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Artigo de método

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

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DOI:

10.3791/66020

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27 de outubro de 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Resumo

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo está emergindo como um sistema modelo altamente tratável para investigar a regulação de células-tronco mesenquimais e epiteliais adultas e regeneração dentária. Essas populações progenitoras dividem, movem e diferenciam ativamente para manter a homeostase tecidual e regenerar as células perdidas de maneira responsiva. No entanto, as análises tradicionais usando cortes de tecido fixo não conseguiram capturar os processos dinâmicos dos movimentos e interações celulares, limitando nossa capacidade de estudar suas regulações. Este trabalho descreve um protocolo para manter incisivos inteiros de camundongos em um sistema de cultura de explantes e células epiteliais dentárias live-track usando microscopia timelapse multifóton. Esta técnica se soma à nossa caixa de ferramentas existente para pesquisa odontológica e permite que os pesquisadores adquiram informações espaço-temporais sobre comportamentos e organizações celulares em um tecido vivo. Antecipamos que esta metodologia ajudará os pesquisadores a explorar ainda mais os mecanismos que controlam os processos celulares dinâmicos que ocorrem durante a renovação e regeneração dentária.

Introdução

Nas últimas duas décadas, o incisivo de camundongo emergiu como uma plataforma inestimável para investigar os princípios da regulação de células-tronco adultas e regeneraçãodentária1,2. O incisivo de camundongo cresce continuamente e se renova ao longo da vida do animal. Para isso, mantém tanto as células-tronco epiteliais quanto as mesenquimais, que podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos celulares do dente 1,2. Enquanto as células-tronco epiteliais dentárias dão origem aos ameloblastos, que secretam a matriz do esmalte, as células-tronco mesenquimais dentárias dão origem aos odontoblastos, cementoblastos e fibroblastos, que formam dentina, cemento e ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Esse fornecimento constante de novas células mantém a homeostase tecidual e permite a reposição de células antigas que são perdidas devido ao desgaste mastigatório oulesões7,8. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares que regulam a manutenção e diferenciação das células-tronco dentárias é, portanto, fundamental para o entendimento da regeneração dentária, uma área de crescente interesse.

Anatomicamente, uma grande parte do incisivo de camundongo adulto está envolta no osso maxilar. Enquanto a borda incisal do dente é exposta, a extremidade apical do incisivo se encaixa dentro de um alvéolo e está firmemente presa ao osso circundante através de ligamentos periodontais e tecidos conjuntivos (Figura 1A,B). A extremidade apical do incisivo também é a região de crescimento do dente e mantém células-tronco e progenitoras dentárias tanto na camada epitelial quanto na polpa mesenquimal9,10,11,12,13. Especificamente, as células-tronco epiteliais dentárias são mantidas na extremidade bulbosa do epitélio, conhecida como broto apical, também chamada de alça cervical labial (Figura 1C). Assim como o epitélio intestinal e a epiderme, a renovação epitelial no incisivo é suportada principalmente por células-tronco cicladoras ativas e seus descendentes intermediários altamente proliferativos, denominadas células amplificadoras do trânsito14,15,16,17, ambas residindo na parte interna da alça cervical. No entanto, ainda não se sabe se o epitélio incisivo contém e utiliza células-tronco quiescentes durante a regeneração. Em contraste, tanto as células-tronco mesenquimais dentais ativas quanto quiescentes têm sido identificadas na polpa apical, e as células-tronco quiescentes funcionam como uma população de reserva que se torna ativada durante o reparo dalesão13,18.

Muitas das descobertas sobre a biologia da renovação e regeneração dos incisivos de camundongos resultaram de investigações histológicas, nas quais amostras são obtidas em distintas conjunturas temporais, fixadas, processadas e, em seguida, seccionadas em cortes de mícrons finos ao longo de um plano particular. Através da análise detalhada de cortes histológicos de diferentes modelos murinos que permitem o rastreamento de linhagens ou perturbações genéticas, os cientistas identificaram as linhagens celulares de diferentes populações progenitoras, bem como as vias genéticas e de sinalização que controlam a homeostase dos incisivos e o reparo de lesões 19,20,21. No entanto, as imagens bidimensionais estáticas (2D) de células não vitais em cortes não conseguem capturar todo o espectro de comportamentos celulares e organizações espaciais em tecidos vivos, como mudanças na forma celular, movimentos e cinética celular. Detectar e medir essas rápidas mudanças celulares, que ocorrem em uma escala de tempo insolúvel por meio da secção tecidual, requer uma estratégia diferente. Além disso, a aquisição dessas informações também é fundamental para a compreensão de como as células dentárias interagem entre si, reagem a diferentes estímulos de sinalização e se auto-organizam para manter as estruturas e funções teciduais.

O advento da imagem de tecidos profundos quadridimensionais (4D) utilizando microscopia de dois fótons22, uma tecnologia que integra três dimensões espaciais com resolução temporal, supera as limitações inerentes à análise histológica ao permitir o exame espaço-temporal de explantes teciduais cultivados, organoides ou mesmo tecidos in situ 23,24,25,26 . Por exemplo, imagens ao vivo em 4D do epitélio dentário em desenvolvimento revelaram os padrões espaço-temporais de divisões e migrações celulares que coordenam o crescimento tecidual, a formação do centro de sinalização e a morfogênese epitelial dentária 27,28,29,30,31,32. No incisivo adulto de camundongos, a imagem 4D foi recentemente adaptada para estudar o comportamento celular durante o reparo de lesão epitelial dentária. Imagens ao vivo revelaram que as células intermédias do estrato na camada suprabasal podem ser diretamente convertidas em ameloblastos na camada basal para regenerar o epitélio danificado, desafiando o paradigma tradicional de reparo de lesãoepitelial15.

Descrevemos a dissecção, cultivo e imagem do incisivo adulto de camundongos, com foco nas células epiteliais da alça cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva a vitalidade das células dentárias por mais de 12 h e permite o rastreamento ao vivo de células marcadas fluorescentemente em resolução de célula única. Esta abordagem permite a investigação do movimento e migração celular, bem como mudanças dinâmicas na forma e orientação da divisão celular sob condições normais de cultura, ou em respostas a perturbações genéticas, físicas e químicas.

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Protocolo

Todos os camundongos foram mantidos em instalações para animais livres de patógenos na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA) ou na Universidade Hebraica de Jerusalém (HUJI). Todos os experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com normas e protocolos aprovados pela respectiva Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) ou (MD-23-17184-3; HUJI). Um fluxo de trabalho geral das etapas experimentais é mostrado na Figura 2A. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os instrumentos, reagentes e materiais usados neste protocolo.

1. Preparação de soluções e géis

  1. Meio de dissecção: Preparar DMEM/F12 fresco com 0,5% de glicose e mantê-lo aquecido a 37 °C até ser necessário na etapa 2.4.
    NOTA: Usamos DMEM/F12 sem vermelho de fenol para reduzir a autofluorescência durante imagens ao vivo.
  2. 1x Meio de cultura: Preparar o meio fresco usando 50% de DMEM/F12, 50% de soro de rato, 1x substituto de glutamina, 1x MEM de aminoácidos não essenciais, 1% de glicose, 0,1 mg/mL de ácido L-ascórbico e 0,5% de penicilina-estreptomicina. Manter aquecido a 37 °C até ser necessário no passo 5.5. Este meio é usado para cultivar explantes incisivos durante imagens vivas.
    NOTA: O soro de rato deve ser de alta qualidade e especialmente preparado para a cultura de tecidos inteiros por pesquisadores ou de uma fonte comercial. Em particular, o sangue deve ser centrifugado (por 5 min a 1.200 × g à temperatura ambiente) antes que a coagulação comece a se formar. Após a centrifugação, o coágulo de fibrina resultante deve ser espremido e descartado33.
  3. Gel de cultura: O objetivo do gel é imobilizar amostras durante a aquisição de imagens e é preparado fresco.
    1. Fazer 2% de gel em DMEM/F12 dissolvendo 200 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 mL de DMEM/F12 usando um micro-ondas. Manter o gel a 2% a 37 °C.
    2. Produzir 2x meio de cultura (sem DMEM/F12) misturando 50% de soro de rato, 1x substituto de glutamina, 1x MEM Aminoácidos não essenciais, 1% de glicose, 0,1 mg/mL de ácido L-ascórbico e 0,5% de penicilina-estreptomicina. Aquecer o meio de cultura 2x (sem DMEM/F12) a 37 °C.
    3. Fazer 1% de gel de cultura misturando volumes iguais de 2% de gel e 2x meio de cultura (sem DMEM/F12). Manter o gel de cultura a 1% a 37 °C até ser necessário na etapa 5.1.
      NOTA: Certifique-se de que todas as soluções estão quentes antes de misturar para evitar gelificação. Encontramos gel a 1% adequado para a cultura do incisivo adulto de camundongos. A porcentagem de gel deve ser determinada empiricamente se outros tecidos forem cultivados.

2. Extração das mandíbulas de camundongos adultos

  1. Eutanasiar camundongos na idade desejada usando procedimentos padrão aprovados pela IACUC.
    OBS: Utilizamos asfixia por CO2 seguida de luxação cervical. Os regulamentos para a eutanásia animal podem variar em diferentes regiões. Os pesquisadores devem obter a aprovação institucional necessária antes de realizar experimentos e garantir o cumprimento das regulamentações locais de cuidados com os animais.
  2. Desinfetar o rato com etanol a 70%.
  3. Decapitar o rato e extrair as mandíbulas esquerda e direita.
    1. Coloque o mouse na barriga e, em seguida, use uma lâmina de barbear industrial de borda única #9 para cortar a região do pescoço e separar a cabeça do mouse do resto do corpo.
      NOTA: Se os tecidos da faringe ou da região do pescoço também forem coletados, a decapitação não deve ser realizada, podendo-se proceder diretamente ao passo 2.3.2.
    2. Vire o mouse para que seu lado ventral fique voltado para cima e as mandíbulas sejam facilmente acessíveis.
    3. Segure a cabeça do animal segurando-a suavemente entre o polegar e o indicador.
    4. Use a lâmina de barbear para fazer uma incisão sagital média que corta a pele da mandíbula inferior do lábio inferior em direção ao decote.
      NOTA: Uma lâmina cirúrgica #15 também pode ser usada para fazer a incisão e dissecções subsequentes (passos 2.3.6-2.3.9).
    5. À medida que a incisão é feita, abra a pele cortada usando o polegar e o indicador para expor os músculos e o osso maxilar por baixo.
    6. Use a lâmina de barbear para cortar os músculos masseteres no lado bucal da mandíbula inferior, de modo que a parte externa das hemimandíbulas esquerda e direita estejam agora livres de anexos musculares.
    7. Separe os músculos milo-hioideos ao longo da face interna da mandíbula para remover os anexos musculares lá.
    8. Faça outra incisão na sínfise mandibular que conecta as duas hemimandíbulas. Uma vez cortada, a mandíbula será separada nas metades esquerda e direita.
    9. Cunhar a lâmina de barbear entre o côndilo mandibular e a articulação temporal mandibular e dissecar cuidadosamente a hemimandíbula do restante da cabeça.
      NOTA: Achamos útil puxar suavemente o incisivo simultaneamente durante o corte. Deve-se tomar cuidado para evitar quebrar a mandíbula e danificar os tecidos moles internos.
  4. Transferir imediatamente as mandíbulas dissecadas para uma placa de Petri com o meio de dissecção pré-aquecido (passo 1.1) e remover os tecidos musculares remanescentes com uma lâmina cirúrgica #15.
    NOTA: Manter amostras em meios frios retarda as atividades celulares, resultando em recuperações atrasadas ou mesmo fracassadas de certas atividades celulares, como proliferação ou movimento celular, durante imagens ao vivo.

3. Isolamento de todos os incisivos de camundongos

NOTA: O isolamento adicional do incisivo é feito sob um microscópio de dissecção de campo brilhante.

  1. Identificar visualmente a região oval da mandíbula que recobre o alvéolo do incisivo e abriga a porção apical do incisivo.
  2. Posicione a mandíbula de forma que a superfície interna (lingual) fique voltada para cima.
  3. Ao segurar a mandíbula no lugar com um par de pinças serrilhadas, gere uma janela na região oval raspando o osso da membrana sobrejacente usando uma lâmina cirúrgica #15, em uma direção que é do côndilo em direção aos molares. Isso expõe o tecido mole do incisivo apical na superfície interna.
  4. Vire sobre a mandíbula para que a superfície externa (bucal) fique voltada para cima.
  5. Gere uma janela na região oval na mandíbula externa, conforme descrito no passo 3.3, e use a ponta do bisturi para retirar os fragmentos ósseos remanescentes na borda. Certifique-se de que a extremidade apical do dente é visível de ambos os lados.
    NOTA: Evite a pressão excessiva enquanto raspa os ossos para evitar danos ao tecido mole subjacente.
  6. Cortar sistematicamente os ossos ao redor do incisivo para isolar todo o dente.
    1. Faça um corte limpo em um plano imediatamente adjacente ao incisivo apical para primeiro remover o processo condilar.
      OBS: Cuidado para não cortar no incisivo.
    2. Faça um segundo corte logo posterior ao 3º molar, mas dorsal ao incisivo sem danificar o dente. Isso remove o osso que inclui o processo coronóide.
    3. Corte serialmente da ponta do processo angular em direção ao incisivo para remover gradualmente a mandíbula ventral de forma gradual.
      NOTA: O epitélio dentário e os tecidos periodontais associados são frequentemente presos ao osso e facilmente arrancados se uma grande parte do osso ventral for cortada de uma só vez. Para separar o osso do tecido mole do incisivo, pode-se inserir o bisturi (ou um par de pinças afiadas não serrilhadas) entre os dois tecidos na extremidade apical do incisivo e deslizar delicadamente o instrumento para frente.
    4. Cortar o osso alveolar com molares e quaisquer ossos remanescentes que ainda estejam aderidos ao incisivo.
    5. Todo o incisivo está agora isolado. Transferir o incisivo totalmente dissecado para uma placa com meio de dissecção limpo e quente (passo 1.1).
  7. Repita as etapas 3.2-3.6 para isolar incisivos adicionais, conforme necessário.
    OBS: Os incisivos superiores/superiores do camundongo também mantêm células-tronco adultas e podem ser utilizados no estudo da regeneração dentária34. Os pesquisadores em odontologia normalmente se concentram nos incisivos inferiores porque eles são mais acessíveis e podem ser mais facilmente dissecados do que os incisivos superiores. As diferenças entre as células progenitoras incisivos inferiores e superiores ainda precisam ser determinadas.

4. Remoção dos tecidos periodontais para exposição da alça epitelial epitelial incisiva

  1. Com todo o incisivo deitado em seu lado lingual e segurando o dente no lugar com um par de pinças serrilhadas, use um par de pinças finas #5 para começar a enfiar os tecidos periodontais que cobrem o incisivo apical e a região da alça cervical.
  2. Descascar cuidadosamente o tecido periodontal do broto apical, de modo que o lado lateral da alça cervical (ou outras regiões de interesse) se torne visível sob o escopo.
    OBS: Deve-se tomar cuidado para não danificar o epitélio dentário ou desprendê-lo do mesênquima. Se o incisivo tiver sinais de fluorescência na região de interesse, e um microscópio de dissecção fluorescente estiver disponível, sinais de fluorescência podem ser usados para ajudar a distinguir entre os tipos de tecido e auxiliar dissecções. É importante realizar eficientemente as secções 2-4 para que as amostras possam ser rapidamente transferidas para os meios de cultura e mantidas adequadamente através da cultura de explantes (ver abaixo).

5. Incorporação de tecidos para cultura de explantes

  1. Adicionar 500 μL de gel de cultura quente e não solidificado a um poço em uma placa de 24 poços e transferir rapidamente os incisivos inteiros dissecados para o poço. Rode a placa algumas vezes para enxaguar os incisivos.
  2. Adicione 400 μL de gel de cultura quente e não solidificado a uma placa de cultura e transfira os incisivos enxaguados para a placa.
    NOTA: Utilizamos uma placa de cultura disponível comercialmente que é compatível com a configuração de perfusão. Consulte a etapa 6.4 para obter opções alternativas.
  3. Orientar o incisivo para posicionar a região da alça cervical (ou outras regiões de interesse) no centro da placa (Figura 2A,B) e ajustar a inclinação do incisivo apical para o plano de imagem desejado.
    NOTA: A orientação tecidual deve ser feita rapidamente antes da gelificação completa.
  4. Depois que o gel for colocado, use um par de pinças finas para remover qualquer gel em cima da região de interesse para que ele não seja coberto por gel.
  5. Adicione um volume suficiente de meio de cultura quente, pipetando-o lentamente contra a borda do prato para cobrir apenas a amostra (~150 μL).
  6. Mover a cultura do explante para uma incubadora de cultura celular a 37 °C para permitir a fixação do tecido e o ajuste à condição de cultura durante 1 h.

6. Microscopia timelapse dos explantes dos incisivos

NOTA: Neste experimento, foi utilizado um microscópio vertical equipado com uma objetiva de imersão em água de 25x que tem uma abertura numérica de 1. Em geral, uma lente de imersão de água com uma alta abertura numérica é mais adequada para imagens de tecidos profundos.

  1. Ligue o microscópio e o laser de dois fótons.
  2. Fixe a placa de cultura no adaptador de palco e monte o anel adaptador de perfusão na parte superior (Figura 2C).
  3. Conecte o adaptador de estágio a um controlador de temperatura ajustado para manter a cultura a 37 °C.
  4. Conecte a entrada e a saída do anel adaptador a uma bomba de microperfusão e inicie a perfusão do meio de cultura, com a velocidade de perfusão fixada em 20 na bomba. Isso gera um fluxo lento (~5 mL/h) do meio de cultura sobre a parte superior das amostras (Figura 2C).
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o sistema para manter o tecido em um ambiente controlado de forma estável. Outros sistemas também podem ser usados. Uma combinação de uma placa de aquecimento de 37 °C e um prato de cultura de perfusão caseiro (Figura Suplementar S1) com uma entrada e uma saída conectadas a bombas de seringa também pode ser usada.
  5. Coloque um Anel de Barreira de Controle Atmosférico (ACBR) sobre o anel adaptador e abaixe a objetiva através do ACBR para apenas fazer contato com o meio de cultura (Figura 2D).
  6. Ajuste o comprimento de onda do laser para 920 nm para visualizar sinais de fluorescência GFP e vermelha (por exemplo, tdTomato).
  7. Localize as amostras através de oculares e, em seguida, no software do microscópio.
  8. Configure pilhas Z, imagens de várias posições e intervalos de tempo usando o software. Para seguir este protocolo, use um tamanho de passo z de 4 μm e um intervalo de tempo de 5 min por 14 h.
    NOTA: Descobrimos que um intervalo de tempo superior a 5 min é frequentemente insuficiente para capturar movimentos e divisões celulares suaves.
  9. Inicie a imagem de timelapse.
    NOTA: A posição da amostra pode mudar durante a primeira hora e podem ser necessários ajustes adicionais.
  10. Salve arquivos para processamento e análises de dados a jusante.

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Resultados

A região apical do incisivo adulto de camundongo está envolta dentro da mandíbula (Figura 1) e, portanto, não é diretamente acessível para visualização e rastreamento vivo das células progenitoras que residem na região de crescimento. Portanto, desenvolvemos um método para extrair todo o incisivo do osso maxilar e mantê-lo em um sistema de cultura de explantes para microscopia timelapse de dois fótons (Figura 2). Descrevemos resultados representativos que captur...

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Discussão

A imagem de tecidos vivos é uma importante técnica que permite estudar os processos dinâmicos e comportamentos das células quando mantidas em seu ambiente de nicho41. Idealmente, imagens ao vivo são realizadas in vivo com alta resolução espaço-temporal. No entanto, a obtenção de imagens in vivo para órgãos de mamíferos pode ser desafiadora devido à inacessibilidade tecidual, opacidade óptica e dificuldade de imobilização do animal ou do órgão por um período prolongado

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Laboratório de Microscopia/Espectroscopia de Luz Avançada da UCLA e ao Centro de Excelência da Leica Microsystems no California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) pelo fornecimento de microscopia de dois fótons. O AS foi apoiado pelo ISF 604-21 da Israel Science Foundation. A HA foi apoiada por R03DE030205 e R01DE030471 do NIH/NIDCR. AS e JH também foram apoiados por 2021007 de subsídios da Fundação Binacional de Ciência Estados Unidos-Israel (BSF).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
24 poços, placa de cultura de tecidos de fundo planoOlympus plastics25-107
25x HC IRAPO motCORR objetivo de imersão em águaLeica11507704
Ácido ascórbico (Vitamina C)Acros Organics352685000
D-(+)-Glicose bioxtra Sistema Sigma AldrichG7528
Delta T Bioptechs0420-4Incluindo controle de temperatura, placas de cultura e configuração de perfusão
Microscópio de dissecação- LEICA S9ELeicaLED300 SLI
DMEM/F12Thermo Scientific11039047Meio basal sem fenol vermelho
Lâmina cirúrgica de penas (#15)Pena72044-15
Pinça finaF.S.T11252-23
Glutamax Thermo Scientific35050-061Substituto de glutamina
Leica SP8-DIVE equipado com uma objetiva de imersão em água motCORR 25X HC IRAPO Leican/a
baixo ponto de fusãoNuSieve50080
(100x)Thermo Scientific11140-050
penicilina– estreptomicinaThermo Scientific1514012210.000 U/mL 
Placa de PetriGen Clone32-107G90 mm 
Soro de ratoValley BiomedicalAS3061SCProcessado para imagens ao vivo
Lâmina de barbear #VWR55411-050
Cabo de bisturiF.S.T10003-12
TesouraF.S.T37133
pinça serrilhadaF.S.T11000-13
tesoura de molaF.S.T91500-09
aminoácidos não essenciais de9

Referências

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