu que o reforço condicionado foi mais frequentemente estudado em cavalos e cães, embora gatos, gado, peixes, cabras e primatas não humanos também tenham sido investigados³⁷. Na ciência de animais de laboratório, o PRT é amplamente utilizado para primatas não humanos 38,39,40 e cães^41,42. Além disso, porcos⁴³, cabras⁴⁴ e até pequenos mamíferos, como camundongos¹³ e ratos 45,46,47, foram treinados com sucesso usando um clicker em laboratório. Até onde sabemos, a introdução de PRT para coelhos de laboratório ainda não foi relatada⁴⁸; A literatura revisada por pares existente publicada há várias décadas está desatualizada e não atende aos critérios da pesquisa ética moderna. Embora poucas informações não revisadas por pares sugiram que os coelhos possam ser treinados com sucesso usando o PRT⁴⁹, parece haver uma falta de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos alojados em instalações para animais de laboratório. As razões subjacentes podem variar. Por exemplo, as técnicas de treinamento usadas podem não ser descritas em detalhes em artigos de pesquisa ou os dados são gerados para pesquisa regulatória e, portanto, não são publicados. Além disso, os coelhos podem não ser o foco principal da pesquisa de refinamento, uma vez que outras espécies, como camundongos e ratos, são usadas com mais frequência em pesquisas. Como os coelhos podem mascarar o estresse e o desconforto extremamente bem, seu estado emocional negativo ao serem manuseados pode muitas vezes não ser reconhecido. O tamanho de um coelho permite que os humanos contenham esses animais para procedimentos, enquanto outras espécies, como primatas não humanos, não podem ser seguradas com as mãos para intervenções semelhantes sem serem gravemente feridas⁵⁰. No entanto, esses fatos não devem impedir o desenvolvimento ou compartilhamento de protocolos de PRT para coelhos de laboratório.

Em relação aos benefícios potenciais do PRT, foram feitas primeiras tentativas para preencher a lacuna de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos de laboratório. Para facilitar os procedimentos de rotina, como manuseio, inspeções sanitárias e pesagem, foram desenvolvidos protocolos de treinamento e avaliada sua viabilidade para coelhos brancos da raça Nova Zelândia. Comparações foram realizadas para avaliar se a técnica de manejo alternativo descrita nos protocolos de treinamento era menos aversiva do que a técnica de manejo convencional e se os protocolos de treinamento podem servir como medidas de refinamento. A Figura 1 demonstra o cronograma do presente estudo.

Manutenção de animais

Treze coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas foram obtidos de fontes comerciais (chegada ao biotério com aproximadamente sete semanas de idade). Os animais estavam livres de todos os patógenos virais, bacterianos e parasitários listados nas recomendações da FELASA⁵¹. Foram utilizadas roupas e equipamentos de proteção (luvas, máscaras, redes de cabelo) na condução das etapas do presente protocolo. Um grupo de seis e um grupo de sete animais foram alojados juntos em um curral de 2,8 m × 2,8 m (alojamento no chão), respectivamente. O chão foi coberto com material de cama de madeira fino e escamoso (autoclavado). Além disso, o material de nidificação e a lã de papel estavam espalhados em cima da cama. Três casas plásticas com duas aberturas cada (37 cm × 60 cm; altura 30 cm) e um túnel plástico (comprimento: 58 cm; diâmetro: 16 cm) serviram como abrigos. Além disso, foram fornecidos itens de enriquecimento, como blocos de madeira, bolas de feno e salgueiro e lanches cheios de pellets de comida, que caem ao mover a bola. Os coelhos tinham livre acesso a água da torneira, comida peletizada e feno autoclavado, bem como palha. Mais informações sobre alimentos e itens de enriquecimento estão listadas na Tabela de Materiais. A sala dos animais era limpa às quintas-feiras.

Os coelhos foram mantidos em condições padrão (temperatura ambiente e umidade relativa do ar dadas como média ± desvio padrão: 20,3 ± 0,4 °C e 50 ± 5%) em um ciclo claro:escuro de 12:12 h (luz artificial com incidência adicional de luz do dia). Um rádio foi ligado 30 minutos antes do início da fase de luz por aproximadamente 8 h para habituar os coelhos aos ruídos do ambiente.

Protocolo

A manutenção dos animais foi aprovada pela Autoridade Estatal de Berlim ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", número da licença: ZH3 - Instituto Federal Alemão de Avaliação de Riscos, Berlim). Os protocolos de treinamento foram desenvolvidos no âmbito da pecuária de rotina para refinar procedimentos como manejo, inspeção sanitária e pesagem. Uma vez que os protocolos de treinamento não causaram dor, sofrimento ou dano e todas as observações foram feitas no contexto da criação animal de rotina, este estudo não foi considerado como um experimento animal de acordo com a legislação europeia.

1. Requisitos gerais para a formação

NOTA: Os seguintes pontos são geralmente exigidos para o treinamento de animais, independentemente do presente protocolo.

Marque claramente os animais para identificação.
Certifique-se de ter uma recompensa de alta qualidade, por exemplo, comida muito saborosa.
Defina o plano de treinamento incluindo todas as etapas em direção ao comportamento objetivo, ou seja, o comportamento desejado que o animal deve exibir.
NOTA: O comportamento da meta é moldado passo a passo, enquanto cada etapa é definida por critérios objetivos e deve ser facilmente realizada.
Defina se os animais devem ter sucesso em realizar 80% ou 100% das etapas de treinamento antes de prosseguir com a próxima etapa.
Prepare a documentação (por exemplo, Tabela Suplementar 1).
Não treine os animais quando estiver com pressa e cuide dos maneirismos, tom de voz e velocidade de movimento, ou seja, fale suave e calmamente, mova-se devagar e previsivelmente.
Teste as etapas que foram treinadas no treinamento anterior.
Não treine um animal quando o estado geral de saúde do animal estiver prejudicado e/ou o animal não estiver interessado em interagir com o treinador.

2. Rotinas de treinamento para o presente protocolo

NOTA: As seguintes rotinas de treinamento foram definidas para o presente protocolo.

Monte a arena de treinamento na biotéria/curral (Figura 2) e, dependendo do comportamento objetivo a ser treinado, coloque a balança ou a caixa de transporte (piso de 30 cm × 50 cm; porta de 27 cm × 25,5; com abertura na tampa de 16 cm × 39 cm) na arena.
Coloque a balança e a caixa de transporte fora da arena para familiarizar os coelhos com esses novos objetos antes que os comportamentos de meta "pesagem" e "caixa de transporte" sejam treinados.
Para comportamentos de objetivo (consulte as etapas 6-9), conduza o coelho para a arena de treinamento, conforme descrito na etapa 5.7.
Sente-se no chão ou use um banquinho/degrau baixo para se sentar na arena de treinamento.
Treine os comportamentos objetivo um após o outro, na ordem descrita no protocolo e não simultaneamente. Faça uma exceção se um animal não conseguir aprender uma etapa de um comportamento de meta em dois dias consecutivos - neste caso, treine o próximo comportamento de meta simultaneamente. Altere a ordem dos comportamentos de meta se isso facilitar o processo de treinamento para um indivíduo.
Após a habituação e a introdução do clicker, comece a treinar todos os animais na^1ª etapa do comportamento do objetivo "seguir o alvo" (ou seja, a bola no final do bastão alvo é definida como alvo). Observe que, dependendo de seu desempenho individual, eles podem atingir diferentes etapas de treinamento neste dia. Continuar o treinamento de acordo com o progresso individual dos animais nos dias seguintes.
Agende uma sessão de treinamento (por exemplo, aproximadamente 30 minutos para um grupo com seis a sete animais) para cada dia de trabalho durante a semana.
NOTA: A sessão de treino inicia-se quando o treinador se encontra na biotéria/curral e está preparado para iniciar o treino. Uma sessão termina quando nenhum dos coelhos participa do treinamento (mais) ou todos os coelhos atingem a etapa final de treinamento do comportamento objetivo a ser treinado nesta sessão. Comece cada sessão de treinamento com a última etapa bem-sucedida do protocolo. Uma sessão consiste em pelo menos uma ou mais tentativas por animal.
Inicie um teste pedindo ao animal para realizar uma etapa de treinamento específica (ou seja, passo 3.1 depois que o coelho aprendeu a tocar o alvo com o nariz / boca) e termine o teste quando o animal não participar do treinamento (mais) ou o animal atingiu a etapa final de treinamento do comportamento objetivo a ser treinado. No final do treinamento, abra a arena de treinamento e guie o coelho para fora da arena; Em seguida, segure o bastão do alvo (com o alvo voltado para o teto), bem como a tigela de recompensa na frente do baú.
Programe o treinamento antes da alimentação, limpeza, tratamentos ou procedimentos experimentais.
Use uma tigela de recompensa com um clicker integrado (Figura 3, Arquivo de Codificação Suplementar 1) e, para alguns comportamentos de meta, um bastão de alvo adicional.
Encha a tigela de recompensa com comida saborosa, por exemplo, sementes de girassol e guloseimas de forrageamento à base de grãos.
NOTA: Os coelhos são folívoros e esses exemplos de recompensa não são ideais; no entanto, devido às restrições de higiene no biotério, eles eram as melhores alternativas disponíveis para esses animais. Se possível, ervas frescas devem ser preferidas como recompensa alimentar. Observe que uma recompensa só é uma recompensa se o coelho realmente a favorecer.
Certifique-se de sempre segurar a tigela de recompensa na mesma posição, por exemplo, na frente do baú, e comece a mover a tigela de recompensa em direção aos coelhos somente após o clique. Exceto pelo comportamento de meta "empinar" e "pular no colo", segure o bastão alvo em um e a tigela de recompensa na outra mão.
Apresente a recompensa no local onde o nariz / boca do coelho estava quando o comportamento desejado foi mostrado corretamente.
Tome cuidado para que o coelho coma apenas uma pequena quantidade de comida ao apresentar a recompensa.
Se um coelho mostrar o comportamento desejado pelo menos quatro vezes em um bloco de cinco tentativas (taxa de sucesso de 80%), prossiga para a próxima etapa. Se um animal não for capaz de executar a próxima etapa (ou seja, não conseguir executar a etapa mais de uma vez), retorne à etapa anterior do protocolo. Se foi necessário retornar a uma etapa anterior ou um coelho não participa do treinamento, revise os protocolos de treinamento (por exemplo, defina etapas de treinamento menores), escolha outra recompensa alimentar (mais palatável) ou verifique as habilidades de treinamento do treinador.
Se um coelho executar corretamente a etapa final de treinamento de um comportamento objetivo, termine as sessões de treinamento para este coelho no mesmo dia.
Imprima a folha de documentação (Arquivo Suplementar 1), os protocolos de treinamento detalhados, bem como os protocolos de treinamento simplificados (Arquivo Suplementar 2) e anexe-os a uma área de transferência ou abra-os em um tablet. Use a folha de documentação para anotar as etapas de treinamento alcançadas pelos animais individuais em cada sessão.

3. Condicionamento/habituação contextual

NOTA: As sessões de condicionamento/habituação contextual são realizadas diariamente pelo treinador e cuidadores de animais por aproximadamente 15 minutos por grupo de coelhos durante um período de cinco dias consecutivos (segunda a sexta-feira).

Fale suavemente com os coelhos.
Ofereça recompensas de comida saborosa.
NOTA: Esteja ciente de que mudanças repentinas na dieta podem causar problemas digestivos em coelhos. Portanto, introduza lentamente a nova recompensa alimentar.
Mova a tigela de recompensa cheia de comida saborosa em direção aos coelhos e deixe-os comer dela.
Toque suavemente os coelhos ao redor do pescoço, ombros, costas e garupa sem contê-los.

4. Apresentando o clicker

NOTA: Comportamento do objetivo: Aproxime-se do treinador e coma a recompensa da tigela após o clique. O objetivo é que o coelho associe a recompensa alimentar ao clique, ou seja, o coelho come a recompensa alimentar após o clique.

Deixe o coelho se aproximar.
Clique uma vez e mova a tigela de recompensa em direção ao coelho (conhecido como clique e guloseima ou C e T).
Repita a etapa 4.2 dez vezes. Ao clicar pela décima vez, espere um segundo antes que a recompensa seja apresentada e observe o comportamento do coelho.
NOTA: Se o animal busca a recompensa imediatamente após o clique, pode-se supor que o condicionamento do reforçador secundário foi bem-sucedido.
Repita as etapas 4.1.-4.3. no dia seguinte, se um coelho não comeu a recompensa alimentar após o clique por pelo menos oito vezes.

5. Seguindo o alvo

NOTA: Comportamento da meta: Siga e toque o alvo com nariz/boca. Os comportamentos de meta nas seções 6-9 são modificações do comportamento de meta apresentado na seção 5.

Coloque o alvo perto do nariz/boca do coelho.
NOTA: A bola no final do stick alvo é definida como alvo.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz / boca.
  NOTA: Certifique-se de que o nariz / boca do coelho não toque o bastão em nenhum local indefinido além da bola.
2. Remova o alvo do campo de visão do coelho enquanto recompensa.
3. Repita todas as etapas acima por cinco vezes até que o coelho execute com sucesso essa etapa por pelo menos quatro em cada cinco vezes (taxa de sucesso de 80%).
Coloque o alvo em um local diferente onde possa ser tocado com o nariz/boca por movimentos da cabeça sem mover todo o corpo.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz/boca e siga os passos 5.1.2 e 5.1.3.
Coloque o alvo a uma distância maior do coelho e deixe o coelho se esticar em direção a ele.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz/boca e siga os passos 5.1.2 e 5.1.3.
Aumente ainda mais a distância entre o alvo e o coelho, exigindo que o animal dê um salto para atingir o alvo.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz/boca e siga os passos 5.1.2 e 5.1.3.
Coloque o alvo bem na frente do nariz/boca do coelho para que o coelho possa tocar o alvo e, em seguida, mova lentamente o alvo para longe do coelho. Certifique-se de que o coelho deve fazer um número variável de saltos para seguir o alvo.
NOTA: Em um bloco de cinco tentativas, a^1ª,^2ª,^3ª,^4ª e^5ª vez que o coelho é recompensado após 2, 1, 2, 3 e 2 saltos, respectivamente (em média: após 2 saltos).
1. C e T quando os coelhos fizeram o número necessário de saltos e segue as etapas 5.1.2 e 5.1.3.
Repita a etapa 5.5 e mova o alvo pelo corredor entre os dois objetos.
NOTA: Para esta etapa, dois objetos, como túneis, são colocados paralelos um ao outro e formam um corredor.
1. C e T quando os coelhos fizeram o número necessário de saltos e seguir os passos 5.1.2 e 5.1.3.
Repita o passo 5.5 e mova o alvo em direção à arena de treinamento para que o coelho entre nela.
1. C e T quando os coelhos fizeram o número necessário de saltos e seguir os passos 5.1.2 e 5.1.3.

6. Pesagem

NOTA: Comportamento da meta: Permaneça na balança por pelo menos um segundo. Se a superfície da balança for muito escorregadia, uma almofada antiderrapante pode ser colocada na parte superior. No entanto, alguns coelhos tendem a roer a almofada.

Conduza o coelho com o bastão alvo em direção à balança, conforme descrito na etapa 5.5.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz / boca.
2. Remova o alvo do campo de visão do coelho enquanto recompensa.
3. Repita todas as etapas descritas acima cinco vezes até que o coelho execute com sucesso essa etapa por pelo menos quatro em cada cinco vezes (taxa de sucesso de 80%).
Mova o alvo ligeiramente acima da escala para que o coelho pise nele com as patas dianteiras para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 6.1.2 e 6.1.3.
Mova o alvo um pouco além do centro da escama para que o coelho pise nele com as patas dianteiras e se estique sobre a escama para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 6.1.2 e 6.1.3.
Mova o alvo mais além do centro da escama para que o coelho suba na balança com as patas dianteiras e traseiras para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 6.1.2 e 6.1.3.
Conduzir o coelho para a balança conforme descrito no ponto 4.4. e aguarde alguns segundos antes de C e T.
NOTA: Nesta etapa, recompense o coelho depois de sentar por um período variável de tempo na balança. Em um bloco de cinco tentativas, a^1ª,^2ª,^3ª,^4ª e^5ª vez, o coelho é recompensado após 0,5, 1,0, 2,0, 0,5 e 1,0 segundos, respectivamente (em média: 1,2 s). Enquanto o coelho fica parado durante esse tempo, o peso pode ser lido na balança. Se a balança demorar mais para estabilizar e medir o peso, aumente o tempo sentado do animal na balança.
1. C e T e siga as etapas 6.1.2 e 6.1.3.

7. Entrando na caixa de transporte

NOTA: Comportamento da meta: Entrar e sair da caixa de transporte. Para a sessão de treinamento, use uma caixa de transporte (piso de 30 cm × 50 cm; porta de 27 cm × 25,5 cm) com uma abertura na tampa (16 cm × 39 cm) cujo fundo é coberto com material de cama sujo.

Conduza o coelho com o bastão alvo em direção à caixa, conforme descrito na etapa 5.5.
1. C e T quando o coelho está na frente da entrada da caixa.
2. Remova o alvo do campo de visão do coelho enquanto recompensa.
3. Repita todas as etapas descritas acima cinco vezes até que o coelho execute a tarefa com sucesso por pelo menos quatro em cada cinco vezes (taxa de sucesso de 80%).
Segure o bastão de alvo pela abertura da tampa e mova-o para dentro da caixa, motivando assim o coelho a entrar na caixa com as patas dianteiras.
1. C e T e siga as etapas 7.1.2 e 7.1.3.
Siga o passo 7.2 e conduza o coelho para dentro da caixa (ou seja, todas as patas dianteiras e traseiras entraram na caixa).
1. C e T e siga as etapas 7.1.2 e 7.1.3.
Siga o passo 7.3 e feche a porta da caixa por alguns segundos. Em seguida, abra a porta novamente.
1. C e T e siga as etapas 7.1.2 e 7.1.3.
Siga o passo 7.3 e feche a porta da caixa. Levante cuidadosamente a caixa um pouco (ou seja, alguns centímetros acima do chão). Coloque a caixa de volta no chão e abra a porta.
1. C e T e siga as etapas 7.1.2 e 7.1.3.
Siga o passo 7.5. Em seguida, conduza o coelho com o bastão alvo para fora da caixa.
1. C e T e siga as etapas 7.1.2 e 7.1.3.

8. Criação

NOTA: Comportamento do objetivo: Coloque as patas dianteiras na palma da mão durante a criação. Para a sessão de treinamento, segure o bastão alvo e a tigela de recompensa na mesma mão.

Coloque o alvo acima da cabeça do coelho de modo que o coelho estique o nariz para cima para tocar o alvo com o nariz/boca enquanto todas as patas permanecem no chão.
1. C e T.
2. Remova o alvo do campo de visão do coelho enquanto recompensa.
3. Repita todas as etapas descritas acima cinco vezes até que o coelho execute com sucesso essa etapa por pelo menos quatro em cada cinco vezes (taxa de sucesso de 80%).
Coloque o alvo acima da cabeça do coelho, conforme descrito na etapa 8.1. Depois que o coelho esticar o nariz para cima, mova o alvo mais para cima para que o coelho levante as patas dianteiras do chão e toque o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 8.1.2 e 8.1.3.
  NOTA: Se o coelho não executar 8.2, uma etapa intermediária pode ser adicionada após 8.2. Para isso, siga 8.2 e depois aproxime-se e toque as patas dianteiras do coelho (superfície palmar) com a palma da mão livre. C e T e siga as etapas 8.1.2 e 8.1.3.
Coloque a palma da mão livre na frente do coelho e mova o alvo acima da cabeça do coelho para que o coelho coloque as patas dianteiras na mão para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T após um segundo e siga as etapas 8.1.2 e 8.1.3.
  NOTA: Enquanto as patas dianteiras repousam sobre a mão do treinador, o abdômen do coelho pode ser inspecionado visualmente.

9. Pulando no colo

NOTA: Comportamento do objetivo: Pule no colo do treinador e permaneça sentado enquanto é tocado. Para as etapas 9.5-9.9, segure o bastão alvo e a tigela de recompensa na mesma mão, pois uma mão precisa tocar o coelho.

Conduza o coelho com o bastão alvo perto do treinador, conforme descrito na etapa 5.5 do protocolo.
1. C e T quando o coelho toca o alvo com o nariz / boca.
2. Remova o alvo do campo de visão do coelho enquanto recompensa.
3. Repita todas as etapas descritas acima cinco vezes até que o coelho execute com sucesso essa etapa por pelo menos quatro em cada cinco vezes (taxa de sucesso de 80%).
Mova o alvo acima das pernas do treinador para que o coelho coloque as patas dianteiras nas pernas para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Mova o alvo acima das pernas e um pouco mais longe do coelho para que o coelho coloque as patas dianteiras nas pernas e se estique para a frente para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
  NOTA: Se o coelho não executar 9.4, uma etapa intermediária pode ser adicionada após 9.3. Para isso, siga o passo 9.3 e atraia o coelho com a tigela de recompensa para o colo. Quando o coelho colocou todas as quatro patas no colo, C e T e siga os passos 9.1.2 e 9.1.3.
Mova o alvo acima das pernas e ainda mais longe do coelho para que o coelho pule no colo para tocar o alvo com o nariz / boca.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Siga o passo 9.4. e acaricie cuidadosamente o coelho com a mão livre do crânio para o caudal (começando no ombro) enquanto o coelho se senta no colo.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Siga o passo 9.4 e acaricie cuidadosamente as orelhas do coelho com a mão livre do crânio para o caudal enquanto o coelho se senta no colo.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Siga o passo 9.4. e segure suavemente uma das orelhas do coelho para inspecionar visualmente as orelhas.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Siga o passo 9.4. e acariciar uma pata dianteira ou traseira com a mão livre enquanto o coelho se senta no colo.
NOTA: Se o lado direito do corpo do coelho estiver voltado para o lado esquerdo do corpo e o lado esquerdo do corpo para longe do treinador, as patas esquerdas podem ser tocadas suavemente (e vice-versa). Certifique-se de treinar os dois lados alternadamente.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.
Siga o passo 9.4. e levante cuidadosamente a pata dianteira ou traseira com a mão livre enquanto o coelho se senta no colo.
NOTA: As garras podem ser inspecionadas quando as patas são levantadas. Certifique-se de treinar os dois lados alternadamente.
1. C e T e siga as etapas 9.1.2 e 9.1.3.

Resultados

Nas seções a seguir, informações sobre materiais e métodos que vão além do protocolo são fornecidas junto com os resultados representativos.

Estatística

Os dados obtidos a partir do protocolo citado acima foram armazenados em planilhas e analisados por meio de software para análise estatística avançada (Tabela de Materiais). Testes de normalidade (inspeção visual de histogramas e qq-plots, comparação de média, desvio padrão e mediana) foram realizados para os parâmetros contínuos. As diferenças entre os parâmetros investigados no teste de aproximação voluntária (tempo de duração interagindo com o treinador e a pessoa desconhecida, toques nas patas dianteiras-pernas) foram analisadas por meio do teste dos postos sinalizados de Wilcoxon. As diferenças entre as técnicas de manuseio foram analisadas usando o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon ou o teste de McNemar (se binário). As diferenças foram consideradas significativas em p < 0,05. Ao usar o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon, a distribuição das diferenças teve que ser simétrica de acordo com a inspeção visual do histograma.

O estudo foi exploratório. A análise de poder com base no tempo de interação dos coelhos com os "dispositivos de manuseio" foi realizada após o estudo (teste dos postos sinalizados de Wilcoxon; ≥ de poder 0,999) usando G*Power (versão 3.1.9.7)⁵².

Habituation

Todos os coelhos, exceto os # 4 e # 10, ingeriram comida da tigela de recompensa e deixaram o treinador tocá-los em todas as sessões de habituação. O coelho # 4 não aceitou a recompensa alimentar na^1ª sessão, mas comeu quatro vezes da tigela de recompensa na^2ª sessão. A quantidade de ingestão de recompensa, no entanto, aumentou nas sessões posteriores e o coelho também pôde ser tocado. O coelho # 10 também exigiu mais tempo para se habituar ao treinador e à recompensa alimentar. Na primeira sessão, o coelho aceitou a recompensa alimentar do treinador após 5 minutos, mas não pôde ser tocado. Na 2ª sessão, não foi observado interesse pela alimentação. Nas sessões subsequentes, no entanto, o coelho # 10 aceitou recompensas e toques alimentares.

Apresentando o clicker

Doze dos treze coelhos completaram com sucesso a seção 4 do protocolo em um dia e associaram a recompensa alimentar (reforçador primário) ao clique (reforçador secundário) nesta sessão de treinamento. A associação foi testada observando o comportamento dos coelhos após o clique ser apresentado pela décima vez. Quando um animal buscava a recompensa imediatamente após o clique, presumia-se que o coelho associava o primário ao reforçador secundário. O coelho # 4 não comeu a recompensa alimentar após o clique no dia 1. O coelho # 4 levou um dia a mais (ou seja, dois dias) para associar com sucesso o clique e a recompensa alimentar.

Seguindo o alvo

A Tabela 1 fornece o número de sessões de treinamento (dadas como mediana^{, percentil} 25 e percentil 75⁾ necessárias para ensinar aos coelhos os comportamentos objetivos dos protocolos. Os coelhos levaram 2 sessões de treinamento (mediana) para seguir o bastão alvo até a arena de treinamento (Tabela 1). Todos os coelhos alcançaram a etapa final (5,7) desse comportamento objetivo.

O coelho # 4 e o coelho # 7 precisaram de 7 e 8 sessões de treinamento, respectivamente, antes de seguirem o bastão alvo para a arena de treinamento. Como o coelho # 7 não conseguiu concluir a etapa 5.4 e não deu um salto para seguir o stick alvo, uma etapa de treinamento adicional (5.3+) foi implementada no protocolo após a etapa 5.3. Na etapa 5.3+, o bastão alvo foi colocado a uma distância maior do coelho do que no 5.3 e o coelho teve que se esticar em direção a ele em direções diferentes, mas o bastão alvo ainda era alcançável sem dar um salto. O coelho # 4 teve problemas com a etapa 5.5 e não foi capaz de seguir o bastão alvo, que foi colocado logo na frente do nariz / boca, por um número variável de saltos. Portanto, uma etapa adicional 5.4+ foi adicionada ao protocolo. Nesse caso, o bastão foi colocado bem na frente do nariz / boca do coelho e foi movido em direções diferentes, exigindo que o coelho desse um salto. A mesma etapa adicional também foi usada com sucesso para o coelho # 7. Depois de concluir as etapas adicionais de treinamento com uma taxa de sucesso de pelo menos 80%, eles puderam continuar com as etapas seguintes.

Pesagem

Os coelhos necessitaram de 1 sessão de treinamento (mediana) até a realização do passo 6.5 (ou seja, permanecer na balança por um período de tempo variável) (Tabela 1). Todos os coelhos alcançaram a etapa final (6,5) desse comportamento objetivo.

Entrando na caixa de transporte

Os coelhos realizaram com sucesso todas as etapas de 7,1 a 7,6 (ou seja, entrar e sair da caixa de transporte após o levantamento) em 2 sessões de treinamento (mediana) (Tabela 1). Todos os coelhos alcançaram a etapa final (7,6) desse comportamento objetivo.

Quando os coelhos #2 e #3 executaram com sucesso a etapa 7.6 pela primeira vez, eles não quiseram entrar novamente na caixa de transporte para repetir esta etapa. Portanto, foi criado o passo 7.5+: depois que o animal seguiu o bastão alvo em direção à caixa, a tigela de recompensa foi segurada pela abertura da tampa e o animal foi atraído para dentro da caixa. Assim que o coelho entrou na caixa, a porta foi fechada e a caixa cuidadosamente levantada. Depois de colocar a caixa de volta no chão, a porta foi aberta e o coelho foi conduzido com o bastão alvo para fora da caixa. Ambos os animais conseguiram realizar o passo 7.5+ por pelo menos 4 vezes, seguido pelo passo 7.6 no dia seguinte.

Criação

Foi necessária 1 sessão de treinamento (mediana) até que os coelhos concluíssem com sucesso a etapa 8.3 (ou seja, colocar as patas dianteiras na mão do treinador) (Tabela 1). Como 11 dos 13 coelhos (ou seja, todos, exceto # 3 e # 7), falharam em realizar a etapa 8.3, uma etapa de treinamento adicional 8.2+ após 8.2 foi definida para esses animais. Na etapa 8.2+, o bastão do alvo foi movido acima da cabeça do coelho para que o coelho levantasse as patas dianteiras do chão e tocasse o alvo com o nariz / boca. Enquanto o coelho tocava o alvo, o treinador se aproximou e tocou as patas dianteiras (superfície palmar) com a palma da mão livre. Depois que a etapa 8.2+ foi realizada com sucesso em pelo menos quatro das cinco tentativas, a etapa 8.3 foi treinada novamente e concluída.

Pulando no colo

2.5 Foram necessárias sessões de treinamento (mediana) para treinar os coelhos nas etapas 9.1. para 9.9. (Tabela 1). Dez coelhos foram capazes de alcançar a etapa final 9.9 (ou seja, aceitar que suas patas fossem tocadas enquanto estavam sentados no colo do treinador). O coelho # 4 alcançou apenas o passo 9.2 (ou seja, colocar as patas dianteiras nas pernas do treinador) e o coelho # 10 alcançou o passo 9.3 (ou seja, pular no colo do treinador). O coelho # 7 alcançou a etapa 9.3+, que foi uma etapa intermediária adicional após a etapa 9.3. Nesse caso, o coelho colocou as patas dianteiras nas pernas do treinador, conforme descrito na etapa 9.2, e foi então atraído com a tigela de recompensa no colo do treinador. Uma vez que todas as quatro patas foram colocadas no colo do treinador, o clique e a recompensa foram apresentados. Esta etapa foi adicionada com sucesso ao protocolo para oito coelhos para facilitar a realização das etapas seguintes.

Generalização

Para avaliar se os coelhos generalizavam as pistas treinadas para realizar os comportamentos de objetivo com outras pessoas que não o treinador, uma cuidadora de animais, que conhecia os coelhos, mas tinha poucas experiências anteriores em treinamento com clicker, pediu aos coelhos que realizassem os comportamentos de objetivo treinados "pesar", "entrar na caixa de transporte", "empinar" e "pular no colo". Se um coelho não aprendeu anteriormente a etapa final de "pular no colo", a última etapa de treinamento bem-sucedida deve ser demonstrada.

As sessões ocorreram em cinco dias consecutivos após o término do treinamento de 3 semanas (Figura 1). O cuidador do animal leu os protocolos de treinamento antes da^1ª sessão. No início da^1ª sessão, o treinador fez uma breve demonstração de todos os comportamentos objetivos. Em seguida, ela ficou no curral, deu instruções durante as sessões e documentou qual etapa dos comportamentos objetivos os coelhos exibiam. Se um coelho não apresentasse uma etapa específica, o cuidador do animal era instruído a retornar à etapa anterior do protocolo.

Todos os coelhos, exceto o coelho #4, realizaram os comportamentos-alvo "pesagem", "entrada na caixa de transporte" e "criação" (dados fornecidos como mediana) após 1 sessão, 2 sessões e 2 sessões, respectivamente (Tabela 2). O coelho # 4 não estava disposto a mostrar nenhuma etapa desses comportamentos objetivos.

Oito dos dez animais que foram capazes de mostrar o passo final de "pular no colo" (9,9) demonstraram esse comportamento após 3 sessões (mediana). Embora o coelho # 3 e # 11 já tivessem aprendido a etapa final de "pular no colo" (9.9), eles mostraram apenas a etapa 9.3 com o cuidador do animal. Os coelhos # 4, # 7 e # 10 mostraram o mesmo passo que com o treinador (9.2, 9.3+ e 9.3).

Desempenho de comportamentos de meta após intervalos de treinamento de 1 semana

Para testar se os animais conseguiam reter as etapas finais de "pesagem", "entrada na caixa de transporte", "empinação" e "salto no colo", o treinador recuperou os comportamentos objetivo uma semana e duas semanas após as sessões de generalização (Figura 1). Durante esses intervalos, os animais não foram treinados e não receberam nenhuma recompensa.

Em ambos os momentos, todos os coelhos foram capazes de realizar as etapas finais de "pesagem" (6,5), "entrada na caixa de transporte" (7,6) e "criação" (8,3) que aprenderam no treinamento anterior de 3 semanas. Os animais (n = 10) que aprenderam a etapa final de "pular no colo" (9,9) apresentaram esse comportamento em ambos os momentos; Aqueles que não aprenderam a etapa final desse comportamento objetivo (n = 3) foram capazes de demonstrar a última etapa que alcançaram anteriormente (Coelho # 4: Etapa 9.2; Coelho # 7: Etapa 9.3 +, Coelho # 10: Etapa 9.3) após o primeiro intervalo de 1 semana. Após o segundo intervalo de 1 semana, esses três coelhos mostraram as mesmas etapas da semana anterior, mas também foram solicitados a realizar as próximas etapas e alcançaram a etapa 9.9.

Desempenho de comportamentos de meta após uma pausa de treinamento de aproximadamente 8,5 semanas

Depois que os animais tiveram uma pausa no treinamento de aproximadamente 7,5 semanas (# 1-5, # 13) ou 9,5 semanas (# 6-12), os comportamentos objetivo foram lembrados novamente. Todos os animais foram capazes de apresentar a etapa final de "pesagem" (6,5), "entrada na caixa de transporte" (7,6) e "recria" (8,3). Doze coelhos exibiram o passo final de "pular no colo" (9,9), enquanto o coelho # 7 apenas colocou as patas dianteiras nas pernas do treinador e se esticou para a frente para tocar o alvo com o nariz / boca (9,3).

Abordagem voluntária para o treinador familiar e uma pessoa desconhecida

Três semanas após o treinamento, o comportamento de abordagem voluntária dos coelhos foi testado para investigar sua interação com o treinador familiar e uma pessoa desconhecida (ambas fêmeas). Antes do teste, ambas as pessoas tomaram banho com o mesmo gel de banho e xampu, vestiram o mesmo tipo de roupa e equipamento de proteção (luvas, máscaras, redes de cabelo). Foram realizadas duas tentativas de 5 minutos com um intervalo de 2 minutos entre as tentativas no curral dos animais. Conforme mostrado na Figura 4A, o treinador familiar e uma pessoa desconhecida sentaram-se (na mesma posição) um em frente ao outro no chão do curral, com as costas voltadas para a parede do curral. Duas casas foram removidas do curral; A casa restante e o túnel foram colocados perto das outras duas paredes, à mesma distância de ambas as pessoas. No^2º teste, eles trocaram a localização de seus assentos para considerar as possíveis preferências de lugar dos coelhos. Eles não se moveram nem conversaram durante os testes de 5 minutos. Se um coelho mastigasse suas calças e beliscasse sua perna, uma mão era gentilmente movida em direção ao coelho para fazê-lo parar. Deve-se notar que as observações dos animais individuais foram feitas dentro do grupo, ou seja, os coelhos puderam interagir uns com os outros durante os dois ensaios.

Os vídeos foram analisados retrospectivamente usando o BORIS⁵³. De acordo com o etograma definido para esta investigação, um coelho interagiu com uma pessoa quando todas as quatro patas estavam no quadrado de 70 cm × 70 cm ao redor de uma pessoa ou na linha de fronteira desse quadrado. Além disso, foi monitorado se um coelho colocava as duas patas dianteiras nas pernas ou pulava no colo (com as quatro patas sendo colocadas no colo).

A Figura 4B mostra o tempo de interação dos coelhos com as duas pessoas. O teste de postos sinalizados de Wilcoxon revelou que o tempo de interação com o treinador e a pessoa desconhecida diferiu significativamente na^1ª tentativa (z = -2,040, p = 0,041, coeficiente de correlação de Pearson r = 0,57), mas não na^2ª tentativa (z = 0,245, p = 0,807, r = 0,07). Na^1ª tentativa, os coelhos passaram mais tempo interagindo com o treinador.

Três (# 1, # 5, # 6) e cinco (# 1, # 6, # 7, # 8, # 12) coelhos colocaram suas patas dianteiras nas pernas do treinador nas tentativas 1 e 2, respectivamente. Cinco animais pularam com as quatro patas no colo do treinador (teste 1: # 1, # 3, # 5, # 6; teste 2: # 9). Enquanto quatro animais (# 1, # 2, # 8, # 9) na^1ª tentativa e três (# 1, # 4, # 8) animais na^2ª tentativa subiram com as patas dianteiras nas pernas da pessoa desconhecida, nenhum deles pulou com as quatro patas em seu colo. A média das diferenças entre o número de "toques nas patas dianteiras-pernas" não diferiu significativamente entre o treinador e a pessoa desconhecida na tentativa 1 (z = -0,264, p = 0,792, r = 0,07) nem na tentativa 2 (z = -0,707, p = 480, r = 0,20).

Efeito das técnicas de manuseio no comportamento dos coelhos em relação ao "dispositivo de manuseio"

Para investigar se as técnicas utilizadas para levantar os coelhos do chão afetavam seu comportamento, foi realizada uma observação comportamental de 2 min após esse procedimento no contexto do exame geral em dois dias consecutivos (Figura 1). Esta observação foi realizada em sete animais.

No dia 1, os coelhos foram recolhidos com a caixa de transporte. Para isso, seguiram o bastão alvo até a caixa, a caixa foi fechada e levada para a mesa de exame, conforme descrito na etapa 7.5 do treinamento. Aqui eles foram gentilmente levantados da caixa para a mesa, com as duas mãos / braços colocados abaixo / ao redor do corpo do animal. Uma inspeção de saúde (incluindo palpação do corpo, inspeção visual de orelhas, olhos, narinas, incisivos, região anogenital) foi realizada e uma recompensa alimentar foi oferecida a eles posteriormente. Após a inspeção sanitária, eles foram guiados suavemente com as mãos para dentro da caixa de transporte. O bastão de alvo não foi usado na mesa de exame para garantir que as mãos do treinador estivessem livres para proteger os animais. Quando os coelhos entraram novamente na caixa de transporte e a porta foi fechada, a caixa foi transferida para o curral e a porta foi aberta. O coelho foi feito para seguir o bastão alvo e sair da caixa, seguido da apresentação da recompensa alimentar, conforme descrito na etapa 7.6 do treinamento.

No dia 2, os coelhos foram apanhados pela técnica convencional, usada rotineiramente pelos cuidadores dos animais (ou seja, eles foram contidos pela nuca com uma mão e brevemente levantados no outro braço com a cabeça voltada para a dobra do braço). Em seguida, foram transferidos para a mesa de exame e realizada uma inspeção sanitária, conforme descrito acima. Após a inspeção de saúde, uma recompensa alimentar da tigela de recompensa foi oferecida a eles. Finalmente, eles foram novamente contidos pela nuca e brevemente levantados no braço para trazê-los de volta ao curral. Depois que eles foram libertados, uma recompensa alimentar foi oferecida a eles novamente.

Depois que a recompensa alimentar foi oferecida aos coelhos no curral, o treinador sentou-se no chão do curral sem interagir com os coelhos e um vídeo de 2 minutos foi gravado, que foi analisado retrospectivamente usando o BORIS⁵³. Deve-se notar que as observações de animais individuais foram feitas dentro do grupo porque eles deveriam ser monitorados em seu ambiente familiar. Isso significa que os coelhos podem interagir uns com os outros. Os seguintes parâmetros foram investigados e definidos: Tempo de duração gasto interagindo com o treinador ou a caixa de transporte (ou seja, um coelho estava na zona de interação do treinador ou da caixa de transporte quando o nariz estava a menos de um comprimento de corpo do treinador ou da caixa); tempo de permanência na caixa de transporte (ou seja, esse evento ocorreu quando o animal estava na zona de interação da caixa; começou quando os coelhos entraram na caixa com as quatro patas e parou quando uma ou mais patas foram colocadas fora da caixa); tempo gasto comendo (ou seja, o coelho ingeriu palha, feno, pellets ou fezes; mastigar as roupas ou sapatos do treinador não foi considerado como comer); tempo de tempo gasto escondido (este evento começou quando o coelho entrou em uma casa ou túnel com as quatro patas; parou quando o coelho saiu do abrigo com uma ou mais patas); pular no colo (ou seja, o coelho pulou no colo do treinador e colocou as quatro patas nele; este evento ocorreu quando o animal estava na zona de interação do treinador); colocar as patas dianteiras nas pernas (ou seja, o coelho colocou as duas patas dianteiras nas pernas do treinador; este evento ocorreu quando o animal estava na zona de interação do treinador).

A análise comportamental foi realizada pelo treinador e por uma pessoa totalmente cega para o procedimento realizado. De acordo com Landis e Koch⁵⁴, a confiabilidade entre o treinador e a pessoa cega calculada usando BORIS⁵³ (Cohens Kappa) foi substancial a quase perfeita. Para posterior análise, foram utilizados dados extraídos pelo observador cego.

O teste dos postos sinalizados de Wilcoxon revelou que a técnica de manuseio convencional reduziu significativamente o tempo gasto interagindo com o "dispositivo de manuseio", ou seja, a soma do tempo gasto interagindo com o treinador e a caixa após ser pego (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,89; Figura 5A). A técnica de manuseio não afetou significativamente o tempo de duração da interação com o treinador (z = 1,014, p = 0,310, r = 0,28; Figura 5B). Em contraste, pegar os coelhos pela caixa aumentou o tempo de interação com a caixa (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,66; Figura 5C) e gasto na caixa (z = 2,201, p = 0,028, r = 0,61; Figura 5D) quando comparado à técnica de manuseio convencional. Além disso, os animais passaram mais tempo escondidos nos abrigos após serem recolhidos pela técnica de manejo convencional (z = -1,992, p = 0,046, r = 0,046; Figura 5F).

A técnica de manejo não teve efeito significativo sobre o tempo de alimentação dos animais (z = 0,944, p = 0,345, r = 0,26; Figura 5E), o número de coelhos que colocaram as patas dianteiras nas pernas do treinador (McNemar: p = 1,000) ou pularam no colo do treinador (McNemar: p = 0,500). Independentemente da técnica de manuseio, o coelho # 9 pulou no colo do treinador e o coelho # 12 colocou as patas dianteiras nas pernas do treinador. Além disso, os coelhos # 8 e # 11 colocam as patas dianteiras nas pernas depois de serem apanhados pela caixa de transporte.

Enquanto a recompensa alimentar oferecida na mesa de exame foi ingerida por todos os coelhos após o breve transporte na caixa, apenas um coelho (# 8) a aceitou após a técnica de manuseio convencional. Essa diferença foi significativa (McNemar: p = 0,031). No curral, a recompensa alimentar foi aceita por seis coelhos (ou seja, todos, exceto o #7) após saírem da caixa de transporte e quatro coelhos (#7, #9, #10 e #12) após serem soltos do braço (técnica de manuseio convencional; McNemar: p = 0,625).

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Figura 1: Cronograma. Todas as sessões de habituação, treinamento e generalização, bem como observações comportamentais, foram realizadas pela manhã antes da alimentação e limpeza. Na semana 1 (ou seja, quatro dias após a chegada), cinco sessões de condicionamento/habituação contextual (segunda a sexta-feira; seção de protocolo 3) foram realizadas pelos cuidadores dos animais e pelo autor correspondente (todas as fêmeas), seguidas por um período de treinamento de 3 semanas nas semanas 2-4 (segunda a sexta-feira; seção de protocolo 4-9). As sessões de treinamento foram conduzidas pelo autor correspondente, que é um veterinário especializado em ciência de animais de laboratório e experiente no treinamento de coelhos, camundongos, galinhas e cavalos. Em seguida, foram feitas observações comportamentais em dois dias consecutivos para investigar se a técnica utilizada para levantar os coelhos do chão afetava seu comportamento. Na semana 5, cinco sessões de generalização (segunda a sexta-feira) foram realizadas para avaliar se os coelhos realizariam os comportamentos objetivos aprendidos com outra pessoa que não o treinador. Na semana 6 e na semana 7 (às quintas-feiras), bem como na semana 14 (segunda/terça-feira), o treinador testou, no contexto da inspeção geral de saúde semanal, se os coelhos conseguiam reter e mostrar os comportamentos objetivos. Um teste de abordagem voluntário com o treinador e uma pessoa desconhecida foi realizado na semana 7 para investigar as respostas comportamentais dos coelhos em relação a humanos familiares versus desconhecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Arena de treinamento. A arena de treinamento (ver Tabela de Materiais) foi montada alguns minutos antes do início do treinamento. (A) Para facilitar o transporte e a instalação, a arena consistia em duas peças, que eram conectadas entre si no curral. (B) Duas fileiras de painéis de plástico transparente criaram uma arena de aproximadamente 136 cm × 90 cm × 70 cm. A porta foi fixada aos demais painéis por meio de abraçadeiras que permitiam abri-la e fechá-la. A porta pode ser trancada usando um clipe. Como as paredes da arena de treinamento eram transparentes, um coelho teve contato visual, olfativo e acústico com os membros do grupo quando entrou na arena de treinamento. Um banquinho/degrau baixo como assento para o treinador e, dependendo do comportamento objetivo a ser treinado, uma balança ou uma caixa de transporte podem ser colocadas na arena. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Tigela de recompensa com clicker integrado. A tigela de recompensa foi impressa em 3D usando ácido polilático branco (PLA). Tamanho da tigela quadrada: 8 cm × 8 cm × 3 cm; Tamanho do cabo cilíndrico: 9,5 cm × 2,3 cm. Um clicker de dedo (consulte Tabela de Materiais) foi anexado à alça. Um arquivo de impressão 3D para a tigela de recompensa pode ser encontrado no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Teste de aproximação voluntária. (A) Nas duas tentativas de 5 minutos, o treinador familiar e uma mulher desconhecida sentaram-se um em frente ao outro no curral, com as costas voltadas para a parede do curral. Uma casa e um túnel foram colocados perto das outras duas paredes, à mesma distância de ambas as pessoas. (B) O tempo gasto interagindo com uma pessoa foi analisado para cada coelho. Um coelho interagiu com uma pessoa quando todas as quatro patas estavam no quadrado de 70 cm × 70 cm ao redor de uma pessoa ou na linha de fronteira deste quadrado. Os símbolos indicam os dados de cada animal individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Efeitos das técnicas de manuseio no comportamento dos coelhos. (A-F) Ilustrações de dados comportamentais coletados de sete coelhos após serem manuseados pela caixa de transporte ou pela técnica convencional (ou seja, eles foram contidos pela nuca e levantados no braço). Como o treinador e a caixa de transporte foram considerados "dispositivos de manuseio", (A) Este painel mostra a soma dos painéis B e C. Os símbolos indicam os dados de cada animal individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coelho	Número de sessões de treinamento necessárias para treinar o comportamento da meta
Coelho	Seguindo o alvo	Pesagem	Entrando na caixa de transporte	Criação	Pulando no colo
#1	1	1	2	2	2
#2	1	1	4	1	5
#3	2	1	3	1	4
#4	7	2	1	3	2 (etapa 9.2)
#5	2	1	3	1	3
#6	2	1	2	1	1
#7	8	1	2	2	3 (passo 9.3+)
#8	2	1	2	1	1
#9	2	1	2	1	2
#10	2	2	3	3	5 (passo 9.3)
#11	2	1	2	2	4
#12	2	1	1	1	1
#13	2	3	1	2	4
Mediana (percentil 25 a 75)	2	1	2	1	2.5
Mediana (percentil 25 a 75)	(2–2)	(1–1.5)	(1.5–3)	(1–2)	(1–4)*

Tabela 1: Número de sessões necessárias para treinar os comportamentos de meta. Se um coelho não aprendeu a etapa final de um comportamento objetivo, a última etapa de treinamento alcançada é indicada entre parênteses.

Definição de uma sessão de treinamento: aproximadamente 30 minutos por grupo (6-7 animais); De segunda a sexta-feira durante três semanas; começa quando o treinador se senta no curral e está preparado para iniciar o treinamento; termina quando nenhum dos coelhos participa mais do treinamento ou todos os coelhos alcançam uma etapa final de um comportamento objetivo; Um animal pode realizar mais de um teste por sessão.

* Os coelhos #4, #7, #10 foram excluídos deste cálculo, pois não atingiram a etapa final de "pular no colo".

Coelho	Número de sessões de treinamento até que a etapa final do comportamento objetivo fosse alcançada
Coelho	Pesagem (5 etapas de treinamento)	Entrando na caixa de transporte (6 etapas de treinamento)	Criação (3 etapas de treinamento)	Salto no colo (9 etapas de treinamento)
#1	1	3	1	1
#2	1	3	1	1
#3	1	3	1	F (9,3)
#4	F	F	F	3 (9.2)
#5	2	3	2	2
#6	1	1	3	3
#7	1	1	3	3 (9.3+)
#8	1	1	1	3
#9	1	1	1	3
#10	1	3	3	3 (9.3)
#11	1	1	3	F (9,3)
#12	1	1	3	3
#13	1	3	2	5
Mediana (percentil 25 a 75)	1	2	2	3
	(1–1)	(1–3)	(1–3)	(1.25–3)
	(excluindo # 4)	(excluindo # 4)	(excluindo # 4)	(excluindo #3, #4, #7, #10, #11)

Tabela 2: Generalização. Em cinco sessões (de segunda a sexta-feira), um cuidador de animais familiar aos coelhos pediu aos coelhos que realizassem as etapas finais (ou a última etapa alcançada) dos comportamentos de meta treinados. Se a etapa final de um comportamento objetivo não foi alcançada, a última etapa de treinamento alcançada é indicada entre parênteses. F (falha) foi indicado quando um animal não apresentou o último passo de um comportamento objetivo previamente alcançado no treinamento. Definição de uma sessão: Segunda a sexta-feira durante uma semana; começa quando o cuidador e o treinador do animal se sentam no curral; termina quando nenhum dos coelhos participa (mais) ou todos os coelhos mostraram a etapa final (ou a última etapa alcançada) de um comportamento desejado; Um animal pode realizar mais de um teste por sessão.

Arquivo de codificação suplementar 1: Arquivo de impressão 3D "tigela de recompensa". O ácido polilático (PLA) pode ser usado para a impressão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Folha de documentação para seis coelhos. A folha deve ser impressa ou aberta em um tablet para documentar o progresso do treinamento de cada coelho. Em cada sessão de treinamento, deve-se observar quais etapas de treinamento os animais individuais alcançaram ou se foram necessárias adaptações ao protocolo. Quaisquer ocorrências especiais (por exemplo, fatores externos, estado de saúde prejudicado) também devem ser documentadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Protocolos de treinamento simplificados. As tabelas descrevem as etapas das seções 3 a 9 do protocolo de maneira simplificada. Para mais detalhes, as etapas do protocolo do manuscrito principal devem ser lidas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Os protocolos de treinamento foram desenvolvidos para refinar procedimentos rotineiros, como manuseio, inspeções sanitárias e pesagem em coelhos de laboratório. Sua viabilidade foi avaliada neste estudo exploratório usando treze fêmeas de coelhos brancos da Nova Zelândia. Os protocolos de treinamento podem ser aplicados de forma confiável para treinar os coelhos com sucesso. A maioria dos coelhos foi capaz de aprender os comportamentos objetivos definidos nos protocolos de treinamento em menos de 3 semanas de treinamento, lembrou-se deles após intervalos de treinamento de 1 semana e os generalizou para outra pessoa que não o treinador. Poucas adaptações ao protocolo tiveram que ser feitas para atender às necessidades de animais individuais. O principal achado do presente estudo foi que a técnica de manuseio refinada para pegar coelhos, conforme descrito nos protocolos de treinamento, foi menos aversiva do que a técnica de manuseio convencional. Curiosamente, os coelhos treinados mostraram seu comportamento exploratório não apenas em relação ao treinador familiar, mas também a uma pessoa desconhecida em um teste de abordagem voluntária.

Significado do alvo

O objetivo serviu de base para o presente protocolo de treinamento. Ao introduzir o alvo, os animais aprenderam que seu comportamento afetava o meio ambiente e gerava consequências. A introdução do alvo cria confiança entre o humano e o animal, como demonstrado pelo coelho # 4, foram necessárias 7 sessões de treinamento antes de seguir o bastão alvo para a arena de treinamento, mas aprendeu os seguintes comportamentos de objetivo rapidamente (ou seja, dentro de 1-3 sessões de treinamento). Este coelho # 4 pareceu ganhar confiança no treinador durante a introdução do alvo, o que facilitou o treinamento dos outros comportamentos objetivos. No entanto, este coelho ainda não tinha confiança em outras pessoas e não estava disposto a mostrar a maioria dos comportamentos objetivos nas sessões de generalização.

Deve-se notar que o destino não foi definido como ponto final em algumas seções do protocolo. Em vez disso, por exemplo, os animais tiveram que seguir a meta por um número variável de saltos ou permanecer na balança por um número variável de segundos. O padrão de recompensa variável foi escolhido para aumentar e manter a atenção e motivação dos coelhos no treinamento.

Sinais

Depois que os coelhos executaram com sucesso a etapa 5.1, em todas as sessões de treinamento seguintes, o treinador colocou o alvo a uma curta distância do nariz do coelho para sinalizar ao coelho que o teste de treinamento começou. Se o coelho tocasse o alvo com o nariz/boca, a vontade de participar do treinamento era considerada e o treinamento começava.

Os protocolos atuais não incluíam mais sinais, por exemplo, a balança, a caixa de transporte ou a mão não eram considerados sinais. Em vez disso, o alvo foi usado para levar o animal para a arena de treinamento, para a balança, para a caixa de transporte, para o ar (criação) ou para o colo do treinador. Isso significa que os comportamentos de meta "pesar", "entrar na caixa de transporte", "empinar" e "pular no colo" foram modificações de "seguir o alvo". A razão para isso foram os requisitos para o protocolo de treinamento: ele deve ser viável de ser realizado pela equipe de biotérios, que podem não ser especialistas em treinamento de animais, e facilmente integrado à rotina diária de trabalho. Portanto, os protocolos devem ser eficientes e atingir os comportamentos desejados rapidamente.

No entanto, a mão que é colocada na frente do coelho (passo 8.3), a balança ou a caixa de transporte também têm o potencial de se tornar um sinal e um alvo para as patas. Portanto, pode ser possível definir outras etapas que vão além dos protocolos atuais e não requerem o uso do bastão alvo. Por exemplo, assim que o coelho vê a balança, a balança sinaliza aos coelhos para pular nela com as quatro patas.

Adaptações dos protocolos

Embora se possa esperar que o fenótipo de animais de laboratório quase geneticamente idênticos seja muito semelhante, existem "diferenças comportamentais entre indivíduos que são consistentes ao longo do tempo e em todas as situações [e] são chamadas de personalidade"⁵⁵, por exemplo, alguns animais são bastante tímidos e outros ousados⁵⁶. Pode levar mais tempo para que animais tímidos e menos exploradores aprendam os comportamentos objetivos definidos do protocolo (por exemplo, coelho # 4). Mesmo que os protocolos de treinamento padrão possam ser adequados para a maioria, o treinamento deve considerar as necessidades de um animal individual e se adaptar a elas, quando necessário²⁶. Assim, etapas intermediárias menores adicionais devem ser definidas para os coelhos que não conseguem aprender uma etapa de treinamento do protocolo. As etapas adicionais de treinamento intermediário devem ajudá-los a prosseguir com sucesso para a etapa seguinte. Especialmente porque os planos de treinamento são desenvolvidos em teoria e depois testados na prática, pode se tornar aparente que etapas adicionais de treinamento são necessárias para treinar um comportamento de objetivo específico.

Com relação aos protocolos de treinamento atuais, algumas etapas de treinamento intermediárias tiveram que ser adicionadas para os comportamentos objetivos "seguir o alvo", "entrar na caixa de transporte", "criar" e "pular no colo", conforme descrito em detalhes na seção sobre os resultados representativos, uma vez que os animais individuais não continuaram com a etapa de treinamento seguinte. Curiosamente, as etapas intermediárias 8.2+ e 9.3+ foram exigidas pela maioria dos coelhos, enfatizando sua importância. Portanto, essas etapas foram adicionadas como uma nota aos protocolos de treinamento.

Alternativamente, para o passo definido 8.2+, o treinador pode colocar a mão no chão com a palma voltada para cima e deixar o coelho pisar na mão com uma e, eventualmente, ambas as patas dianteiras. Além disso, é concebível que um coelho exija etapas intermediárias adicionais antes da etapa 9.3+, por exemplo, primeiro o coelho coloca uma pata traseira e depois as duas patas traseiras no colo do treinador. Se um coelho não aceitar ser tocado nas etapas 9.5-9.9, a duração do toque nas diferentes partes do corpo pode ser aumentada gradualmente. Além disso, inicialmente apenas os dedos indicador e médio podiam ser usados para acariciar os animais com uma leve pressão como uma pena. Em seguida, o número de dedos usados para tocar e a pressão podem ser aumentados em várias etapas.

Refinamento das técnicas de manuseio

Pode-se supor que o manuseio é altamente aversivo, especialmente em coelhos com um traço de personalidade tímido. Os coelhos são presas terrestres e serem levantados (ou seja, levantados do chão) ou contidos (ou seja, segurados nos braços de um humano) para uma inspeção de saúde e procedimento experimental provavelmente causarão ansiedade e angústia. Uma opção para refinar os métodos de manuseio foi introduzida nos protocolos de treinamento: em vez de prender o coelho pela nuca e levantá-lo para o outro braço, o coelho pode ser conduzido com o bastão alvo para dentro da caixa e carregado na caixa para a mesa de exame, como sugerido anteriormente⁵⁰^,⁵⁷, onde o coelho é gentilmente transferido da caixa para a mesa. Alternativamente, a parte superior da caixa pode ser removida ou o coelho pode ser guiado com o bastão alvo para fora da caixa.

As observações comportamentais realizadas após a coleta dos coelhos usando a técnica de manuseio convencional ou a caixa de transporte revelaram que a técnica de manuseio convencional estava associada a mais comportamento relacionado ao estresse e à ansiedade do que a técnica alternativa. Essa conclusão foi tirada do alto número de animais que recusaram a recompensa alimentar na mesa de exame e do aumento do tempo de permanência nos abrigos quando a técnica de manejo convencional foi aplicada. Curiosamente, a técnica de manuseio não afetou o tempo de interação com o treinador, indicando que o processo de manuseio pode não ter prejudicado a relação humano-animal. No entanto, além do treinador, a caixa de transporte também servia como "dispositivo de manuseio" (ou seja, o dispositivo de manuseio da técnica convencional era o treinador, os dispositivos de manuseio da técnica alternativa eram tanto o treinador quanto a caixa de transporte). Portanto, o tempo de interação com a caixa de transporte também foi analisado. Embora os coelhos tivessem acabado de ser apanhados com a caixa de transporte, eles passaram mais tempo interagindo com a caixa ou na caixa do que quando foram apanhados pela técnica convencional. Isso sugeriu que a caixa de transporte poderia estar associada a um afeto positivo. Ao comparar a duração da interação com os dois "dispositivos de manuseio" (ou seja, soma do tempo gasto interagindo com a caixa e o treinador), a técnica de manuseio da caixa aumentou a duração do tempo de interação com os "dispositivos de manuseio", ou seja, essa técnica teve um claro efeito positivo na resposta comportamental dos coelhos em relação aos "dispositivos de manuseio" na expectativa de serem manuseados. Descobertas semelhantes foram feitas em camundongos de laboratório, demonstrando que técnicas de manuseio e treinamento suaves reduziram o estresse e a ansiedade: os animais que foram pegos usando um túnel ou as mãos em concha passaram mais tempo interagindo voluntariamente com o "dispositivo de manuseio" e mostraram menos comportamento relacionado à ansiedade do que os camundongos com cabo de cauda¹². O treinamento pareceu fortalecer esse efeito. Leidinger et al. demonstraram que camundongos com manuseio suave (túnel / xícara) mostraram menos micção, defecação e vocalização quando foram contidos pela nuca e menos comportamento flutuante no Teste do Labirinto Aquático de Morris quando foram treinados usando PRT em comparação com camundongos não treinados¹³.

Viabilidade dos protocolos para o trabalho diário - duração, retenção e generalização do treinamento

O número de sessões de treinamento necessárias para aprender um comportamento objetivo dependia do animal individual e dos comportamentos objetivos, que compreendiam um número diferente de etapas que iam da seção 3 à seção 9 do protocolo apresentado acima.

De acordo com o número de animais que conseguiram aprender um comportamento objetivo e o número de adaptações que tiveram que ser feitas nos protocolos para os animais individuais, as etapas de treinamento tiveram diferentes níveis de dificuldade. O comportamento "seguir o alvo" foi a primeira experiência de treinamento dos coelhos e, portanto, demorou mais para alguns animais treinarem esse comportamento do que o outro comportamento objetivo, conforme discutido acima. Embora todos os animais pudessem ser treinados em "pesagem" de acordo com o presente protocolo, etapas intermediárias adicionais foram necessárias para "entrar na caixa de transporte" por dois animais e para "criar" e "pular no colo" por quase todos os coelhos. Isso pode ser explicado pelo grau de contato físico entre o animal e o treinador que foi necessário para a realização dos diferentes comportamentos objetivos. "Pesar" e "entrar na caixa de transporte" não envolveu nenhum contato físico entre animal e humano. A etapa final de "criação" (8.3) e as etapas 9.2-9.4 de "pular no colo" exigiam que os coelhos fizessem contato físico com o treinador. Além disso, o treinador tocou o ombro, costas, garupa, orelhas ou patas do coelho nas etapas 9.5-9.9 de "pular no colo", aumentando o grau de contato físico entre o animal e o treinador. Aceitar ser tocado foi mais desafiador para alguns coelhos do que para outros. Conforme discutido acima, foi benéfico adaptar os protocolos de treinamento desses comportamentos de meta e adicionar etapas intermediárias.

No entanto, três coelhos precisaram de sessões de treinamento adicionais para completar o comportamento objetivo "pular no colo" (# 4, # 7, # 10). Deficiências físicas que impediam esses animais de pular no colo do treinador poderiam ser excluídas. Além disso, os coelhos foram capazes de pular em suas casas, as alturas destas eram mais altas do que o colo do treinador.

Foi perceptível que dois desses três coelhos (# 4 e # 10) precisaram de mais tempo para se acostumar com o treinador, bem como com a recompensa alimentar nas sessões de habituação e parcialmente precisaram de mais sessões de treinamento para alcançar a etapa final de outros comportamentos objetivos. Isso também foi verdade para o coelho # 7, que teve uma lesão na cauda devido a brigas dentro do grupo desde a quarta sessão de habituação. Portanto, o coelho #7 foi pego, transferido para a mesa de exame, tratado e inspecionado diariamente por 15 dias, o que pode ter resultado em maior cautela em relação aos humanos. Por um lado, é crucial observar que o desempenho do treinamento pode ser afetado, por exemplo, por um estado de saúde prejudicado, aumento dos níveis de estresse ou uma relação humano-animal perturbada devido a outras intervenções. Por outro lado, essas observações demonstraram a importância da habituação ao treinador e à recompensa alimentar. Alguns animais podem precisar de mais tempo para se familiarizar com a presença do treinador e aceitar a recompensa alimentar do treinador. Se sessões adicionais de habituação tivessem sido realizadas, os coelhos # 4 e # 10 poderiam ter tido um desempenho melhor nas sessões de treinamento. A relevância de habituar coelhos a humanos já foi relatada na literatura. O criador comercial, do qual os coelhos usados neste estudo foram comprados, introduziu recentemente sessões regulares de carícias, o que reduziu o comportamento relacionado ao estresse e eliminou as agressões⁵⁸. Em um estudo anterior, acariciar e manusear coelhos jovens demonstrou diminuir o comportamento relacionado à ansiedade, aumentar o ganho de peso e reduzir a taxa de mortalidade⁵⁹.

Uma vez que os coelhos aprenderam os diferentes comportamentos de objetivo, eles ainda foram capazes de exibi-los após dois intervalos de treinamento curtos (uma semana) e longos (aproximadamente 7,5-9,5 semanas), exceto em exceções individuais. Essas observações podem indicar que é suficiente pedir aos coelhos que realizem os comportamentos de meta treinados uma vez por semana quando o exame geral é realizado e a sala / curral é limpo.

Para a viabilidade do protocolo para a vida diária no trabalho, também é crucial que os coelhos generalizem os comportamentos objetivos treinados para outras pessoas que não o treinador. Em caso de férias ou doença, outra pessoa tem que continuar o treinamento e cuidar dos animais. A maioria dos coelhos (doze de treze) generalizou os comportamentos objetivos "pesar", "entrar na caixa de transporte" e "empinar" para o cuidador do animal, embora, em alguns casos, os coelhos tenham levado mais de uma sessão de treinamento para mostrar o comportamento desejado. "Pesar" parecia generalizar melhor; seguido por "entrando na caixa de transporte" e "criação". No entanto, "pular no colo" parecia ser mais difícil de generalizar para outra pessoa. Os animais levaram mais tempo para demonstrar o comportamento desejado (9.9.) e dois coelhos, que aprenderam anteriormente a etapa final 9.9, não conseguiram mostrar esse comportamento objetivo, possivelmente devido ao maior contato físico necessário (veja acima). Um coelho (# 4) não apresentou nenhuma etapa dos comportamentos objetivos "pesar", "entrar na caixa de transporte" e "criar" e não estava interessado em interagir com o cuidador do animal. O coelho #4 foi um dos animais que precisou de mais tempo para se acostumar com o treinador e a recompensa alimentar nas sessões de habituação. Isso pode indicar que, para alguns indivíduos, sessões adicionais nas quais os cuidadores de animais passam tempo com os coelhos, habituam-nos a aceitar a recompensa alimentar deles e constroem um vínculo positivo são benéficas²³. Os coelhos podem ser capazes de distinguir entre pessoas diferentes, como demonstrado para ratos⁶⁰. Outros fatores que têm o potencial de afetar o desempenho dos coelhos nas sessões com o treinador e o cuidador do animal podem ser sinais inconscientes que o treinador deu aos animais durante as sessões de treinamento, por exemplo, a posição do bastão alvo ou da tigela de recompensa, a posição do corpo ou movimento. Se o treinador não estiver ciente desses sinais, eles não serão documentados e as outras pessoas não imitarão esses sinais.

Além disso, as habilidades de treinamento das pessoas que trabalham com os animais, incluindo a rotina de manuseio do bastão alvo e a apresentação da recompensa, podem influenciar o comportamento dos animais. Além do conhecimento dos princípios de aprendizagem e da comunicação animal, são necessárias experiências práticas para treinar com sucesso um animal⁶¹ e recuperar um comportamento objetivo. Como as sessões de generalização envolvendo uma pessoa qualificada e uma não qualificada não foram comparadas, a relevância do fator "habilidades de treinamento" não pode ser determinada. No entanto, até onde os autores sabem, uma grande proporção da equipe de animais de laboratório não é treinada em treinamento de animais e, portanto, as condições sob as quais as sessões de generalização foram realizadas (ou seja, envolvendo um cuidador de animais com poucas experiências anteriores em treinamento com clicker) representaram um cenário realista em instalações de animais de laboratório.

Os dados representativos dos protocolos fornecem às biotabilizações uma ideia da carga de trabalho associada ao treinamento dos diferentes comportamentos-alvo. Os dados podem ajudar as instalações de animais a criar seus próprios horários de trabalho ao implementar (partes do) protocolo. Dependendo do animal individual e dos comportamentos objetivos, algum tempo adicional deve ser reservado para o processo de generalização. No entanto, a duração do tempo pode variar ao trabalhar com coelhos machos ou outra raça de coelho. Nas instalações para animais, deve-se discutir se existe tempo apropriado e o que precisa ser alterado para permitir tempo para o treinamento dos animais.

Além do tempo necessário para treinar os animais, deve-se considerar que o treinamento precisa de treinadores qualificados e ensinar a equipe a treinar animais também pode ser demorado. Se o treinamento fosse uma parte obrigatória da educação do pessoal de animais de laboratório, ou seja, cuidadores de animais, veterinários e pesquisadores, a implementação do treinamento de animais nas instalações seria facilitada e levaria menos tempo. De acordo com o Anexo III da Diretiva 2010/63/UE, "os estabelecimentos devem estabelecer programas de habituação e treinamento adequados aos animais, aos procedimentos e à duração do projeto", ou seja, o treinamento dos animais é exigido por lei. Na Alemanha, esses programas devem ser enviados ao solicitar uma licença de teste em animais. Isso requer que as pessoas que planejam experimentos com animais e trabalham com animais de laboratório sejam qualificadas em treinamento animal. No entanto, pelo menos na Alemanha, o treinamento de animais não faz parte do cronograma de treinamento de cuidadores de animais no campo da pesquisa e clínica 62,63,64. Além disso, não é explicitamente mencionado nas recomendações da UE para o quadro da educação e da formação⁶⁵. Portanto, enquanto o treinamento não for implementado nesses regulamentos, o desenvolvimento profissional contínuo com foco no treinamento de reforço positivo precisa de mais atenção. O pessoal de animais de laboratório precisa aprender os princípios de técnicas de aprendizado e treinamento, os critérios necessários, a transferência de procedimentos entre treinadores, manutenção de registros e como responder a animais que não estão participando da maneira desejada para garantir consistência e previsibilidade.

Interação humano-animal

O tempo intensivo de interação humano-animal durante as sessões de treinamento fornece um cenário ideal para fortalecer o relacionamento entre os coelhos individuais e o treinador^26,66. Uma relação positiva entre humanos e animais é benéfica para o bem-estar dos animais, pois pode reduzir seus níveis de estresse em ambientes de criação e experimentais⁶⁷. Nos presentes protocolos de treinamento, o treinador considera a agência dos coelhos e eles podem decidir participar (ou não) do treinamento de forma voluntária. Fornecer agência aos animais é benéfico para seu bem-estar ¹⁶ e, portanto, deve ser buscado em experimentos, bem como em alojamento e criação. Existem diferentes níveis de agência comportamental⁶⁸; a participação no PRT pode ser atribuída ao nível de agência orientada para a ação, ou seja, "comportar-se ativamente para alcançar os resultados atuais [por exemplo, adquirir alimentos]^"68.

Ao analisar a abordagem voluntária dos coelhos em relação ao treinador e a uma pessoa desconhecida, observou-se uma intensa interação humano-animal. Os resultados revelaram que todos os coelhos, exceto de um animal no^1º ensaio (# 12), interagiram tanto com o treinador quanto com a pessoa desconhecida. Eles pareciam reconhecer o treinador, pois mostraram uma clara preferência por interagir com o treinador na^1ª tentativa e alguns deles pularam com as quatro patas no colo do treinador; um comportamento que não foi exibido em relação à pessoa desconhecida. Embora os coelhos tenham passado mais tempo interagindo com o treinador do que a pessoa desconhecida na^1ª tentativa, o tempo de interação não diferiu mais na^2ª tentativa. Uma razão para esta observação pode ser que os coelhos esperavam receber uma recompensa alimentar do treinador na^1ª tentativa e, devido à falta de recompensas alimentares no teste de aproximação voluntária, eles não passaram mais mais tempo com o treinador na^2ª tentativa. Esses dados, no entanto, enfatizaram que os coelhos treinados rapidamente se habituaram à presença de uma pessoa desconhecida e nenhum deles era tímido demais para interagir. Em contraste, eles eram muito exploradores e interessados na pessoa desconhecida. No entanto, como um grupo de controle não treinado não foi investigado, o efeito do treinamento no comportamento de abordagem voluntária dos coelhos não é claro.

Uma hipótese que explica o comportamento do coelho #12 na^1ª tentativa é que esse indivíduo ainda teve que se habituar à presença da pessoa desconhecida na^1ª tentativa e estava mais interessado em interagir tanto com o treinador (70 segundos) quanto com a pessoa desconhecida (9 segundos) na^2ª tentativa. Os coelhos têm diferentes traços de personalidade que podem afetar o nível de conforto em torno de pessoas desconhecidas e, por sua vez, a latência para se aproximar ou a duração do tempo de interação com uma pessoa^69,70.

Limitações

Estamos cientes de que todos os coelhos no curral/sala, não apenas aquele que participa do treinamento, podem ouvir o clique (ou seja, o reforçador condicionado) durante uma sessão de treinamento e seu efeito de reforço pode ser enfraquecido, uma vez que a recompensa alimentar (ou seja, reforçador natural/incondicionado) não é apresentada. Se um coelho fora da arena de treinamento mostrar um comportamento treinado e ouvir o clique, mas nenhum alimento for apresentado (e esse cenário ocorre várias vezes), o comportamento treinado pode ser extinto. Esse fenômeno é chamado de extinção^64,71. No entanto, uma vez que todos os comportamentos objetivos dos protocolos atuais dependem do alvo apresentado pelo treinador, é improvável que a extinção ocorra em nosso ambiente de treinamento.

Como as paredes da arena de treinamento eram transparentes e a arena de treinamento estava localizada no curral, os coelhos podiam ver, ouvir e cheirar uns aos outros durante o treinamento, o que é uma clara vantagem relacionada ao bem-estar. Além disso, os coelhos podem ter observado os membros do grupo durante as sessões de treinamento e aprendido uns com os outros. Em ratos, foi demonstrado anteriormente que os indivíduos aprenderam a realizar um comportamento de objetivo observando seu companheiro de gaiola sendo treinado pelo PRT⁴⁵. Este fato pode ser considerado uma vantagem e uma desvantagem. O progresso do aprendizado dos animais pode ser mais rápido quando eles podem observar uns aos outros. No entanto, os dados de cada animal podem ser influenciados pelo desempenho dos membros do grupo e não podem ser atribuídos apenas ao treinamento do animal individual. Assim, treinar animais sem qualquer contato com os membros do grupo ou coelhos alojados individualmente pode levar mais tempo.

As observações comportamentais dos indivíduos (no teste de abordagem voluntária e após a aplicação das diferentes técnicas de manuseio) foram realizadas em seu ambiente social familiar e grupo para evitar estresse e distração causados por um novo ambiente e separação de seu grupo, o que por sua vez teria afetado as observações comportamentais. A desvantagem é, no entanto, que os coelhos podem ter influenciado o comportamento uns dos outros durante as sessões de observação.

Os efeitos das técnicas de manejo foram investigados apenas em sete animais envolvendo o treinador como pessoa que manuseia os animais. Os autores estão planejando um estudo de acompanhamento, incluindo um cálculo do tamanho da amostra a priori para reproduzir os achados com outros manipuladores e examinar melhor as diferenças entre as técnicas de manuseio.

Todos os humanos envolvidos no treinamento, manuseio e teste de aproximação voluntária eram mulheres. Não foi investigado se o desempenho de treinamento dos coelhos ou seu comportamento variaria se indivíduos do sexo masculino estivessem envolvidos.

Os protocolos de treinamento atuais devem dar ao leitor uma ideia do que pode ser treinado em coelhos, mas não compreendem todos os comportamentos potenciais que seriam benéficos para treinar em um coelho de laboratório. Por exemplo, marcar um coelho conforme sugerido na seção de protocolo sobre requisitos gerais também valeria a pena treinar usando o PRT.

Como apontado mais acima, a escolha da recompensa certa não é trivial. Devido a restrições de higiene, o uso de ervas frescas como recompensas alimentares não é permitido em algumas instalações de animais de laboratório e, portanto, recompensas alimentares menos apropriadas, como sementes de girassol ou guloseimas de forrageamento à base de grãos, devem ser usadas. No que diz respeito à decisão sobre a recompensa alimentar, algumas regras e regulamentos das práticas laboratoriais atuais são prejudiciais ao bem-estar animal e ao treinamento eficaz e, portanto, podem precisar ser reconsiderados caso a caso. Também pode ser possível usar alternativas para recompensas alimentares, por exemplo, toques suaves ou interações com o treinador ou itens de enriquecimento. No entanto, o treinador deve certificar-se de que para cada animal individual a alternativa é recompensar o animal, porque uma recompensa só é uma recompensa se o coelho realmente a favorecer. Especialmente os toques podem não ser recebidos como recompensadores por todos os coelhos.

Conclusões

Em resumo, o presente estudo foi um primeiro passo para preencher a lacuna de conhecimento sobre protocolos de treinamento adequados para coelhos de laboratório. Coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas podem ser treinados para procedimentos de criação de rotina usando PRT e generalizar os comportamentos de objetivo aprendidos para outras pessoas, embora tempo adicional deva ser reservado para o processo de generalização. Comportamentos objetivos sem contato físico pareciam ser mais fáceis de aprender do que comportamentos que exigiam contato físico com humanos. Depois que os animais concluíram com sucesso o treinamento de um comportamento objetivo, foi suficiente recuperá-los uma vez por semana no contexto do exame geral e limpeza do curral. Os protocolos de treinamento considerados geralmente aplicados a todos os coelhos são convenientes, mas o treinador deve estar ciente de que, em alguns casos, deve ser adaptado às necessidades do animal. Os resultados das técnicas de manuseio sugeriram que pegar os coelhos com a caixa de transporte em vez de prendê-los pela nuca e levantá-los no braço era menos aversivo. Em suma, os protocolos atuais fornecem instruções viáveis para o processo de habituação e treinamento de coelhos e podem servir como refinamento em instalações de animais de laboratório.

Os animais não devem sofrer devido à economia de trabalho, tempo ou dinheiro (pelo menos de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal⁷²). É importante cuidar e lidar com todos os animais da maneira mais gentil possível. Como os animais não treinados sofrem em maior grau de ansiedade e angústia causados por procedimentos experimentais e rotineiros de criação do que seus colegas treinados¹³, o treinamento é uma medida simples de refinamento para evitá-los efetivamente de experimentar estados afetivos negativos.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a esta publicação.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos cuidadores dos animais por cuidarem dos coelhos e seu trabalho compassivo e dedicado. Obrigado a Kai Diederich pela revisão do manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cama-r' Nest	The Andersons, Inc., Maumee, EUA		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Finger Clicker	ASCO		https://ascoshop.de/products/fingerclicker
G*Power		versão 3.1.9.7
Heu-Proppen	Ssniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
IBM Corp. lançado em 2020. Estatísticas do IBM SPSS para Windows, Armonk, NY: IBM Corp	IBM Corp	Versão 27.0.	no manuscrito referido como "software para análise estatística avançada"
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg Salinomicina-Natrium-Sondermischung	Ssniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Bloco de Lignocel	Lignocel J. Rettenmaier & Sö hne GmbH + Co KG, Rosenberg, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Lillebro geschä lte Sonnenblumenkerne", Martina GmbH, Mü nchen, Alemanha) e Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, EUA)	Martina GmbH, Mü nchen, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Microsoft Excel para Microsoft 365 MSO	Microsoft Corporation	Versão 2305	no manuscrito referido como "planilha de propagação"
Coelhos brancos da Nova Zelândia	Charles River Laboratories França
Plattformwaage DE 35K5DL	KERN & SOHN GmbH, Balingen-Frommern, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Roupa de cama científica premium (fina e em flocos)	SAFE, Augy, França		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Rainbow Foraging Bits	Bio-Serv, Flemington, EUA		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Snackball fü r Kaninchen – 7 cm	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Lona, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Vara de alvo com clicker integrado	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Trixi Transportbox Capri Open Top	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Lopa, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.
Weiden-Heuball	JR FARM GmbH, Holzheim-Pessenburgheim, Alemanha		A implementação bem-sucedida do protocolo não depende deste produto específico. Você pode usar produtos comparáveis de outras empresas.

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