Aqui, apresentamos o primeiro protocolo de infiltração localizada a vácuo para estudos in vivo da transformação genética de plantas de grande porte. Utilizando esta metodologia, obteve-se pela primeira vez a transformação transitória do cacau mediada por Agrobacterium em planta.
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Artigo de método
Agroinfiltração Forçada a Vácuo para Transformação In planta de Plantas Recalcitrantes: Cacau como Estudo de Caso
Neste artigo
Resumo
Resumo
A transformação transitória em plantas é uma alternativa rápida e econômica para a transformação genética de plantas. A maioria dos protocolos para transformação in planta depende do uso de transformação mediada por Agrobacterium. No entanto, os protocolos atualmente em uso são padronizados para plantas de pequeno porte devido às restrições físicas e econômicas de submeter plantas de grande porte a um tratamento a vácuo. Este trabalho apresenta um protocolo eficaz para agroinfiltração localizada a vácuo customizada para plantas de grande porte. Para avaliar a eficácia do método proposto, testou-se seu uso em plantas de cacau, uma espécie de planta tropical recalcitrante à transformação genética. Nosso protocolo permitiu aplicar até 0,07 MPa de vácuo, com repetições, em uma parte aérea localizada das folhas de cacau, tornando possível forçar a infiltração de Agrobacterium nos espaços intercelulares das folhas aderidas. Como resultado, obteve-se a transformação transitória em planta mediada por Agrobacterium de folhas de cacau anexas expressando para o sistema repórter RUBI. Esta é também a primeira Agrobacterium-mediada em planta de transformação transitória do cacau. Este protocolo permitiria a aplicação do método de agroinfiltração a vácuo a outras espécies vegetais com restrições de tamanho semelhantes e abriria as portas para a caracterização in planta de genes em espécies lenhosas recalcitrantes de grande porte.
Introdução
Métodos de transformação genética vegetal são essenciais para testar as funções biológicas dos genes e são especialmente úteis nos dias de hoje, dado o grande número de genes não caracterizados previstos na era pós-genômica1. Estes métodos podem ser usados para obter linhas totalmente transformadas ou para expressar genes transitoriamente. A transformação estável ocorre quando o DNA estranho que o hospedeiro absorveu torna-se total e irreversivelmente integrado ao genoma do hospedeiro, e as modificações genéticas são transmitidas para as gerações seguintes. A expressão transitória, conhecida como transformação transitória, ocorre a partir de mú....
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Protocolo
1. Cultura de Agrobacterium tumefaciens
- Descongelar células eletrocompetentes da cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Adicionar 1 mL de malte de levedura (YM; Tabela 1) caldo para um tubo de cultura de 17 mm x 100 mm. Guarde este tubo para mais tarde e mantenha-o à temperatura ambiente (RT).
- Em um tubo de microfuga de 1,5 mL, adicionar 30 μL das células de Agrobacterium descongeladas e 100-250 ng (até 5 μL) do DNA contendo 35S:RUBY. Misture delicadamente.
NOTA: O 35S:RUBY foi um presente de Yunde Zhao. Para evitar o arqueamento de amostr....
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Resultados
Este protocolo apresenta um método eficaz de agroinfiltração para plantas lenhosas de grande porte. Com este protocolo, conseguimos atingir uma pressão de vácuo de -0,07 MPa, resultando na infiltração efetiva e localizada das folhas do cacau. Na Figura 4, observa-se o processo de montagem do sistema de infiltração e, na Figura 5, a configuração final.
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Discussão
Neste trabalho, apresentamos um protocolo de agroinfiltração eficiente e de baixo custo para a transformação transitória in planta de plantas lenhosas, usando como exemplo plantas de cacau. Dada a conhecida restrição que a cutícula das folhas representa para a transformação dos tecidos vegetais, concentramo-nos no desenvolvimento de uma estratégia para facilitar a agroinfiltração por vácuo em plantas lenhosas, que geralmente são recalcitrantes a esse procedimento.
A pressão de vácuo a.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Lic. Jesús Fuentes González e Néstor Iván Robles Olivares pela ajuda na filmagem do vídeo. Agradecemos os generosos presentes da Dra. Antonia Gutierrez Mora do CIATEJ (Theobroma cacao plants). Agradecemos também ao CIATEJ e ao Laboratorio Nacional PlanTECC, México, pelo apoio às instalações. H.E.H.D. (CVU: 1135375) realizou estudos de mestrado com financiamento do Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). A R.U.L. agradece o apoio do Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) e da Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY plasmídeo | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908; RRID:Addgene_160908 |
| Cubeta de eletroporação de 1 mm | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Marca Fisher Electroporation Cuvettes Plus |
| Dessecador | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Liofilizador | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | Para meio YM adicione 0,38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Manitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | Para meio YM adicione 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (Para LB, YM e meio de ressuspensão) adicione 1,95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Para meio de ressuspensão adicione 0,952 g/L (10 mM) |
| MgSO4· 7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | Para meio YM adicione 0.204 g/L |
| MicroPulser Aparelho de Eletroporação | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | Para LB médio adicionar 5 g/L; Para o meio YM, adicione 0,1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Material de impressão de silicone President | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicina | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg / mL) |
| Pistola de material de impressão | de silicone Andent | TBT06 | |
| Spectinomicina | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg / mL) |
| Estreptomicina | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg / mL) |
| Digestão enzimática de triptona da caseína | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | Para meio LB, adicione 10 g / L |
| de levedura extrato | MCD LAB | 9031 | Para meio LB adicionar 5 g/L; Para meio YM, adicione 0,4 g / L |
Referências
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
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Reimpressões e permissões
