Demonstração de Cultura de Folha de Células Auto-Montadas e Geração Manual de um Organoide 3D Semelhante a Tendão/Ligamento usando Fibroblastos Dérmicos Humanos

Summary

Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.

Abstract

Tendões e ligamentos (T/L) são estruturas fortes e hierarquicamente organizadas que unem o sistema musculoesquelético. Esses tecidos têm uma matriz extracelular (MEC) rica em colágeno tipo I estritamente disposta e células da linhagem T/L posicionadas principalmente em fileiras paralelas. Após a lesão, o T/L requer muito tempo para reabilitação com alto risco de falha e resultados de reparo muitas vezes insatisfatórios. Apesar dos recentes avanços na pesquisa em biologia T/L, um dos desafios remanescentes é que o campo T/L ainda carece de um protocolo de diferenciação padronizado que seja capaz de recapitular o processo de formação T/L in vitro. Por exemplo, a diferenciação óssea e gordurosa de células precursoras mesenquimais requer apenas cultura de células bidimensionais (2D) padrão e a adição de meios de estimulação específicos. Para diferenciação em cartilagem, é necessária cultura tridimensional (3D) de pellets e suplementação de TGFß. No entanto, a diferenciação celular para o tendão precisa de um modelo de cultura 3D muito ordenado, que idealmente também deve ser submetido a estimulação mecânica dinâmica. Estabelecemos um modelo organoide de 3 etapas (expansão, estimulação e maturação) para formar uma estrutura 3D semelhante a uma haste a partir de uma folha de células automontada, que fornece um microambiente natural com seus próprios fatores ECM, autócrinos e parácrinos. Esses organoides em forma de bastonete têm uma arquitetura celular de várias camadas dentro de um ECM rico e podem ser manuseados com bastante facilidade para exposição a tensão mecânica estática. Aqui, demonstramos o protocolo de 3 etapas usando fibroblastos dérmicos disponíveis comercialmente. Pudemos mostrar que esse tipo de célula forma organoides robustos e abundantes em MEC. O procedimento descrito pode ser ainda mais otimizado em termos de meios de cultura e otimizado para estimulação mecânica axial dinâmica. Da mesma forma, fontes celulares alternativas podem ser testadas quanto ao seu potencial para formar organoides T/L e, assim, sofrer diferenciação T/L. Em suma, a abordagem organoide 3D T/L estabelecida pode ser usada como modelo para pesquisa básica de tendões e até mesmo para engenharia T/L sem andaimes.

Introduction

Tendões e ligamentos (T/L) são componentes vitais do sistema músculo-esquelético que fornecem suporte e estabilidade essenciais ao corpo. Apesar de seu papel crítico, esses tecidos conjuntivos são propensos à degeneração e lesão, causando dor e comprometimento da mobilidade¹. Além disso, seu suprimento sanguíneo limitado e capacidade de cicatrização lenta podem levar a lesões crônicas, enquanto fatores como envelhecimento, movimentos repetitivos e reabilitação inadequada aumentam ainda mais o risco de degeneração e lesões². Os tratamentos convencionais, como repouso, fisioterapia e intervenções cirúrgicas, são incapazes de restaurar totalmente a estrutura e a função T/L. Nos últimos anos, os pesquisadores têm se esforçado para entender melhor a natureza intrincada da T/L, a fim de buscar tratamentos eficazes para os distúrbios T/L ^3,4,5. Os T/L distinguem-se por uma estrutura hierarquicamente organizada, dominada pela matriz extracelular (MEC), composta principalmente por fibras colágenas do tipo I e proteoglicanos, característica difícil de ser replicada in vitro⁶. Os modelos tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) não conseguem capturar a organização tridimensional (3D) característica dos tecidos T/L, limitando seu potencial translacional, bem como dificultando o progresso inovador no campo da regeneração T/L.

Recentemente, o desenvolvimento de modelos organoides 3D ofereceu novas possibilidades para o avanço da pesquisa básica e da engenharia de tecidos livres de andaimes de vários tipos de tecidos 7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, para investigar a junção miotendínea, Larkin et al. 2006 desenvolveram construções musculares esqueléticas 3D junto com segmentos tendinosos auto-organizados derivados do tendão da cauda de rato¹⁰. Além disso, Schiele et al. 2013, usando canais de crescimento revestidos de fibronectina microusinados, direcionaram a automontagem de fibroblastos dérmicos humanos para formar fibras celulares sem a ajuda de andaimes 3D, uma abordagem que pode capturar características-chave do desenvolvimento do tendão embrionário¹¹. No estudo de Florida et al. 2016, as células estromais da medula óssea foram primeiro expandidas em linhagens ósseas e ligamentares, em seguida usadas para gerar folhas de células de monocamada automontadas, que foram então implementadas para criar uma construção óssea-ligamento-osso multifásica imitando o ligamento cruzado anterior nativo, um modelo que visa melhorar a compreensão da regeneração ligamentar¹². Para elucidar os processos de mecanotransdução do tendão, Mubyana et al. 2018 utilizaram uma metodologia sem andaimes pela qual fibras de tendão único foram criadas e submetidas ao protocolo de carregamento mecânico¹³. Organoides são estruturas 3D auto-organizadas que imitam a arquitetura nativa, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos. As culturas organoides 3D fornecem um modelo fisiologicamente mais relevante para o estudo da biologia de tecidos e órgãos, bem como da fisiopatologia. Tais modelos também podem ser usados para induzir a diferenciação específica do tecido de diferentes tipos de células-tronco / progenitoras^14,15. Assim, a implementação de modelos organoides 3D no campo da biologia T/L e engenharia de tecidos torna-se uma abordagem muito atraente ^9,16. Fontes celulares alternativas podem ser implementadas para a montagem do organoide e estimuladas para a diferenciação tenogênica. Um tipo de célula relevante usado para demonstração neste estudo são os fibroblastos dérmicos ^7,17,18. Essas células são facilmente acessíveis por meio de um procedimento de biópsia de pele, que é menos invasivo em comparação com a punção da medula óssea ou lipoaspiração e pode ser multiplicado rapidamente para grandes números devido à sua boa capacidade proliferativa. Em contraste, tipos de células mais especializadas, como fibroblastos residentes em T / L, são mais difíceis de isolar e expandir. Portanto, os fibroblastos dérmicos também foram usados como ponto de partida para tecnologias de reprogramação celular para células-tronco embrionárias pluripotentes induzidas¹⁹. A sujeição de fibroblastos dérmicos a condições específicas de cultura 3D e pistas de sinalização, como o fator de crescimento transformador beta 3 (TGFß3), que tem sido relatado como um regulador chave de vários processos celulares, incluindo a formação e manutenção de T/L, pode potencializar sua diferenciação tenogênica in vitro levando à expressão de genes específicos do tendão e à deposição de ECM T/L típica^{20, 21}.

Aqui, descrevemos e demonstramos um protocolo organoide de 3 etapas (expansão 2D, estimulação 2D e maturação 3D) previamente estabelecido e implementado usando fibroblastos dérmicos humanos adultos normais (NHDFs) disponíveis comercialmente como fonte celular, oferecendo um modelo valioso para estudar a tenogênese in vitro ⁷. Apesar do fato de que este modelo não é equivalente ao tecido T / L in vivo, ele ainda fornece um sistema mais fisiologicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de diferenciação celular, imitando a fisiopatologia T / L in vitro e estabelecendo medicina personalizada T / L e plataformas de triagem de drogas. Além disso, no futuro, os estudos podem avaliar se os organoides 3D são adequados para a engenharia de T/L sem andaimes, otimizando ainda mais, bem como utilizáveis para o desenvolvimento de construções mecanicamente robustas em escala que se assemelham às dimensões e propriedades estruturais e biofísicas dos tecidos T/L nativos.

Protocol

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas por meio de técnicas assépticas.

1. Cultura e pré-expansão dos NHDFs

1. Descongelar rapidamente o frasco criogênico contendo fibroblastos dérmicos humanos normais criopreservados adultos (NHDFs, 1 x 10⁶ células) a 37 ° C até que estejam quase descongelando.
2. Adicione lentamente 1 mL de meio de crescimento de fibroblastos pré-aquecido 2 (kit pronto para uso incluindo meio basal, soro fetal de bezerro a 2% (FCS), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) e insulina) suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococo) (meio NHDF), pré-aquecido a 37 °C para as células.
3. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
4. Remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 12 mL de meio NHDF pré-aquecido.
5. Transferir as células para um balão T-75 e agitar brevemente de forma transversal. Colocar o balão T-75 a 37 °C numa incubadora humidificada com CO₂ a 5%.
6. Troque o meio a cada 2 dias. Observe os NHDFs ao microscópio até que atinjam 70% - 80% de confluência.

2. Expansão 2D

1. Retire o frasco T-75 da incubadora e remova o meio NHDF. Lave as células com solução salina tampão fosfato pré-aquecida (PBS).
2. Adicione 3 mL de tripsina-EDTA a 0,05% às células. Incubar as células a 37 °C numa incubadora humidificada com CO₂ a 5% até que as células se desprendam do frasco (aproximadamente 3 min).
3. Adicione 6 mL de meio NHDF pré-aquecido para neutralizar a ação da tripsina. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL.
4. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min a RT e retire o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet celular em meio de Eagles modificado (DMEM) de Dulbecco com baixa glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1x aminoácidos MEM, 1% de caneta/estreptococo, pré-aquecido a 37 °C.
6. Coloque os NHDFs em uma placa de cultura de células aderente de 10 cm a uma densidade de 8 x 10³ NHDFs/cm² (no total, 4,4 x 10⁵ NHDFs por placa de 10 cm). Balance suavemente de maneira transversal.
7. Coloque a placa de cultura de células de 10 cm a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias
8. Monitore as células ao microscópio até atingir 100% de confluência (ca. 5 dias).

3. Estimulação 2D

1. Retire as placas de cultura de células de 10 cm contendo os NHDFs (das etapas 2.6 e 2.7) da incubadora. Remova o meio de cultura e lave as células com PBS pré-aquecido.
2. Adicione 10 mL de meio de alta glicose DMEM suplementado com 10% de FBS, 50 μg / mL de ácido ascórbico e 1% de caneta / estreptococos, pré-aquecido a 37 ° C.
3. Coloque a placa de Petri a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias.
4. Monitore os NHDFs sob um microscópio por 14 dias.

4. 3D maturação

1. Retirar a placa de cultura de células de 10 cm da incubadora e remover o meio de glicose alto DMEM.
2. Retire com cuidado e rapidez a folha de células formada do prato com um raspador de células. Ao desconectar, role simultaneamente a folha de célula em um organoide 3D semelhante a uma haste.
3. Pegue e coloque os organoides NHDF em uma placa de Petri não aderente (para células) de 10 cm. Este tipo de prato é usado para evitar a emigração celular do organoide para o plástico.
4. Neste momento ou um dia depois (dia 0 ou dia 1 de maturação 3D), colete alguns dos organoides para análises adicionais, como peso úmido, avaliação histológica (os organoides do dia 1 são preferíveis à medida que se tornam mais compactos), RNA e isolamento de proteínas.
5. Fixe as bordas do organoide com pinos de metal da seguinte maneira:
   1. Segure um lado do organoide cuidadosamente com uma pinça e, com outra pinça, aplique suavemente o alongamento manual de aproximadamente 10% de alongamento axial. Para estimar o alongamento axial de 10%, use um papel milimétrico ou régua.
   2. Em seguida, pegue um pino de metal com a pinça e pressione manualmente a borda organoide no prato de plástico para fixá-lo. Repita este procedimento com o segundo pino na segunda borda do organoide.
6. Adicione 10 mL de meio DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS, 1x aminoácidos MEM, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 ng/mL de TGFß3 e 1% de caneta/estreptococo, pré-aquecido a 37 °C.
7. Coloque o prato de 10 cm a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ . Troque o meio a cada 2 dias.
8. Monitore os organoides regularmente por 14 dias.
   NOTA: Os pinos podem se soltar, portanto, refixe usando a mesma técnica descrita na etapa 4.5.
9. Após 14 dias, remova o meio de glicose alta DMEM dos organoides. Lave os organoides com PBS pré-aquecido.
10. Meça organoides para peso úmido no dia 0 e no dia 14 usando uma balança de precisão.
    1. Coloque um prato vazio de 10 cm na balança e tara o peso a zero para garantir que apenas o peso dos organoides seja medido. Retirar totalmente o meio de cultura da cápsula de 10 cm e medir o peso húmido organoide um a um.
       NOTA: Neste estudo, no dia 0, foram pesados três organoides por doador e, no dia 14, dois organoides por doador.
11. De acordo com os objetivos do estudo, implemente alguns dos organoides NHDF em análises histológicas adicionais ou congele-os imediatamente em nitrogênio líquido usando tubos estéreis livres de DNA/RNA para posterior isolamento de DNA, RNA e proteína e, em seguida, armazene-os a -80 °C.
12. Para investigação histológica, fixar cada organoide em 5 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado (4 °C) em PBS (ajustado para pH neutro) por 45 min em gelo, seguido de lavagem com PBS em RT (2 x 5 min cada).
13. Crioproteja os organoides fixos usando um gradiente de sacarose, colocando os organoides em potes de vidro para histologia. Incubar os organoides em solução de sacarose a 10% em solução de PBS por 2 h a 4 ° C, após 20% de sacarose / PBS por 2 h a 4 ° C e, finalmente, 30% de sacarose / PBS durante a noite incubação a 4 ° C. Troque as soluções de sacarose pipetando primeiro e depois enchendo com a nova solução.
14. Incorpore os organoides em meio criogênico.
    1. Coloque uma placa de cobre sobre gelo seco em uma caixa de isopor e deixe esfriar por 10 min.
    2. Em seguida, coloque um criomolde de plástico, pré-preenchido com meio criogênico, na placa de cobre e pressione suavemente o organoide no fundo do criomoldor usando uma pinça. Aguarde até que o criomeio esteja totalmente congelado.
    3. Para organoides longos, primeiro corte ao meio com um bisturi e coloque as duas metades paralelas uma à outra no criomolde. Repita o procedimento para cada organoide destinado a ser submetido à análise histológica.
15. Armazenar as amostras a -20 °C até à criosecção.
16. Usando um criotomo, corte os organoides longitudinalmente em seções de 10 μm de espessura e submeta a coloração histológica, como hematoxilina e eosina (H & E), usando o protocolo padrão⁸.

Results

O modelo organoide 3D T/L foi previamente estabelecido e demonstrado aqui pela implementação de NHDF comprado comercialmente (n=3, 3 organoides por doador, NHDF foram usados nas passagens 5-8). O fluxo de trabalho do modelo está resumido na Figura 1. A Figura 2 mostra imagens representativas de contraste de fase da cultura de NHDF durante a pré-expansão em frascos T-75 (Figura 2A), bem como no início e após 5 dias de cultura na etapa de expansão 2D em placas de cultura de células de 10 cm (Figura 2B). A Figura 2C (imagens representativas de contraste de fase) demonstra a confluência de NHDFs durante a estimulação 2D após 14 dias de cultura nas placas de cultura de células de 10 cm. Posteriormente, as folhas de células foram destacadas manualmente e simultaneamente enroladas em organoides 3D semelhantes a bastonetes (no dia 0, o comprimento do organoide é de aproximadamente 6 cm, largura de aproximadamente 0,4 cm), que foram cultivadas sob 10% de tensão estática por 14 dias (Figura 3, dia 0 e dia 14, imagens macroscópicas representativas). No dia 14 do processo de maturação 3D, os organoides exibiam uma aparência branca brilhante, contraídos e pareciam mais densos do que os organoides iniciais. O peso úmido dos organoides foi medido no momento da formação (dia 0) e novamente no dia 14 da etapa de maturação 3D (Figura 4). Foi observada uma redução significativa no peso úmido, indicando contração e reorganização estrutural da MEC dentro dos organoides durante o período de tempo desta etapa do protocolo. Além da mudança de peso, devido à contração, o comprimento do organoide também diminuiu (no dia 14, o comprimento do organoide é de aproximadamente 3,5 cm e a largura é de aproximadamente 0,3 cm). Nesse processo, os pinos de metal se soltaram e tiveram que ser refixados; portanto, durante os 14 dias de maturação 3D, recomendamos monitorar os organoides com frequência. Para avaliar a morfologia dos organoides, cortes longitudinais foram obtidos a partir de organoides NHDF coletados no dia 1 e no dia 14 da etapa de maturação 3D e submetidos à coloração H&E (Figura 5). No dia 1, os organoides exibiram camadas desconectadas, compostas principalmente de células cercadas por baixas quantidades de MEC. Além disso, as células dentro das camadas organoides não foram alinhadas ao longo do eixo organoide longitudinal usado como direção para a carga de tração estática aplicada. Os núcleos NHDF exibiram uma forma redonda com tamanhos e formas variados. A análise de H & E dos organoides do dia 14 revelou um aumento notável no sinal de eosina, indicando deposição de ECM durante o processo de maturação 3D. Nesse momento, os organoides exibiam camadas fundidas, com áreas contendo células alinhadas. As células estavam frequentemente em grupos; no entanto, eles também foram organizados em fileiras de células em alguns locais. A maioria dos núcleos tinha tamanhos semelhantes e ocasionalmente eram alongados.

Figura 1: Desenho animado do modelo organoide 3D T/L composto por 3 etapas: expansão 2D, estimulação 2D e maturação 3D. Inicialmente, os NHDFs foram pré-expandidos em um frasco T-75 até atingirem 70%-80% de confluência. Posteriormente, os NHDFs foram cultivados usando o meio de baixa glicose Modified Eagles Medium (DMEM) de Dulbecco em uma placa de cultura de células de 10 cm por 5 dias (expansão 2D). As células foram então estimuladas com meio DMEM com alto teor de glicose suplementado com ácido ascórbico por 14 dias de cultivo (estimulação 2D). Em seguida, os NHDF foram destacados da placa aderente de 10 cm, enrolados em um organoide 3D em forma de bastonete, transferidos e fixados em uma placa de cultura de células não aderente de 10 cm preenchida com meio DMEM de alta glicose suplementado com ácido ascórbico e Fator de Crescimento Transformador beta 3 (TGFß3) por 14 dias (maturação 3D). Os organoides 3D formados podem passar por uma avaliação de peso úmido, avaliação histológica, isolamento de RNA e proteína e outras análises (por exemplo, microscopia eletrônica de transmissão, medições biomecânicas) em diferentes momentos, como dias 0, 1 e 14. O desenho animado foi gerado no software BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de contraste de fase de NHDFs durante as etapas de pré-expansão, expansão 2D e estimulação 2D. (A) NHDFs durante a pré-expansão no frasco T-75. (B) NHDFs nos dias 1 e 5 da etapa de expansão 2D em uma placa de cultura de células de 10 cm. (C) NHDFs nos dias 1 e 14 da etapa de estimulação 2D em uma placa de cultura de células de 10 cm. Barras de escala: 200 μm. As imagens foram tiradas com um microscópio invertido equipado com uma câmera de alta resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Morfologia macroscópica dos organoides NHDF 3D. Imagens macroscópicas representativas de organoides NHDF nos dias 0 e 14 da etapa de maturação 3D. Barra de escala: 1 cm. As imagens foram tiradas com uma câmera de celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de peso úmido de organoides NHDF 3D. A medição do peso úmido dos organoides foi no dia 0 e no dia 14, o final do processo de maturação 3D. O gráfico mostra valores médios e desvios-padrão (NHDF n = 3, 3 organoides/doador no dia 0 e 2 organoides/doador no dia 14 devido a 1 organoide/doador retirado para histologia no dia 1), cada ponto representa organoides individuais, enquanto cada forma colorida representa um doador individual diferente. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, e um teste t paramétrico não pareado foi usado. Diferenças estatísticas: **p ≤0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise histológica de organoides NHDF 3D. Imagens representativas de seções coradas com hematoxilina e eosina (H & E) de organoides NHDF durante o processo de maturação 3D nos dias 1 e 14. Imagem da direita - imagens de baixa ampliação, imagem da esquerda - visualização ampliada com indicadores da seguinte forma: setas amarelas - camadas desconectadas; pontas de setas amarelas - núcleos com tamanhos e formas variados; setas pretas - camadas fundidas e deposição de ECM; pontas de setas pretas - fileiras de células, núcleos com tamanho e alongamento semelhantes; estrelas pretas - células em grupos. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

Os resultados demonstrados neste estudo fornecem informações valiosas sobre o estabelecimento e caracterização do modelo organoide 3D NHDF para o estudo de tecidos T/L. O protocolo de 3 etapas levou à formação de organoides 3D semelhantes a bastonetes que exibem características típicas do nicho T / L. Este modelo foi relatado anteriormente em Kroner-Weigl et al. 2023⁷ e demonstrado em grande detalhe aqui.

As imagens de contraste de fase apresentadas na Figura 2 mostraram a progressão da confluência do NHDF e a formação de folhas durante as etapas de expansão e estimulação. O processo de maturação 3D foi realizado rolando manualmente as folhas de células em organoides 3D semelhantes a bastonetes, que foram então cultivados sob tensão estática por 14 dias. Os organoides exibiram uma aparência branca brilhante e densidade aumentada no dia 14, sugerindo contração e reorganização estrutural dentro dos organoides. Isso indicou que o período de maturação é crítico para alcançar uma estrutura mais organizada e que imita o tecido T/L.

Além disso, a análise de peso revelou uma diminuição significativa no peso úmido dos organoides entre os dias 0 e 14, mais uma vez indicando contração significativa e reorganização da ECM dentro dos organoides durante o processo de maturação. É importante ressaltar que as medições de peso úmido podem variar entre os experimentos devido ao manuseio e ao meio residual dentro do organoide ou nos pratos. Além disso, o organoide pode conter mais meio no início porque, como discutido abaixo, no dia 0, as camadas formadas pelo rolamento da folha celular são segregadas e não fundidas. Com o tempo, as camadas se juntaram e se tornaram mais compactas e, assim, o meio pode ser extrudado.

A avaliação morfológica por coloração H&E forneceu informações adicionais sobre as características estruturais dos organoides. No dia 1, os organoides exibiram camadas desconectadas, compostas principalmente de células com núcleos redondos cercados por finas ECM pericelulares. A falta de alinhamento celular paralelo ao eixo da carga de tração sugeriu que é necessária uma maturação adicional para alcançar uma arquitetura celular e ECM mais organizada dos organoides. Apesar da contração e da redução do peso e da dimensão do organoide entre os dias 1 e 14, a coloração H&E mostrou um aumento nas áreas positivas para eosina, sugerindo aumento da deposição de MEC. Além disso, não havia mais camadas visíveis e, ocasionalmente, as células tinham núcleos alongados e eram posicionadas em fileiras de células paralelas. Isso apontou que as células dentro dos organoides sofrem auto-organização, alterando seu próprio arranjo, bem como a deposição, estrutura e alinhamento da MEC, imitando assim o comportamento da formação do tecido T / L nativo.

No geral, essas descobertas destacam o potencial do modelo organoide NHDF como uma ferramenta valiosa para estudar a biologia T / L, tenogênese in vitro e até mesmo para o desenvolvimento de engenharia T / L livre de andaimes. No entanto, existem três etapas críticas para o manuseio bem-sucedido do modelo organoide 3D: 1) A formação de uma folha de células apertada durante o estágio de estimulação 2D do protocolo. Ao usar células primárias, isso depende predominantemente das propriedades das células doadoras; portanto, é importante avaliar vários doadores em paralelo; 2) O rolamento manual da folha de célula. Isso requer rolar rapidamente, mas ao mesmo tempo suavemente, a folha de células usando um raspador de células. Portanto, é aconselhável planejar organoides iniciais para primeiro treinar este procedimento; e 3) A fixação estável dos pinos nas bordas organoides. Essa fixação garante o alongamento axial do organoide e evita deformidades, bem como o colapso em uma estrutura semelhante a um nódulo. Além disso, durante o estágio de maturação 3D, uma vez que os organoides passam pela remodelação do ECM, os pinos podem se soltar repentinamente, portanto, é importante monitorar frequentemente cada organoide e refixar os pinos.

O modelo atual ainda não atingiu o nível de mimetismo in vivo para tecido T/L e abriga uma série de limitações. Por exemplo, requer um grande número de células por organoide, bem como 35 dias para que o procedimento seja concluído, enquanto a maioria dos protocolos de diferenciação, como o modelo de pellet condrogênico 3D, são definidos para 21 dias²². As etapas de lavagem no procedimento do protocolo devem ser realizadas preferencialmente com tampão de lavagem fisiologicamente balanceado, por exemplo, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ou Earles Balanced Salt Solution (EBSS), em vez de PBS, que pode ter consequências metabólicas para células humanas primárias cultivadas in vitro. Em relação ao meio de cultura utilizado nas etapas de estimulação 2D e maturação 3D no organoide, optou-se pela formulação DMEM mais 10% de FBS por ser a base de protocolos de diferenciação amplamente aceitos, bem como com a intenção de padronizar e comparar entre diferentes tipos celulares quanto às suas propriedades organoidogênicas²³. A reprodução do protocolo organoide de 3 etapas em diferentes ambientes laboratoriais pode ser influenciada pelo tipo de célula usada, qualidade e passagem da célula, bem como propriedades celulares dependentes do doador. Variações no equipamento, especialmente na qualidade das placas de cultura de células de 10 cm²⁴ usadas durante o estágio de estimulação 2D, podem afetar a robustez da formação da folha de células. Além disso, devido à contração da ECM ao longo da maturação 3D, a fixação axial dos organoides por meio de pinos pode se soltar; portanto, como mencionado acima, recomenda-se o monitoramento frequente. Testar e selecionar diferentes pinos em termos de diâmetro e resistência também pode reduzir o risco de descolamento do pino²⁵. No entanto, o uso de pinos para alongamento manual não é robusto e é propenso a manipular variabilidade; Portanto, é muito importante desenvolver em pesquisas de acompanhamento um mecanismo de fixação para segurar as bordas do organoide, o que pode resultar não apenas na padronização dessa etapa, mas também pode permitir o alongamento dinâmico dos organoides. Em geral, será de interesse investigar duas formas de modificação do modelo organoide, uma downscaling - para reduzir o número de células por organoide e o tempo do procedimento, tornando-o mais amigável, especialmente para estudos in vitro ; e o segundo upscaling - aumentar as dimensões dos organoides a fim de testar seu comportamento em modelos animais de grande porte como potencial estratégia de substituição de tendões.

O modelo demonstrado aqui pode fornecer uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do tendão, fisiopatologia e talvez reparo e regeneração se os organoides forem combinados com diferentes tipos de células e submetidos a microrrupturas. É importante mencionar que o estudo de Kroner-Weigl et al. 2023⁷ identificou várias limitações em relação ao tipo de célula NHDF, a saber, os organoides formados por NHDFs são maiores e mais celulares do que aqueles derivados de células T/L, dificultando o controle da proliferação e do comportamento celular. Com relação à apoptose celular, o ensaio baseado em desoxinucleotidil transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) terminal não mostrou evidências de células mortas em todo o organoide no dia 14⁷, sugerindo difusão apropriada de nutrientes, resíduos e oxigênio durante a etapa de maturação 3D. Curiosamente, apesar das diferenças morfológicas, a triagem piloto por PCR quantitativo de vários genes relacionados a T / L (incluindo diferentes tipos de colágeno, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), etc.) sugeriu expressão gênica comparável entre NHDF e organoides T / L⁷, um achado que deve ser mais investigado, bem como deve ser validado no nível da proteína. Portanto, para este tipo de célula, é necessária uma otimização adicional para apoiar a diferenciação T / L e pode ser baseada no ajuste do meio usado nas etapas de estimulação 2D e maturação 3D (por exemplo, concentração sérica, fatores de crescimento, vitaminas), estendendo o tempo de maturação ou mesmo submetendo os organoides a alongamento mecânico dinâmico. A evolução do protocolo pode melhorar ainda mais as propriedades composicionais, estruturais e funcionais do organoide, permitindo assim que o modelo imite melhor o nicho de tecido T/L complexo in vivo . Além disso, fontes celulares alternativas podem ser investigadas quanto à sua capacidade de formar organoides T/L e se podem sofrer diferenciação T/L. Yan et al. 2020⁹, empregaram o modelo organoide 3D usando células-tronco / progenitoras de tendões jovens / saudáveis e envelhecidas / degenerativas (Y-TSPCs e A-TSPCs) para investigar o comportamento celular em 3D, bem como se a capacidade de formação de tendões muda com o envelhecimento T / L. Eles relataram que os organoides A-TSPC 3D exibem morfologia de tecido pobre, e as células internas têm uma taxa de proliferação mais baixa, mas maior apoptose paralela a níveis elevados de marcadores relacionados à senescência⁹. Portanto, o modelo organoide 3D T/L é uma plataforma promissora para estudar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos no envelhecimento do tendão e ainda pode ser usado para testar novas terapias farmacológicas para reparo e regeneração do tendão. Em uma abordagem diferente, Chu et al. 2021 implementaram células do folículo dentário (DFCs) no modelo organoide 3D para avaliar sua diferenciação ligamentogênica. Esse tipo de célula formou organoides muito bem organizados, sugerindo as DFCs como uma fonte celular atraente para se diferenciar no tecido do ligamento periodontal (LPD), o que poderia, por sua vez, desenvolver uma estratégia terapêutica promissora para a periodontite⁸.

No futuro, o modelo pode se tornar ainda mais complexo ao incluir diferentes tipos de células (por exemplo, miofibroblastos, macrófagos), o que pode oferecer novos insights sobre comportamentos específicos de células e diafonia celular dentro de organoides e contribuir para uma compreensão mais abrangente da biologia, fisiologia e fisiopatologia T / L ^8,9,16,26.

Os modelos organoides 3D apresentam várias vantagens para aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Eles imitam de perto a composição e organização celular, bem como as interações célula a célula e célula a matriz dos tecidos humanos, oferecendo assim uma plataforma fisiologicamente relevante para estudar os mecanismos da doença e as respostas aos medicamentos²⁷. Os organoides podem ser usados como uma plataforma de triagem de alto rendimento para avaliar a eficácia, mas também os possíveis efeitos colaterais de diferentes medicamentos e fornecer uma alternativa confiável e de baixo custo aos testes em animais. Além disso, permitem comparações diretas entre condições saudáveis e doentes, permitindo a descoberta de alterações moleculares e celulares importantes associadas a diversas patologias, a identificação de biomarcadores para detecção precoce de doenças, bem como a facilitação da compreensão ascendente dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de terapias direcionadas^28,29.

Em conjunto, demonstramos em grande detalhe as etapas do modelo organoide 3D T/L previamente estabelecido que fornece uma plataforma promissora para estudar a biologia do tecido T/L e os processos tenogênicos in vitro de vários tipos de células. Mais implementação, otimização e pesquisa deste modelo são fortemente encorajadas, pois podem levar ao avanço de estratégias de engenharia de T/L sem andaimes, que, por sua vez, podem contribuir para melhorar a terapia T/L.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	A8960
Placa de cultura de células aderente de 10 cm	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha
placa de Petri não aderente de 10 cm	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holanda	4583
Padrão Cryomold	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holanda	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Alemanha	A2211
DMEM meio de alta glicose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemanha	DMEM-HA
DMEM baixa glicose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemanha	DMEM-LPXA
Soro fetal bovino	Anprotec, Bruckberg, Alemanha	AC-SM-0027
Meio de crescimento de fibroblastos 2	PromoCell, Heidelberg, Alemanha	C-23020
H & Kit de coloração E	Abcam	ab245880
Microscópio invertido com câmera de alta resolução	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer com  Axiocam 506
MEM aminoácidos	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemanha	Pinos de metal NEAA-B
	EntoSphinx, Pardubice, República Tcheca	04.31
Fibroblastos dérmicos humanos normais	PromoCell, Heidelberg, Alemanha	C-12302
Paraformaldeído	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	A3813
Penicilina/estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha	15140122
Tampão fosfato salino	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha	P4417
TGFß 3	R& D Systems, Wiesbaden, Alemanha	8420-B3
Tripsina-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Alemanha	TRY-1B