Summary
Denne protokollen gir en musemodell av ulcerøs koloproktittassosiert kolorektal kreft indusert av azometan kombinert med dekstransulfatnatrium. Modellen ble brukt til å evaluere effekten av tradisjonelle kinesiske medisinforbindelser i forebygging og behandling av kolorektal kreft.
Abstract
Kolorektal kreft (CRC) er en vanlig malignitet i fordøyelsessystemet og har blitt den tredje vanligste maligniteten over hele verden og den nest største årsaken til malignitetsrelatert død. Ulcerøs koloproktitt (UC) er en forstadier til kreft, og UC-assosiert CRC (UC-CRC) er den vanligste subtypen av CRC. Derfor er en rimelig UC-CRC-modell hjørnesteinen og garantien for ny stoffutvikling. Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har blitt mye brukt i behandlingen av UC-CRC på grunn av sin gode effekt. Som en klassisk tonic resept på TCM, har Liujunzi decoction (LJZD) blitt mye brukt i behandlingen av UC-CRC. I denne studien ble en UC-CRC-modell etablert ved å kombinere azometan og dekstransulfatnatrium, og LJZD ble administrert. Dataene bekreftet at LJZD effektivt kan hemme kreftovergang i UC-CRC ved å bruke musens kroppsvekt, kolorektal lengde, patologiske og inflammatoriske faktorer, kolorektal barrierefunksjon og kreftmarkører. Denne protokollen gir et system for evaluering av effekten av TCM i forebygging og behandling av UC-CRC.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er en vanlig gastrointestinal malignitet, den tredje vanligste maligniteten, og den nest vanligste dødsårsaken i verden, og står for 10% av den globale kreftforekomsten og 9.4% av den totale kreftrelaterte døden 1,2. Genetiske faktorer, kronisk betennelse, fettfattig kosthold, diabetes og unormal tarmflora er risikofaktorer for CRC 3,4. Blant dem er inflammatorisk tarmsykdom, spesielt ulcerøs koloproktitt (UC), en klar risikofaktor for CRC 5,6. UC-assosiert CRC (UC-CRC) er en overgangsprosess av betennelse, atypisk hyperplasi og kreft basert på kronisk betennelse i kolorektum, som er forskjellig fra den typiske adenom-adenokarsinomutviklingsmodellen til CRC 7,8. Sammenlignet med den generelle befolkningen er risikoen for CRC ca. 10-40 ganger høyere hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom9.
For tiden er kirurgi fortsatt standardbehandling for CRC, og avhengig av plasseringen og stadiet av svulsten, er strålebehandling, systemisk medisinbehandling eller en kombinasjon av begge mulige10. Selv om disse tradisjonelle behandlingsmodalitetene har gjort store fremskritt, på grunn av den høye heterogeniteten og tilbakefallsraten av CRC, er prognosen dårlig, og behandlingseffekten er ikke ideell 11,12. Derfor er tidlig deteksjon, tidlig diagnose og omfattende behandling nøkkelen til å forbedre overlevelsesraten for CRC-pasienter, og det er spesielt viktig å være oppmerksom på transformasjonen av UC til CRC. Gjennom årene har tradisjonell kinesisk medisin (TCM) tiltrukket seg mye oppmerksomhet i behandlingen av UC-CRC eller kronisk gastritt på grunn av begrensede bivirkninger og betydelig effekt. Basert på dialektisk behandling har berømte kinesiske medisinutøvere av ulike generasjoner skapt et stort antall klassiske resepter, for eksempel Huangqi Jianzhong avkok13, Sijunzi avkok14 og Sishen pille15.
Liujunzi decoction (LJZD) stammer fra verkene til Yi Xue Zheng Zhuan samlet i Ming-dynastiet og er en klassisk resept i TCM16. Som vist i tabell 1 består LJZD av seks tradisjonelle urter, inkludert Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) og Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), som har effekten av å fylle qi og styrke milten, tørke fuktighet og løse slim. I moderne klinisk praksis brukes det ofte til å behandle kronisk gastritt, magesår og duodenale sår. Moderne farmakologisk forskning har vist at LJZD og modifisert LJZD har høy applikasjonsverdi i adjuvant behandling av UC og kreft i fordøyelseskanalen 17,18,19.
For tiden er det mange måter å konstruere UC-CRC musemodeller på, men azoksymetan (AOM) / dextransulfatnatrium (DSS) indusert musemodell er den mest brukte UC-CRC-modellen; de kliniske symptomene, morfologiske, og patologiske observasjoner har vist at modellen er svært lik human UC-CRC20,21. Det grunnleggende prinsippet er å først indusere karsinogenese med kjemisk kreftfremkallende AOM og deretter kontinuerlig utsette mus for det inflammatoriske stimuleringsmiljøet til DSS for å simulere kontinuerlig skade og reparasjon av tarmslimhinneepitel, og derved konstruere en UC-CRC musemodell22. Målet med denne studien er å etablere en musemodell av UC-CRC ved intraperitoneal injeksjon av AOM og syklisk stimulering av DSS på kort sikt og å evaluere effekten av stoffet og den molekylære mekanismen til LJZD på UC-CRC for å gi et vitenskapelig grunnlag for behandling av UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyren er godkjent av etikkomiteen ved Changchun University of Chinese Medicine (rekordnummer: 2021214). Spesifikke patogenfrie C57BL/6J-mus (8-10 uker, vekt 18-22 g), hann og hunn, ble plassert i uavhengig ventilerte bur ved 22 °C og 65 % relativ fuktighet. Musene begynte forsøket etter 7 d adaptiv fôring, hvor de hadde fri tilgang til vann og kosthold.
1. Narkotika forberedelse
- Tilberedning av LJZD
MERK: Den kinesiske medisinen som ble brukt ble kjøpt fra Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine og ble identifisert som ekte kinesisk medisin (se tabell 1).- Ha Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) i en spesialisert keramisk gryte (se materialfortegnelse). Tilsett 1000 ml destillert vann og bløtlegg i romtemperatur i 1 time (se figur 1A).
- Pulver 12 g Fuling i fint pulver med en kvern og suge i 300 ml destillert vann i en annen beholder i 1 time ved romtemperatur.
- Bland ovennevnte kinesisk medisin i den spesialiserte keramiske potten. Kok blandingen og hold deretter på middels flamme til bare 300 ml avkok gjenstår. Bruk medisinsk gasbind til filtrering og konservering av filtratet ved romtemperatur.
- Tilsett 1000 ml destillert vann og gjenta avkoksoperasjonen ovenfor en gang til. Filtrer igjen ved hjelp av medisinsk gasbind. Kombiner filtratet og kok det til bare 150 ml gjenstår.
- Sentrifuge den konsentrerte væsken ved 10.000 x g i 5 minutter, og konsentrer den oppnådde supernatanten videre til 30 ml på middels varme. Overfør det endelige konsentratet til en tallerken og tørk det med en elektrisk tørkeovn til bare løsemiddelet forblir som et pulver.
- Vei ovennevnte faste stoff og oppløs det i sterilt destillert vann for å oppnå en oppløsning som inneholder 22,85 mg legemiddel per 0,2 ml (114,16 mg / ml), som er den daglige dosen av mus.
- Fremstilling av 5-amino salisylsyre
MERK: 5-aminosalisylsyre (5-ASA; se materialfortegnelse) har en god forebyggende effekt på UC-CRC, og det ble brukt som et positivt stoff i denne studien23.- Løs opp 64 mg 5-ASA pulver i 200 ml sterilt destillert vann for å oppnå 1,82 mg/ml 5-ASA-oppløsning. Den daglige dosen for en enkelt mus var 0,2 ml.
- Tilberedning av AOM injeksjonsvæske
- Tilsett 2,5 ml sterilt destillert vann i 25 mg AOM-pulver (se materialfortegnelse), og bland med vortexblander (se materialfortegnelse) for å lage 10 mg/ml AOM-stamløsning, oppbevares ved -20 °C til bruk.
- Klargjør AOM-injeksjonsoppløsningen ved å fortynne AOM-oppløsningen med sterilt destillert vann ved 10:1 (1 mg/ml).
2. Etablering av UC-CRC-modell
MERK: Eksperimentet ble delt inn i 4 grupper: kontroll, modell, LJZD og 5-ASA-gruppe, 10 mus i hver gruppe. Bortsett fra kontrollgruppen ble de andre gruppene behandlet med AOM og DSS.
- Intraperitoneal injeksjon av AOM injeksjonsvæske
MERK: Etter adaptiv fôring i 7 dager fikk mus AOM injeksjonsoppløsning (1 mg/ml) ved intraperitoneal injeksjon (se figur 1B).- Hold musen med magen opp og hodet litt ned. Ta tak i bakhuden for å stramme bukhuden og stikk hull på huden ca. 1 cm til høyre for skjæringspunktet mellom rotlinjen på begge lårene på midten av buklinjen med en 1 ml sprøyte (se materialfortegnelse).
- Skyv 1 ml sprøytekanylen i en avstand på 3-5 mm under huden, hold den parallell med den abdominale midtlinjen, og stikk nålen 0,3-0,5 mm inn i bukhulen ved 45°.
- Etter at spissen passerer gjennom bukemuskelen, registrerer operatøren et plutselig tap av motstand. Deretter trekker du sprøyten utover og bakover for å observere om væske siver opp. Hvis ikke, skyv AOM-injeksjonsoppløsningen langsomt inn i musene ved 0,1 ml/10 g.
- Syklisk stimulering av 2% DSS-løsning
MERK: Hver AOM-indusert mus ble gitt 500 ml DSS-løsning i uke 3, 6 og 9, og musene drakk fritt i denne perioden.- Forbered 2% DSS-oppløsning ved å tilsette 500 ml sterilt destillert vann til 10 g DSS (se materialfortegnelse). Bland med en virvelblander og oppbevar ved 4 °C til bruk.
- Hver AOM-indusert mus drikker 500 ml 2% DSS-oppløsning fritt i 7 d i uke 3, 6 og 9 etter AOM-induksjon.
3. Narkotikabehandling
MERK: Voksne mennesker trenger 63 g LJZD per dag. I henhold til omregningsformelen for eksperimentell dose til mus og humant legemiddel, ekvivalent eksperimentell dose for mus (mg/kg) = human dose (mg/kg)/kroppsvekt (60 kg) x 9,1, var den daglige dosen av mus ca. 9,6 g/kg.
- Behandle LJZD- og 5-ASA-gruppen med 0,1 ml/10 g av den tilberedte LJZD- og 5-ASA-oppløsningen med gastrisk gavage ved henholdsvis uke 7 og uke 15.
- For intragastrisk administrering hos mus, utfør følgende prosedyre. Hold musen i venstre hånd, og i høyre hånd, hold mageperfusjonsapparatet. Sett sprøytenålen i munnen og skyv den ned på bakveggen i musens svelg. Skyv ned svelget mens musene svelger og fortsett å bevege seg fremover. Når det var en følelse av motstand, og sprøyten kunne skyves inn i svelget, trekk nålen ut og fullfør injeksjonen.
- Behandle kontroll- og modellgruppen med samme mengde saltvann (se Materialfortegnelse).
- Behandle musene i hver gruppe med egnet legemiddel en gang daglig til samme tid i administrasjonsperioden.
4. Evaluering av UC-CRC-modell og effekt av LJZD
- Sykdomsaktivitetsindeksscore
MERK: I henhold til tabell 2 ble sykdomsaktivitetsindeksen (DAI) -poengsummen evaluert ved å kombinere vekttap, fekal viskositet og avføringsblødning fra musene.- Registrer musens vekt daglig fra begynnelsen av adaptiv fôring til slutten av medisinbehandlingen.
- Vær nøye med fekal konsistens av hver eksperimentell mus og registrer tarmbevegelsene som en av de tre forholdene: normal, løs avføring og vannaktig diaré.
- Registrer fekal blødning av forsøksdyr som en av de tre forholdene: ingen blødning, liten blødning og synlig blod i avføring.
- Påvisning av IL-6 nivå i serum
- Behandle mus med LJZD eller 5-ASA i 9 uker. Fest musene ved å ta tak i musens nakkehud med venstre hånd og trykk forsiktig på eksperimentbordet for å ta den laterale decubitusposisjonen. Klipp av musens whiskers med saks. Klipp av værhårene til musene med saks forsiktig (se materialfortegnelse) for å forhindre blodforurensning.
MERK: Mus som ikke kunne vrikke fritt ble ansett for å være riktig festet. Hvis dette ikke skjer, bør musene løses. - Bedøv musen ved innånding av 2% isofluran. Steriliser huden rundt øyebollet med etanol (se materialfortegnelse). Trykk forsiktig på øyehuden på siden for å gjøre øyebollet overbelastet og utstående.
- Klem øyebollet med en albue pinsett og fjern øyebollene nøyaktig og raskt. La blodet dryppe ned i sentrifugalrøret (se materialfortegnelse). I prosessen trykker du på musens hjerte for å øke blodinnsamlingen.
- Hold det oppsamlede blodet i romtemperatur i 30 minutter og sentrifuger det ved 3 500 x g i 10 minutter. Samle supernatanten og oppdag IL-6-nivået i henhold til instruksjonene for IL-6-innholdsdeteksjonssettet (se materialfortegnelse).
- Behandle mus med LJZD eller 5-ASA i 9 uker. Fest musene ved å ta tak i musens nakkehud med venstre hånd og trykk forsiktig på eksperimentbordet for å ta den laterale decubitusposisjonen. Klipp av musens whiskers med saks. Klipp av værhårene til musene med saks forsiktig (se materialfortegnelse) for å forhindre blodforurensning.
- Separering av kolorektalt vev
- Avliving av musene etter blodprøvetaking ved å inhalere 5 % overdosert isofluran og cervikal dislokasjon (se materialfortegnelse) i samsvar med dyreetikk.
- Hold musene i et kryogent anatomisk miljø. Immobiliser musene i en liggende stilling. Klipp håret på underlivet med saks og steriliser det med etanol.
- Klyp skjæringspunktet mellom de to lårrøttene og den abdominale midtlinjen med øyelokktang (se Materialfortegnelse). Klipp et tverrsnitt ca 1-1,5 cm med saks.
- Klipp et langsgående snitt langs midtlinjen i abdomen fra midtpunktet i tverrsnittet mot xiphoidprosessen.
- Fjern peri-kolorektale vev i retning av anus for å skille kolorektum fra det omkringliggende vevet. Vær forsiktig så du ikke skader kolorektumet.
- Skyv bukets hud til sidene for å fullstendig eksponere kolorektumet. Fjern kolorektum fra bukhulen med øyelokktang og kutt av segmentene fra anus til cecum (ekskludert); Den totale lengden er ca 10 cm. Oppbevar det oppnådde kolorektale vevet i saltvann ved 4 °C.
- Evaluering av lengden og vekten av endetarmen
- Trekk ut saltvannet ved 4 °C med en 5 ml kanyle (se materialfortegnelsen) for å skylle innsiden av kolorektum. Deretter legger du kolorektum på absorberende papir for å absorbere fuktigheten i vevet.
- Vei kolorektale vev og legg dem deretter på A4-papir for å måle lengden.
- Mål antall svulster i kolorektum
- Klipp kolorektumet i lengderetningen for å utfolde det fullt ut og observere antallet og størrelsen på svulstene i kolorektumet.
- Patologisk analyse av kolorektum
- Fest kolorektum i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Legg det faste rektale vevet i smeltet parafin og seksjon kontinuerlig med en tykkelse på 5 μm av et vev som fryser mikrotom.
- I henhold til prosedyren til Hou et al.24, devoks seksjonene i xylen og dehydrer den deretter med serielle konsentrasjoner av etanol. Etter farging med hematoksylinoppløsning i 5 minutter, skyll seksjonene med rent vann. Deretter flekker du med 0,5% eosinoppløsning i 1 min(se materialtabell).
- Utfør gradient dehydrering og xylen gjennomsiktig behandling igjen. Forsegle seksjonene og observer dem under det optiske mikroskopet (se materialfortegnelse) og fotografer, som beskrevet av Xie et al.25.
- Immunhistokjemisk analyse av kolorektum
- Devoks og dehydrer seksjonene i henhold til metoden ovenfor. Reparer antigenet i seksjonene med høytrykks termisk reparasjonsteknikk, som beskrevet av Gok et al.26.
- Bløtlegg seksjonene i endogene peroksidaseblokkere ved romtemperatur i 15 minutter. Forsegl seksjonene med geitserum (se materialfortegnelse).
- Legg det primære antistoffet ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) og KI67 (1:500; se materialfortegnelse) til seksjonene og inkuber over natten ved 4 °C. Skyll seksjonene med PBS-buffer (se materialfortegnelse), tilsett sekundært antistoff til generell bruk (1:5000; se materialfortegnelse) og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Legg til DAB-løsningen (se Materialfortegnelse) i seksjonene for fargeutvikling. Motflekk seksjonene med hematoksylinoppløsning.
- Dehydrer, transparentiser og forsegl seksjonene igjen. Vær oppmerksom på uttrykket av protein ved det optiske mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avkoket av LJZD ble fremstilt i henhold til sammensetningsforholdet mellom legemidler i tabell 1 og avkoksmetoden for TCM i figur 1A. I henhold til tidspunktet angitt i figur 1B ble mus intraperitonealt injisert med 1 mg / ml AOM på den 7. dagen, og mus fikk fri tilgang til drikkevann som inneholdt 2% DSS i 3., 6. og 9. uke. UC-CRC-musemodellen ble vellykket etablerti den 15. uken. I mellomtiden ble mus behandlet med LJZD med gavage fra uke 7 til uke 15. Dataene viste at sammenlignet med kontrollgruppen hadde UC-CRC-modellgruppen et signifikant vekttap, som ble lindret ved LJZD-behandling (figur 2A, P < 0,01). På slutten av studien forbedret LJZD-behandling DAI-poengsummen sammenlignet med UC-CRC-modellgruppen (figur 2B). Sammenlignet med kontrollgruppen hadde UC-CRC-modellgruppen en kortere kolorektal lengde, som ble økt ved LJZD-behandling (figur 2C,D, P < 0,01). Forholdet mellom kolorektal vekt og kroppsvekt gjenspeiler utviklingen av CRC hos mus, og et høyere forhold indikerer akutt tumorutvikling27. Sammenlignet med kontrollgruppen ble kolorektal organindeks for modellgruppen signifikant økt, og LJZD-behandling reduserte kolorektal organindeks kraftig (figur 2E, P < 0,05). I tillegg hemmet LJZD-behandling også dannelsen av kolorektale svulster (figur 2F, P < 0,01) og nivået av serumproinflammatorisk faktor IL-628 (figur 2G, P < 0,05).
Patologiske resultater bekreftet at musene i UC-CRC-modellgruppen sammenlignet med kontrollgruppen hadde større kolorektale svulster og hadde dannet adenokarsinom, mens LJZD-behandling reduserte størrelsen og karakteren av svulstene (figur 3). Immunhistokjemiske data viste at LJZD-behandling forbedret kolorektal barrierefunksjon i UC-CRC-modellmus, indikert ved forhøyet proteinuttrykk av ZO-1 og Occludin29 (figur 4). Parallelt undertrykte LJZD-behandling proteinuttrykksnivåene til kreftmarkøren KI6730 (figur 4).
Figur 1: Fremstilling av LJZD og etablering av musemodell for koloproktittkreft.( A) Blandingen av Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) og ingefærbehandlet Ban Xia (9 g) ble nedsenket i 1000 ml destillert vann ved romtemperatur i 1 time. 12 g Fuling-pulveret ble dynket i 300 ml destillert vann ved romtemperatur i 1 time. Blandingen av de ovennevnte seks urtene ble avkokt ved 100 °C i 40 minutter. (B) På dag 7 ble C57BL/6J-mus intraperitonealt injisert med 1 mg/ml AOM. Mus ble gitt vann som inneholdt 2% DSS ad libitum i 3., 6. og 9. uke. Fra 7 til 15 uker ble mus gitt LJZD ved gavage. Forkortelser: AOM, azometan; DAI, sykdomsaktivitetsindeks; DSS, dekstransulfatnatrium; LJZD, Liujunzi avkok; W, uke. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Evaluering av UC-CRC-modell og effekt av LJZD. (A) LJZD forbedret kroppsvekt i UC-CRC-modellmus. (B) LJZD lindret DAI-score i UC-CRC-modellmus. (C, D) LJZD økte lengden på kolorektum i UC-CRC-modellmus. (E) LJZD reduserte organindeksen for kolorektum i UC-CRC-modellmus. (F) LJZD hemmet kolorektal tumorigenese i koloproktitt kreft modell mus. (G) LJZD undertrykte serum IL-6 nivå i UC-CRC modell mus. #P< 0,05 og ##P< 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen; *P < 0,05 og **P< 0,01, sammenlignet med modellgruppen. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 10) og ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys test. P < 0,05 indikerte en statistisk signifikant forskjell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av de patologiske egenskapene til kolorektalt vev hos mus ved hematoksylin-eosinfarging. Det var ingen patologisk skade i kontrollgruppen. Tumorvevet i UC-CRC-modellgruppen var stort og hadde dannet adenokarsinom og høygradig neoplasi, mens LJZD-behandlingsgruppen hadde redusert tumorvev ledsaget av en liten mengde lokal adenom og lavgradig neoplasi. Den svarte pilen representerer forstadier til dysplastisk tumorkjertel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekt av LJZD på kolorektal barrierefunksjon og kreftmarkør i UC-CRC modellmus. (A) Immunhistokjemiske bilder av ZO-1, Occludin og KI67. (B) Statistiske resultater av proteinuttrykk av ZO-1, Occludin og KI67. LJZD-behandling økte ekspresjonen av kolorektal barriere funksjonelle proteiner ZO-1 og Occludin, mens redusert nivå av kreftmarkør KI67 i UC-CRC-modellmus. ## P < 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen; ** P < 0,01, sammenlignet med modellgruppen. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 10) og ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys test. P < 0,05 indikerte en statistisk signifikant forskjell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter | Pinyin | Vekt (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Poria kokos | Oppfyllelse | 12 |
| Atractylodis makrocephalae rhizoma | Baizhu | 12 |
| Lakris | Gancao | 6 |
| Tørket appelsinskall | Chenpi | 12 |
| Rhizome Pinelliae Preparata | Jiangbanxia | 9 |
Tabell 1: Sammensetning og andel legemidler i LJZD.
| Elementer | Grad eller symptomer | Score |
| Vekttap | < 1 % | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Fekal okkult blodprøve | Negativ | 0 |
| Positiv | 2 | |
| synlig blod i avføringen med det blotte øye | 4 | |
| Fekal konsistens | normal | 0 |
| løs avføring | 2 | |
| vannaktig diaré | 4 |
Tabell 2: Sykdomsaktivitetsindeksscore for UC-CRC-modell hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRC er en av de vanligste kreftene over hele verden, med ca 1.148.000 nye tilfeller og mer enn 576.000 dødsfall hvert år. CRC kan deles inn i tre typer i henhold til forskjellige årsaker, inkludert arvelig, sporadisk og UC-CRC31. Forekomsten av CRC hos pasienter med inflammatoriske tarmsykdommer som UC er signifikant høyere enn i befolkningen generelt. UC stimulerer utviklingen av CRC gjennom den inflammatoriske kreftveien, som skiller seg fra den typiske adenom-adenokarsinomveien6. For tiden er årsaken til UC-CRC ukjent, hovedsakelig forårsaket av langvarig tilbakevendende kronisk betennelse, med en dødelighet på opptil 60%32,33. Det er ingen effektiv behandling for UC-CRC, som har vært hotspot for forskning de siste årene. Å forstå den molekylære mekanismen til UC-CRC er avgjørende for tidlig påvisning og presis behandling av UC-CRC.
For tiden er det mange metoder for å konstruere dyremodeller av UC-CRC, og dannelsesmekanismer er forskjellige. IL-10 eller Muc2/4 genknockout, som resulterer i epitelbarrieredefekter, kan indusere spontan kolitt hos mus, så det brukes ofte til å konstruere CRC-modeller fra dyr basert på genetiske defekter assosiert med UC 34,35,36. Ikke desto mindre kan dyremodellen av UC-CRC indusert av genknockout ikke simulere den komplette patogenesen av sykdommen, og operasjonsmetoden er kompleks, forsøket er dyrt, og det har åpenbare begrensninger. Kjemisk induksjon er den klassiske og vanlige metoden for å konstruere UC-CRC dyremodeller 37,38. DSS, AOM og dimetylhydrazin er alle vanlige kjemiske induktorer for konstruksjon av UC-CRC. Imidlertid tar bruk av disse kjemiske reagensene alene for å etablere dyremodeller lang tid og har en lav suksessrate39. Studier har vist at forekomsten av UC-CRC indusert av kombinasjonen av AOM og DSS kan nå nesten 100%40. Sammenlignet med andre metoder har kombinasjonen av AOM / DSS fordelene med enkel betjening, sterk kontrollerbarhet, kort syklus og høy replikasjonshastighet, og kan bedre simulere human UC-CRC når det gjelder patologi og molekylær mekanisme 40,41,42. Selv om bruken av AOM / DSS-syklusstimulering for å konstruere UC-CRC-modellen har mange fordeler, har den også ulempene med lang modelleringstid, dyre modelleringsreagenser, og kan fortsatt ikke fullt ut simulere patogenesen av human UC-CRC.
For å søke et potensielt terapeutisk mål for UC-CRC brukte vi AOM, et kjemisk kreftfremkallende middel, i kombinasjon med DSS-induserte mus for å etablere en UC-CRC-modell. I denne studien viste mus utsatt for AOM og syklisk stimulering av DSS varierende grad av UC-CRC-relaterte symptomer. Sammenlignet med kontrollgruppen ble DAI-poengsummen til modellgruppen signifikant økt, noe som ble manifestert som vekttap, blodavføring, løs avføring eller vannet diaré. Mens LJZD reduserte DAI-poengsummen betydelig. Forkortet kolorektum lengde er en viktig markør for inflammatorisk respons i UC-CRC43,44. I denne studien var kolorektumlengden til modellmusene betydelig kortere enn kontrollgruppens, og LJZD kunne forbedre det forkortede kolorektumet. Kolorektal slimhinne utvikler kronisk betennelse, som gradvis utvikler seg til atypisk hyperplasi av kolorektalt vev og til slutt forårsaker kreft45. I denne studien økte antall svulster i kolorektalt vev av mus i modellgruppen signifikant sammenlignet med kontrollgruppen, og tilsvarende økte kolorektal vevsvekt også. Etter LJZD-behandling reduserte antall svulster betydelig, og kolorektalvekten ble redusert. Det antydes at LJZD har en signifikant hemmende effekt på dannelsen av CRC indusert av UC. Tidligere studier har funnet at LJZD kan lindre betennelse og redusere ekspresjonsnivåene av TNF-α, IL-6 og IL-1β in vivo 16,28,46. I denne studien økte serumnivået av IL-6 hos mus i modellgruppen, men produksjonen av serum IL-6 ble signifikant hemmet etter LJZD-behandling.
Mikroskopisk observasjon viste inflammatorisk infiltrasjon av rektumvev, ødeleggelse av slimhinnebarrieren, reduksjon av slimutskillelse, uregelmessig eller forsvinning av begerceller, forvrengning eller atrofi av tarmkrypter og åpenbar forstyrrelse av kjertelstruktur hos AOM/DSS-behandlede mus. Etter LJZD-behandling var morfologien til begerceller i kolorektalt vev normal, strukturen i fordypning og kjertel var regelmessig, og skaden på slimhinnebarrieren ble forbedret. Epithelial tight junction (TJ) er en uunnværlig mekanisk barriere for å opprettholde celleintegritet og permeabilitet, hovedsakelig inkludert ZO-1 og Occludin29. Det har blitt rapportert at ekspresjonen av TJ-proteiner som ZO-1 i kolorektalt vev hos UC-CRC-pasienter er signifikant redusert47,48. Denne studien viste at kolorektal mukosal vevsstruktur av UC-CRC-mus ble ødelagt, og uttrykket av ZO-1 og Occludin i vevet ble redusert, mens LJZD kunne reversere denne reduksjonen, noe som tyder på at LJZD kan beskytte integriteten til kolorektal slimhinnebarrieren ved å øke uttrykket av ZO-1 og Occludin. Nukleærassosiert antigen (KI67) er en viktig komponent i cellesyklusregulering og er mye brukt som en indikator på proliferativ aktivitet av tumorceller30,49. I denne studien ble KI67-proteinuttrykk økt i modellgruppen sammenlignet med kontrollgruppen, noe som indikerer signifikant tumorcelleproliferasjon i kolorektalt vev. Etter LJZD-behandling ble uttrykket av KI67-protein redusert, noe som viste at LJZD hadde en god effekt på UC-CRC.
Oppsummert kan AOM intraperitoneal injeksjon og DSS sirkulasjonsstimulering effektivt etablere en UC-CRC-modell på kort tid og ligner human UC-CRC når det gjelder histopatologi og molekylære mekanismer for dannelse. Som en klassisk resept kan LJZD redusere DAI-poengsummen, kolorektal vevsvekt og inflammatoriske faktornivåer, effektivt hemme forkortelsen av kolorektal lengde og spille en rolle i scenen av UC i UC-CRC-mus. Samtidig kan det øke ekspresjonen av TJ-proteiner, forbedre den patologiske skaden på kolorektalt vev betydelig, redusere uttrykket av KI67-protein, redusere forekomsten av vevstumorer betydelig og hemme transformasjonsprosessen av UC til CRC. Denne studien gir en ny ide for behandling av UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Jilin Provincial Department of Science and Technology (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
