Method Article

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

DOI:

10.3791/66093

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 4Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, 5Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O microambiente da medula óssea consiste em populações celulares distintas, como células estromais mesenquimais, células endoteliais, células osteolinhagens e fibroblastos, que fornecem suporte para células-tronco hematopoéticas (CTHs). Além de suportar as CTHs normais, o microambiente da medula óssea também desempenha um papel no desenvolvimento de doenças de células-tronco hematopoéticas, como síndromes mielodisplásicas (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações associadas à SMD em HSCs levam a um bloqueio na diferenciação e falência progressiva da medula óssea, especialmente em idosos. A SMD pode frequentemente evoluir para LMA resistente à terapia, uma doença caracterizada por um rápido acúmulo de blastos mieloides imaturos. Sabe-se que o microambiente da medula óssea está alterado em pacientes com essas neoplasias mieloides. Aqui, um protocolo abrangente para isolar e caracterizar fenotipicamente células microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda é descrito. Isolar e caracterizar as alterações nas populações de nicho da medula óssea pode ajudar a determinar seu papel na iniciação e progressão da doença e pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas direcionadas a alterações promotoras de câncer nas populações estromais da medula óssea.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O microambiente da medula óssea é constituído por células hematopoéticas, células estromais não hematopoéticas e matrizextracelular1,2. Esse microambiente pode promover a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas, regular a diferenciação de linhagens e fornecer suporte estrutural e mecânico ao tecido ósseo1,2,3,4,5. O nicho estromal inclui células de osteolinhagens, fibroblastos, células nervosas e células endoteliais6, enquanto o nicho hematopoiético é constituídopelas populações linfoide e mielóide1,2,3. Além de suportar CTHs normais, o microambiente da medula óssea também pode desempenhar um papel no desenvolvimento de desordens de células-tronco hematopoéticas, como SMD e LMA7,8,9,10,11. Demonstrou-se que mutações em células de osteolinhagens promovem o desenvolvimento de SMD, LMA e outras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.

As síndromes mielodisplásicas são um grupo de doenças pré-leucêmicas que surgem a partir de mutações em células-tronco hematopoéticas. A SMD está frequentemente associada a um bloqueio na diferenciação das CTH e à produção de células displásicas, o que muitas vezes pode levar à falência da medula óssea. A SMD é a neoplasia mieloide mais comumente diagnosticada nos Estados Unidos e está associada a uma taxa de sobrevida de 3 anos de 35%-45%15. A SMD está frequentemente associada a um alto risco de transformação para leucemia mieloide aguda. Isso pode ser uma complicação fatal, já que a LMA derivada da SMD é resistente à maioria das terapias e tem probabilidade de recidiva. A LMA que surge de novo devido a translocações ou mutações no tronco hematopoético e progenitores também é frequentemente resistente à quimioterapia padrão16,17. Como a SMD e a LMA são principalmente doenças de idosos, sendo a maioria diagnosticada acima de 60 anos, a maioria dos pacientes não é elegível para transplante curativo de medula óssea. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Uma vez que o microambiente da medula óssea pode fornecer suporte para célulasmalignas14, a definição de alterações no nicho medular com a progressão da doença pode levar à identificação de novas terapêuticas que visem inibir o remodelamento do nicho tumoral. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Para tanto, é fundamental identificar e caracterizar alterações nas populações de células estromais da medula óssea que possam dar suporte às células malignas.

Vários modelos murinos de LMA e SMD foram gerados e podem ser usados para estudar alterações no microambiente da medula óssea durante o início e progressão da doença 6,1,19,20,21,22. Neste estudo, são descritos protocolos para identificar alterações nas populações de células estromais da medula óssea utilizando modelos murinos deLMA induzida retroviricamente6,20, bem como o modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) comercialmente disponível de MDS de alto risco para transformação de LMA19. Camundongos transplantados com células de novo da LMA sucumbem à doença em 20-30 dias6. Os camundongos NHD13 desenvolvem citopenias e displasia da medula óssea em torno de 15-20 semanas, que eventualmente se transforma em LMA, e quase 75% dos camundongos sucumbem à doença em torno de 32 semanas. Para analisar as populações do microambiente da medula óssea modelo murino, os ossos são colhidos, a medula óssea e as espículas ósseas são digeridas usando digestão enzimática, e as células são então enriquecidas para populações não-hematopoiéticas CD45-/Ter119- por classificação magnética. Embora análises semelhantes tenham sido descritas anteriormente 11,13,22,23,24,25, elas frequentemente se concentram na medula óssea ou no osso e não incorporam células de ambas as fontes em suas análises. A caracterização combinada dessas populações, em conjunto com análises de expressão gênica, pode fornecer uma compreensão abrangente de como o microambiente hematopoético celular fornece suporte para o início e progressão da doença (Figura 1). Embora o protocolo descrito abaixo se concentre no modelo de LMA induzida retroviricamente e em um modelo genético de SMD, essas estratégias podem ser facilmente adaptadas para estudar alterações no nicho da medula óssea de qualquer modelo murino de interesse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos foram criados e mantidos nas instalações de cuidados com animais da Universidade de Rochester. Para modelar a SMD de alto risco, o modelo murino NHD13 comercialmente disponível19 é empregado. Neste modelo, as células estromais da medula óssea são analisadas em camundongos NHD13 fêmeas com 8 semanas de idade, antes do início da doença. De novo A LMA é gerada conforme previamente descrito 6,11,20. Os oncogenes usados para induzir LMA, como MLL-AF9 e NRas, são marcados com GFP ou YFP, permitindo a análise das populações não leucêmicas de GFP- medula óssea usando citometria de fluxo. Em resumo, camundongos fêmeas C57BL/6J de 10 semanas de idade são transplantados com células murinas GFP/YFP+ AML, e a medula óssea é colhida 2 semanas após o transplante. Enquanto camundongos fêmeas são usados neste estudo para fins de demonstração, este protocolo pode ser conduzido com camundongos machos ou fêmeas. Também pode ser realizado usando um fêmur ou todos os ossos longos.

1. Colheita de medula óssea

NOTA: Para detalhes sobre o protocolo de dissecção dos animais, consulte Amend et al.26.

  1. Limpar a argamassa e o pilão com etanol 70%, enxaguar com tampão FACS resfriado (Tabela 1) e colocá-los no gelo para esfriar antes de iniciar a colheita. Além disso, coloque o tampão MACs (Tabela 1) na bancada para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.
  2. Eutanasiar o animal seguindo as orientações e protocolos institucionais de cuidados e uso dos animais.
  3. Na bancada, borrife bem o rato com etanol a 70% até molhar o pelo. Usando pinça e tesoura curva, levante a pele sobre o abdômen e faça duas incisões de aproximadamente 0,5 mm de comprimento em ambos os lados do mouse, lateralmente do abdômen. Em seguida, faça uma incisão de 0,5 mm distal ao abdome. Puxe para baixo para remover a pele e o pelo das pernas do rato.
  4. Coloque uma tesoura perpendicular à pelve, pressione para baixo enquanto puxa o fêmur com pinças. A cabeça femoral deve se desprender da pelve. Separe o fêmur e a tíbia na articulação patelofemoral. Coloque os ossos em tampão FACS em uma placa de 6 poços sobre gelo.
  5. Remova o tecido dos ossos usando tecido de nível laboratorial e coloque os ossos limpos em uma nova placa de 6 poços com tampão FACS fresco no gelo.
  6. Coloque todos os ossos na argamassa com 2-5 mL de tampão FACS para que todos os ossos fiquem imersos no tampão (ajuste o volume do tampão com base em quantos ossos você está processando). Esmague e triture os ossos usando o pilão em movimento circular até que o tecido da medula óssea seja liberado.
  7. Com uma seringa de 3 mL, homogeneizar a medula óssea puxando para cima e lavando o líquido da argamassa.
  8. Usando uma seringa de 3 mL, puxe o líquido da argamassa e filtre-o através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar os pedaços de osso/tecido do filtro de volta para a argamassa com tampão FACS e retornar ao passo 1.7 para homogeneizar e coar uma segunda vez. Esta constitui a fração da medula óssea.
  9. Enxaguar os pedaços ósseos restantes (espículas) de volta na argamassa com tampão FACS e lavá-los em um tubo de 15 mL usando tampão FACS para garantir o máximo rendimento celular. Esta é a fração das espículas ósseas.

2. Digestão da medula óssea

  1. Centrifugar a medula óssea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar e descartar o sobrenadante.
  2. Ressuspender a medula óssea em 2 mL da mistura de digestão da medula óssea (Tabela 1) e transferi-la para um tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min num rotador.
  3. Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.
  4. Pellet a mistura a 400 x g durante 7 min a 4 °C.
  5. Ressuspender a pastilha de medula óssea em 1 mL de tampão de lise eritrocitária (ver Tabela de Materiais). Incubar por 4 min no gelo.
  6. Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a lise. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.
  7. Pellet a mistura a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão FACS.

3. Digestão das espículas ósseas

  1. Vórtice as espículas ósseas a partir do passo 1.9 e deixe-as assentar. Decantar o sobrenadante e reter o osso na parte inferior.
  2. Ressuspender as espículas ósseas em 1 mL da mistura de digestão da espícula óssea (Tabela 1).
  3. Colocar os tubos num rotador de tubo durante 60 minutos a 37 °C.
  4. Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para o tubo de 50 mL contendo medula óssea lisada e digerida por hemácias.

4. Coloração

  1. Misture suavemente as espículas ósseas e a suspensão de células da medula óssea.
  2. Utilizar 10 μL da suspensão celular para contar o número de células vivas em um hemocitômetro utilizando coloração à base de azul de Tripano 0,4%, conforme descrito em protocolos publicados27. Coletar 50.000 células para um controle sem manchas da suspensão celular.
  3. Centrifugar as células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o em 100 μL de tampão FACS.
    NOTA: Os anticorpos podem ser titulados para determinar a diluição ideal. A seleção de anticorpos (epítopos e fluorocromos) pode ser personalizada.
  4. Para coloração com anticorpos para depleção magnética, adicionar FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) e Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).
  5. Incubar no gelo por 20 min. Lavar com tampão FACS, remover 50.000 células (~50 μL) para o controle corado com APC, centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e ressuspender em 100 μL de tampão FACS.
  6. Para coloração da suspensão celular com microesferas para depleção magnética, adicionar mIgG (8 μL por 25 x 106 células) e microesferas Anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).
  7. Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 10 ml de tampão FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.

5. Depleção da amostra por triagem magnética

NOTA: Esta etapa é realizada usando um separador magnético manual disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Esta etapa também pode ser executada com um separador automatizado (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Preparar a coluna DL lavando-a com 2 mL de tampão MACs (Tabela 1). Descarte o efluente e troque o tubo coletor.
  2. Ressuspenda até 1 x 108 células em tampão MACs e filtre-as através de um tubo de ensaio de 5 mL com uma tampa de filtro de células de 35 μm.
  3. Coloque a coluna LD no suporte do separador magnético. Posicionar um tubo de ensaio de 5 ml abaixo da coluna para recolher o eluato.
  4. Adicione a suspensão da célula à coluna LD preparada. Permitir que a fração negativa flua para o tubo de coleta. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de tampão MACs, coletando o eluato no mesmo tubo. Esta é a fração negativa usada na etapa 5.6 abaixo.
  5. Retire a coluna LD do suporte do separador magnético e coloque-a num novo tubo de ensaio de 5 ml. Use uma pipeta para distribuir 3 mL de tampão na coluna para liberar as células que foram marcadas positivamente, usando o êmbolo de coluna.
  6. Centrifugar as fracções negativa e positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspendê-los em 100 μL de tampão FACS.
  7. Contar 10 μL das frações negativa e positiva com 0,4% de azul de Tripano. Os volumes para a coloração do painel endotelial abaixo serão baseados nesta contagem celular.
  8. Use 50.000 células vivas da fração positiva para controles de contagem de citometria de fluxo.

6. Osteoanálise/coloração do painel endotelial

NOTA: A compensação deve ser realizada seguindo os protocolos padrão de citometria de fluxo, incluindo todos os controles apropriados de coloração e limitação.

  1. Para coloração da fração negativa CD45/Ter119 (1 μL de cada anticorpo por 1 x 106 células), adicionar CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (ver Tabela de Materiais).
  2. Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 2 ml de tampão FACS e, em seguida, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  3. Adicionar 1 ml de tampão FACS e uma diluição de 1:1000 de IP para coloração viva/morta e, em seguida, filtrar a amostra através de um tubo de ensaio de 5 ml com uma tampa de filtro de células de 35 μm.
  4. Analise as células em um citômetro de fluxo multicolorido.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo para análise de populações microambientais da medula óssea, como células do estroma endotelial e mesenquimal, a partir de modelos murinos de SMD e leucemia (Figura 1). A Figura 2 ilustra a estratégia de gating para detecção das populações de interesse, iniciando-se com a seleção de células (P1) na fração digerida e CD45/Ter119 depletada através do perfil de dispersão anterior e lateral. Exemplos de ag...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelos de leucemia murina têm sido extensivamente utilizados para identificar sinais intrínsecos e de nicho celular que promovem progressão agressiva da leucemia mieloide 6,19,21. Aqui, um protocolo abrangente baseado em citometria de fluxo para definir a composição celular do microambiente da medula óssea em modelos murinos de SMD e LMA é apresentado.

Antes de adquirir dados de citometria de fluxo d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo da URMC. Este trabalho foi apoiado pela American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award e NIH grants R01DK133131 and R01CA266617 concedido a J.B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pontas de pipeta de 1 mLGenesee Scientific 24-165RL
1.7 mLAVANTL211511-CS
10 µ L Pontas de pipetaGenesee Scientific 24-140RL
10 mL Pipetas serológicas estéreis embaladas individualmenteGlobe scientific1760
1000 mL Balão de filtração a vácuoNEST344021
Tubo de centrífuga de 15 mLVWR10026-076
Pipeta de aspiração de 2 mLNEST325011
200 µ L Pontas de pipetaGenesee Scientific 24-150-RL
25 mL Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas IndividualmenteGlobe scientific1780
Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas Individualmente 5 mLGlobe scientific1740
Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL  Tubo de Fundo RedondoFalcon352054
5 mL de Poliestireno com Tampa de Filtro de Células 12 x 75 mm estiloFalcon
Tubo de Centrífuga de 50 mLNEST602052
6 Poços, Fundo Plano com Tampa de Baixa Evaporação Falcon353046
Absorventes com Barreira à Prova d'ÁguaVWR56616-031
APC MicroBeadsMiltenyi 130-090-855
autoMACS Pro SeparadorMiltenyi Biotec GmBH4425745
BD Pharmingen Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences5531410,5 mg/mL 
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA790666.000 g/mol
Violeta brilhante 421 anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo (D7)Invitrogen404-59810.2 mg/mL
C57BL/6J CamundongosJackson Laboratory 664
Tanque de Gás de Dióxido de CarbonoAirgasCD50
CD31 (PECAM-1) Anticorpo Monoclonal (390), PE-Cyanine7Invitrogen25-0311-820,2 mg/mL
CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11), APCInvitrogen17-0451-820,2 mg/mL
Cell Strainer 70 µ m Nylon Falcon352350
Cole-Parmer Essentials Almofariz e Pilão; Ágata, 125 mLCole-ParmerEW-63100-62
Colgenase de Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138-500MG
Colgenase Tipo ISTEMCELL7415
Corning Mini CentrífugaCORNING6770
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning4099
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovinoSigma-AldrichD4513
Dispase II, póGibco117105041
DPBS 10xgibco14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis BufferInvitrogen00-4333-57
Etanol absoluto, KOPTEC, atende às especificações analíticas da BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)VWR89125-174
Tesoura fina - afiadaFerramentas de Ciência Fina14061-10
Foundation B Fetal Soro BovinoGeminiBio900-208
Gilson  Kits Iniciais de Pipeta PIPETMAN LFisherScientific 
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10xgibco14185-052
HemocitômetroFisher02-671-10
Incubadora BINDERC150-UL
KimwipesKIMTECHK222101
LABGARD Classe II, Tipo A2 Gabinete de Segurança BiológicaNuaireNU-425-400
LD ColunasMiltenyi Biotec GmBH130-042-901
LSE Misturador de VórticeCORNING6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1Becton, Dickinson and Company647800L6
MACS MULTI STAND Rotador de Tubo MACsmix Miltenyi Biotec GmBH130-042-303
 Miltenyi Biotec GmBH130-090-753
mIgGMillipore-Sigma18765-10mg2 mg/mL 
Nup98-HoxD13 (NHD13) LaboratórioJackson de Camundongos 
PE anti-camundongo CD51 Anticorpo (RMV-7)Biolegend1041060,2 mg/mL
PE/Cianina5 anti-camundongo CD140a Anticorpo (RUO)Biolegend1359200,2 mg/mL
Penicilina-Estreptomicina Gibco15140122Seringa de 3 mL Plastipak 10.000 U/mL
Becton, Dickinson and Company309657
Propidium Iodide - Solução de 1,0 mg/mL em ÁguaThermoFisher ScientificP3566
QuadroMACS  Separador Centrífuga Miltenyi Biotec GmBH130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus SeriesThermo Scientific 
TER-119 Anticorpo Monoclonal (TER-119), APCInvitrogen17-5921-820,2 mg/mL
Solução Azul de Tripano 0,4%Gibco15-250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0 Invitrogen15575-038
Tubos de Microcentrífuga 352235F167370G01050575009521

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  2. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
  5. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  6. Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
  7. Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
  8. Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
  9. Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
  10. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  11. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  12. Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  13. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  14. Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).
  15. Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
  16. Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
  17. Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
  18. Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
  19. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  20. Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
  21. Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
  22. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  23. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
  24. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  25. Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
  26. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936(2016).
  27. JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
  28. Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662(2016).
  29. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449(2018).
  30. Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
  31. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
  32. Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow MicroenvironmentMyelodysplastic SyndromeAcute Myeloid LeukemiaMesenchymal Stromal CellsFlow CytometryMagnetic SeparationEndothelial CellsOsteolineage CellsHematopoietic Stem CellsCell Population Isolation

Related Articles