Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.
Artigo de método
Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer de ovário é a neoplasia ginecológica mais mortal. O omento desempenha um papel fundamental no fornecimento de um microambiente de suporte para células de câncer de ovário metastático, bem como sinais imunomodulatórios que permitem a tolerância tumoral. No entanto, temos modelos limitados que imitam de perto a interação entre células cancerosas do ovário e tecidos ricos em adiposo. Para entender melhor os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral, desenvolvemos um modelo 3D ex vivo único de interação célula-omento cancerígeno. Usando omento humano, somos capazes de cultivar células cancerosas de ovário dentro deste microambiente rico em adiposo e monitorar os fatores responsáveis pelo crescimento do tumor e regulação imunológica. Além de fornecer uma plataforma para o estudo deste microambiente tumoral rico em adiposo, o modelo fornece uma excelente plataforma para o desenvolvimento e avaliação de novas abordagens terapêuticas para atingir células cancerosas metastáticas neste nicho. O modelo proposto é de fácil geragem, barato e aplicável a investigações translacionais.
Introdução
O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal domundo1. O risco ao longo da vida de desenvolver esse câncer é de aproximadamente 1 em 70, com mediana de idade de diagnóstico de 63 anos2. Neoplasias ovarianas primárias são classificadas histologicamente como epiteliais ou não epiteliais. Os cânceres epiteliais de ovário (EOC) representam mais de 90% dos tumores, e o subtipo mais comum é o carcinoma seroso de alto grau (HGSC), que responde por aproximadamente 70%-80% dos EOCs. Atualmente, não existem métodos de rastreamento eficazes para detectar a doença precocemente. Assim, a maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado (ou seja, estádio III ou IV da Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO]) após o câncer se espalhar por toda a cavidade peritoneal2.
O tratamento padrão na linha de frente é a cirurgia citorredutora para remover toda a doença macroscópica visível, seguida de quimioterapia adjuvante à base de platina para destruir qualquer doença microscópica residual. Embora tenha havido muitos avanços no tratamento do câncer de ovário nas últimas duas décadas, aproximadamente 70% das pacientes com doença avançada terão recidiva dentro de 3 anos detratamento3. Dado o mau prognóstico geral desses pacientes, os esforços de pesquisa translacional em andamento e futuros no EOC visam identificar biomarcadores para detecção precoce, prevenir metástases, melhorar as terapias atuais para evitar a resistência e desenvolver novos tratamentos personalizados contra o câncer.
Metástases generalizadas dentro da cavidade peritoneal e sua quimiorresistência associada são duas das principais limitações para o aprimoramento do tratamento de pacientes com câncer deovário4,5. O omento, uma estrutura semelhante a um avental gorduroso que pende do estômago sobre os intestinos, é o principal sítio de metástase do câncer de ovário 6,7. Além de sua função como barreira física, o omento demonstrou ter capacidade regenerativa, angiogênica e possuir atividades imunológicas, que juntas promovem vascularização, aceleram a cicatrização de feridas e limitam a infecção8. Ele contém uma alta concentração de células-tronco que podem se diferenciar em vários tipos de células e podem ajudar a reparar tecidos danificados. O omento pode inflamar-se em resposta à lesão ou infecção, o que desencadeia a migração das células imunes para o local dalesão9. Essas células imunes liberam fatores de crescimento e outras moléculas que ajudam a promover o reparo e a regeneração do tecido danificado. As células imunes, como macrófagos, linfócitos e plasmócitos, localizadas no omento, são estruturas conhecidas como "manchas leitosas", responsáveis por detectar e atacar patógenos e regular a imunidade peritoneal. O omento também demonstrou desempenhar um papel na indução de tolerância imunológica10, que é a capacidade do sistema imunológico de tolerar autoantígenos e não atacar tecidos saudáveis. No entanto, as mesmas atividades imunológicas também estão envolvidas em respostas patológicas, como crescimento de tumores omentais, metástases e escape da vigilânciaimunológica9,11. Estudos prévios de nosso laboratório e de outros demonstraram um papel único e ativo do microambiente adiposo na inibição da resposta imune antitumoral e na aquisição de quimiorresistência12,13,14. Infelizmente, temos informações limitadas sobre os mecanismos celulares e moleculares pelos quais o omento fornece um microambiente pró-tumoral.
Para entender melhor as interações entre as células cancerosas e o omento, um sistema de cultura 3D consistindo de células cancerosas de ovário humano e explantes de omento derivados da paciente foi desenvolvido. O protocolo aqui descrito representa um novo modelo ex vivo de carcinomatose peritoneal. Este modelo mimetiza a progressão natural da tumorigênese do câncer de ovário neste tecido adiposo. O modelo proposto é fácil de gerar, barato e potencialmente aplicável a investigações translacionais na pesquisa do câncer de ovário.
Protocolo
O seguinte protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Wayne State University. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia. A Figura 1 ilustra as três etapas gerais desse protocolo.
1. Preparação do tecido do omento humano
- Preparar meios de cultura de omento (DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino + 1% de penicilina-estreptomicina) e armazenar a 4 °C. Alíquota 30-40 mL deste meio em um tubo cônico estéril de 50 mL ou recipiente de amostra cirúrgica.
- Obter espécimes cirúrgicos de biópsia omental ou cirurgia de omentectomia. Imergir o espécime estéril em meio de cultura de omento imediatamente após a remoção na sala de cirurgia. Se o fluxo de trabalho não permitir isso, coloque o espécime em meio de cultura de omento o mais rápido possível. Transferir a amostra colocando-a no gelo e conservar a 4 °C até ao processamento.
NOTA: O tamanho da amostra de omento removida determinará a quantidade de tecido trabalhável. - Processar o espécime de omento dentro de 1-2 h após a coleta usando uma capela de fluxo laminar. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.
- Retire o omento do recipiente de coleta e transfira-o para uma placa de cultura de 100 mm. Mergulhe a amostra em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) e lave suavemente a amostra para remover quaisquer coágulos sanguíneos ou detritos.
- Cortar o tecido em pedaços (0,5 cm x 0,5 cm ou 100-200 mg; Figura 2A) usando uma pequena tesoura cirúrgica ou um bisturi de 10-15 mm. Use pinças cirúrgicas pequenas para ajudar a manipular o tecido e evitar esmagar o omento. Se um dispositivo de energia foi usado para remover cirurgicamente o espécime de omento, evite usar o tecido distorcido na borda selada.
- Colocar cada pedaço de omento cortado em poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços e encher os poços com 500 μL de meio de cultura de omento ou até um volume suficiente para cobrir o omento sem permitir que a peça de omento flutue acima do piso do poço (Figura 2B).
- Conservar pedaços de omento em meios de cultura frescos a 4 °C até estar pronto para a injeção.
2. Preparação de células cancerosas do ovário
- Cultivar células humanas de câncer de ovário em frasco de 75cm2 a 37 °C e 5% de CO2 com pelo menos 75% de confluência até o dia da coleta do omento.
NOTA: Este protocolo utiliza células de câncer de ovário humano OCSC1-F2 mCherry-positivas previamente descritas15,16,17,18. Ele pode ser modificado para qualquer linha de células cancerosas marcadas com um sinal de fluorescência. - Preparar as células dentro de uma capela de fluxo laminar imediatamente após a coleta do espécime de omento. Certifique-se de que todos os materiais e ferramentas estejam estéreis ou esterilizados.
- Adicionar 10 mL de PBS estéril 1x ao frasco de cultura e lavar as células balançando suavemente o frasco. Remover o PBS 1x e, em seguida, adicionar 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
- Agitar suavemente o balão de cultura para revestir todas as células e, em seguida, colocar o balão numa incubadora (37 °C e 5% CO2) durante um período máximo de 5 minutos. Tocar o frasco de cultura para separar completamente as células e, em seguida, neutralizar a tripsina adicionando 3 mL de meio de cultura de omento.
- Misturar a suspensão celular por pipetagem e, em seguida, transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a suspensão por 5 min a 1.200 x g a 24 °C. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 6 mL de meio de cultura de omento fresco.
- Conte as células usando um hemacitômetro. Diluir a suspensão celular em pelo menos 100.000 células por 100-200 μL de suspensão. Este é o volume de injeção em cada pedaço cortado de omento.
- Transferir um número adequado de células para um novo frasco de cultura para continuar a passagem celular.
3. Injeção de células cancerosas do ovário
- Use uma seringa de 1 mL para retirar a suspensão celular e, em seguida, conecte uma agulha de 26 G. Não desenhe a suspensão celular usando a agulha, pois isso pode fragmentar as células.
- Use pinças cirúrgicas pequenas para pegar um pedaço de omento cortado. Transfira o omento para uma placa estéril de trabalho separada para facilitar a injeção. Perfurar suavemente o omento com a ponta da agulha e injetar um pequeno volume de suspensão celular no tecido (Figura 2C).
- Repetir a injeção em várias áreas do omento até um volume total de pelo menos 100 μL ou 100.000 células. Observe que grande parte da suspensão celular pode parecer se acumular ao redor do espécime. Se houver preocupação com a qualidade da injeção, repita a injeção ou injete um volume maior de suspensão celular na amostra.
- Devolva as amostras de omento injetadas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Observe que o volume do meio de cultura de omento é de um nível que cobre o omento sem deixá-lo flutuar. Manuseie cuidadosamente a placa e coloque-a dentro de uma incubadora (37 °C e 5% CO2).
- OPCIONAL: Use Matrigel (matriz de membrana basal) para suspender o tecido do omento em uma matriz sólida para permitir uma injeção mais fácil e uma entrega de suspensão celular mais concentrada.
- Descongelar a matriz da membrana basal a 4 °C e misturar na proporção de 1:1 com meios de cultura de omento imediatamente antes da utilização. Conservar a mistura da matriz da membrana basal em gelo ou a 4 °C até à injeção. Encha poços vazios com mistura de matriz de membrana basal suficiente para imergir um pedaço cortado de omento.
- Coloque os espécimes na mistura da matriz da membrana basal e, em seguida, coloque a placa de cultura de 24 poços em uma incubadora (37 °C e 5% CO2) por 20 min. Uma vez que a mistura tenha solidificado, continue com a injeção como descrito acima.
- Confirme a injeção bem-sucedida usando imagens fluorescentes. Certifique-se de que uma faixa de sinal fluorescente seja visualizada nos locais de injeção (Figura 2D). Note que o número real de células ligadas ao omento após a injeção é imprevisível.
4. Co-cultura de células cancerosas do omento humano e do ovário
- Troque os meios a cada 48-72 h adicionando 500-2000 μL de meios de cultura frescos de omento. Não pipetar o meio diretamente sobre o tecido do omento, pois isso pode deslocar as células cancerosas. Observe que, se a cor da mídia ficar amarela, altere a mídia.
NOTA: A frequência de mudança de mídia dependerá do volume de mídia usada e da trajetória de crescimento de células cancerosas. Uma vez que as células cancerosas tenham semeado o omento, se o pedaço de omento está ou não flutuando não é mais importante. - OPCIONAL: Se uma matriz de membrana basal fosse usada, a matriz normalmente seria dissolvida no momento da primeira troca de meio.
- Monitorar o crescimento de tumores de câncer de ovário usando imagens fluorescentes. A frequência das imagens fica a critério do investigador. Antecipar a evidência de tumores pequenos em cerca de 14 dias (Figura 3A-C). Os resultados podem variar dependendo da qualidade da injeção.
- Encerre o experimento com base no ponto de extremidade do experimento.
NOTA: O crescimento tumoral e a integridade do tecido omento foram observados nos últimos 50 dias.
Resultados
O estabelecimento bem-sucedido de células de câncer de ovário em espécimes de omento foi evidente por volta do 14º dia (Figura 3A-C). Pelo menos 24 repetições foram preparadas e injetadas por espécime coletado para permitir experimentação adicional. O crescimento tumoral foi monitorado por meio de imagens fluorescentes (Figura 3D,E). As imagens tiveram que ser cuidadosamente interpretadas como uma monocamada de células cancerígenas também cresceu no fundo de cada poço que não estava ligado ao omento. Preferimos tirar imagens do omento quando ele estava suspenso em meios para evitar a sobreposição de sinais fluorescentes com a monocamada de células cancerosas.
A ausência de sinal fluorescente até o 14º dia pode ser considerada como injeções malsucedidas. Observou-se que as células cancerosas inicialmente se espalharam pela superfície do omento durante os primeiros 7 dias, mas com o tempo, elas se reuniram para formar tumores (Figura 3A-D). Uma medida substituta para a carga tumoral entre as amostras foi a taxa em que os meios de cultura de omento mudaram de cor de vermelho para amarelo (Figura 3F). Utilizamos imagem fluorescente, revisão histológica e inspeção macroscópica para confirmar o crescimento tumoral e a viabilidade do tecido omental após 50 dias de co-cultura (Figura 4).
Figura 1: Ilustração das etapas gerais do protocolo. (A) Etapa 1: Preparo do omento; (B) Etapa 2: injeção de células cancerígenas; (C) Etapa 3: estabelecimento do microambiente célula-omento cancerígeno. (Figura preparada em BioRender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação e injeção de células cancerosas no omento. (A) O omento é cortado em pedaços de 1x1 cm. (B) Cada peça é colocada em um poço de uma placa de 24 poços e coberta com 500 μL de meio. (C) Injeção de células cancerígenas em peça de omento. (D) Uma sequência de células cancerosas fluorescentes é observada após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas após 14 e 25 dias de cocultivo. (A-C) Imagens representativas após 14 dias de co-cultura: (A) fase, (B) canal mCherry, (C) fundida. (D-E) Imagens representativas após 25 dias de co-cultura. (F) A mudança na cor do meio de rosa para amarelo é uma indicação de injeção bem-sucedida de células cancerosas e estabelecimento de co-cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Morfologia macroscópica e coloração Hematoxilina e Eosina (H&E). (A,B) Morfologia macroscópica representativa das co-culturas aos 50 dias; setas apontam para locais de crescimento de células cancerosas de ovário mCherry+. (C,D) Coloração H&E representativa de co-culturas no dia 50. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Usando este protocolo, um modelo pré-clínico de carcinomatose peritoneal para câncer de ovário foi desenvolvido usando uma combinação de técnicas básicas in vitro e ex vivo. Um crescimento tumoral progressivo foi observado ao longo de 50 dias de co-cultivo após semeadura de espécimes de omento com células de câncer de ovário humano mCherry+ OCSC1-F2. Este método foi desenvolvido e otimizado em vários ensaios experimentais usando diferentes espécimes de omento. O sucesso do crescimento do tumor dependeu da qualidade do omento, da viabilidade das células cancerosas e da eficácia da injeção. Neste relato, foram utilizadas apenas células mCherry+ OCSC1-F2 e linhagens de câncer de ovário humano mCherry+ R182 previamente relatadas em diversas publicações 12,15,16,17,18,19,20,21,22. Usando essas duas linhagens celulares com tempos de duplicação diferentes (16 h para OCSC1-F2 e 36 h para R182), uma diferença no tempo para alcançar o crescimento logarítmico dentro do tecido omental foi observada. No entanto, fomos bem sucedidos em estabelecer ambas as linhagens celulares no sistema de co-cultura.
A comunicação eficiente entre pesquisadores, coordenadores de pesquisa e equipes cirúrgicas foi fundamental para a coleta e processamento de espécimes de omento. O pesquisador identificou os candidatos ao protocolo, os coordenadores da pesquisa obtiveram o consentimento dos pacientes antes da cirurgia e o pesquisador coletou os espécimes da sala de cirurgia. Dado esse fluxo de trabalho, o cronograma do investigador teve que ser flexível, pois muitos fatores do lado do paciente que afetavam a coleta eram imprevisíveis (por exemplo, cirurgia cancelada, tempo de cirurgia alterado, omento inadequado ou nenhum removido). A visualização direta e a seleção dos tecidos da sala de cirurgia garantiram a integridade do espécime, a esterilidade cirúrgica e o processamento oportuno. Inicialmente, a coleta dos espécimes foi delegada aos coordenadores de pesquisa; no entanto, depois que alguns espécimes foram coletados, notamos que o tempo para o processamento foi atrasado (i.e., >4 h) e a qualidade do omento foi grosseiramente inferior (por exemplo, o tecido estava em pedaços). Em um ensaio experimental, o tecido omental foi armazenado a 4 °C por 48 h antes da injeção porque as células cancerosas não estavam prontas a tempo. Crescimento tumoral semelhante ainda foi observado, mas esta sequência não se repetiu, pois as mudanças de temperatura são conhecidas por afetar o microambiente tumoral (TME).
Antes da coleta do espécime, era importante ter células cancerosas suficientemente confluentes de acordo com o cronograma cirúrgico. Como o número de espécimes coletados a cada mês variava, culturas ativas de células cancerosas de ovário nem sempre foram mantidas. As células congeladas foram descongeladas com pelo menos 1 semana de antecedência, plaqueadas usando um protocolo padrão e, em seguida, passadas as células pelo menos uma vez para garantir a viabilidade. As linhagens celulares utilizadas neste protocolo foram relativamente resilientes; no entanto, ainda encontramos casos em que as células não haviam se recuperado até o dia da cirurgia e não puderam ser injetadas. Neste estudo, não houve tentativa de injetar células cancerosas menos de 50% confluentes. Atrasos subsequentes relacionados ao preparo celular foram atenuados com o uso de boa técnica estéril e divisão das células em proporções para manter a confluência dependendo do cronograma de coleta previsto. Limitamos o protocolo a apenas duas linhagens de células cancerosas marcadas fluorescentemente, mas é importante notar que outras linhagens de células cancerosas estabelecidas ou células cancerosas primárias sem proteínas fluorescentes também poderiam ser utilizadas.
Finalmente, a taxa de crescimento tumoral foi correlacionada com a confluência de células cancerosas adjacentes e dentro dos adipócitos imediatamente após a injeção. Isso foi determinado por meio de imagens fluorescentes de todos os espécimes de omento após a injeção. Em comparação com a inoculação de células tumorais de órgãos sólidos ou tecidos subcutâneos, a injeção de células cancerosas no tecido omental foi mais desafiadora. A estrutura frouxa e a consistência gordurosa do omento impedem que o tecido retenha efetivamente volumes de suspensão celular sem vazamento. Quando uma agulha menor (ou seja, 30 G ou mais estreita) foi usada para injetar, houve preocupação com a fragmentação celular à medida que a proliferação celular foi diminuída. Testamos várias técnicas de injeção, números de células e volumes de suspensão de células e encontramos resultados consistentes com o protocolo descrito acima. Ao mesmo tempo, reconhecemos que tais variações no protocolo provavelmente ainda produzirão resultados semelhantes, dada a natureza maligna das células. A adição de Matrigel facilitou a etapa de injeção, pois a matriz extracelular segurou melhor a suspensão celular; no entanto, este método é mais caro e não produziu consistentemente uma carga tumoral maior nas amostras. Em geral, foi raro que qualquer um dos espécimes de omento não crescesse tumores, mas o número de tumores e a velocidade de crescimento variaram.
Este modelo simulou uma característica da tumorigênese do câncer de ovário replicando metástases precoces para tecidos peritoneais ricos em tecido adiposo. Este protocolo permite variação sem habilidade necessária, é fácil de replicar e gera um sistema com potencial valor translacional. Em comparação com os modelos in vitro e ex vivo existentes no câncer de ovário, o método descrito aqui combina várias técnicas para produzir um modelo que retenha a arquitetura tumoral e a EMT por uma longa vida útil. Além disso, observamos que quando um espécime de omento com múltiplos tumores foi transferido para um novo poço e cultivado com omento livre de câncer (ou seja, não injetado), o omento virgens foi semeado com células cancerosas dentro de 7 dias. Este achado sugere que os tumores replicados retêm potencial metastático via transição epitélio-mesenquimal. Não identificamos na literatura modelos semelhantes de câncer de ovário que cultivassem biópsias teciduais por longos períodos de tempo. Esta abordagem é apoiada por um achado anterior de que células mesoteliais isoladas de omento de camundongos poderiam ser cultivadas por mais de 30 passagens após a coleta23.
O modelo descrito neste estudo pode ser empregado para entender melhor o efeito da interação direta entre as células cancerosas do ovário e as células dentro do omento rico em adiposo. As células cancerosas podem ser dissociadas dos tecidos do omento e obtidas para análise transcriptômica ou imunoistoquímica (IHQ). Além disso, as células podem ser usadas para estudos de resposta a drogas.
As principais limitações desse modelo são que o número de tumores, a taxa de crescimento tumoral e a localização dos tumores eram imprevisíveis. A falta de padronização e variação entre as amostras poderia limitar a aplicação desse modelo. Também fizemos várias observações que necessitarão de um exame mais aprofundado durante o desenvolvimento deste protocolo. Por exemplo, as réplicas "controle" em um experimento não estavam realmente livres de câncer, pois o paciente foi subsequentemente diagnosticado com micrometástase omental; entretanto, os tumores não injetados mantiveram-se viáveis durante todo o período experimental. Aplicações futuras deste modelo incluirão estudos moleculares da TME durante a tumorigênese inicial, manipulação da TME por injeção de células imunes e investigações de resposta a drogas. Em resumo, acreditamos que o modelo pré-clínico aqui descrito irá adicionar ao repertório de ferramentas de pesquisa existentes e ajudar a elucidar os mecanismos moleculares da ETM no câncer de ovário.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O presente estudo é financiado em parte pela The Janet Burros Memorial Foundation. Agradecemos às pacientes e ao Departamento de Oncologia Ginecológica do Instituto do Câncer Karmanos pela coleta das amostras de omento. Também agradecemos ao Biobank e ao Correlative Sciences Core do Karmanos Cancer Institute pela coordenação do recrutamento de pacientes e preparação de lâminas de patologia. O Biobank and Correlative Sciences Core é apoiado em parte pela concessão P30 do NIH Center CA22453 ao Karmanos Cancer Institute da Wayne State University.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| Seringa de insulina de 1 mL com agulha destacável de 26 G | BD | 329652 | |
| 10 mL Pipetas sorológicas | CELLTREAT | 229010B | |
| Prato de cultura de tecidos de 100 mm | Fisherbrand | FB012924 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | CELLTREAT | 229411 Célula de | |
| 24 poços Placa de Cultura | Costar | 3524 | |
| Tubo de Centrífuga de 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Frasco de Cultura de Tecidos | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamina, +2.438 g/L Sódio Bicarbonato | Gibco | 11320033 | |
| Soro Fetal Bovino, Qualificado | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Matriz de membrana basal |
| nº 10 Bisturi descartável de aço inoxidável | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 ( 1x) | Gibco | 10010023 | |
| Microscópio de rotação | Echo |
Referências
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Reimpressões e permissões
