Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Summary

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Abstract

O microambiente da medula óssea consiste em populações celulares distintas, como células estromais mesenquimais, células endoteliais, células osteolinhagens e fibroblastos, que fornecem suporte para células-tronco hematopoéticas (CTHs). Além de suportar as CTHs normais, o microambiente da medula óssea também desempenha um papel no desenvolvimento de doenças de células-tronco hematopoéticas, como síndromes mielodisplásicas (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações associadas à SMD em HSCs levam a um bloqueio na diferenciação e falência progressiva da medula óssea, especialmente em idosos. A SMD pode frequentemente evoluir para LMA resistente à terapia, uma doença caracterizada por um rápido acúmulo de blastos mieloides imaturos. Sabe-se que o microambiente da medula óssea está alterado em pacientes com essas neoplasias mieloides. Aqui, um protocolo abrangente para isolar e caracterizar fenotipicamente células microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda é descrito. Isolar e caracterizar as alterações nas populações de nicho da medula óssea pode ajudar a determinar seu papel na iniciação e progressão da doença e pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas direcionadas a alterações promotoras de câncer nas populações estromais da medula óssea.

Introduction

O microambiente da medula óssea é constituído por células hematopoéticas, células estromais não hematopoéticas e matriz^{extracelular1,2}. Esse microambiente pode promover a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas, regular a diferenciação de linhagens e fornecer suporte estrutural e mecânico ao tecido ósseo1,2,3,4,5. O nicho estromal inclui células de osteolinhagens, fibroblastos, células nervosas e células endoteliais6, enquanto o nicho hemat....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos foram criados e mantidos nas instalações de cuidados com animais da Universidade de Rochester. Para modelar a SMD de alto risco, o modelo murino NHD13 comercialmente disponível¹⁹ é empregado. Neste modelo, as células estromais da medula óssea são analisadas em camundongos NHD13 fêmeas com 8 semanas de idade, antes do início da doença. De novo A LMA é gerada conforme previamente descrito ^6,11,20

Results

Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo para análise de populações microambientais da medula óssea, como células do estroma endotelial e mesenquimal, a partir de modelos murinos de SMD e leucemia (Figura 1). A Figura 2 ilustra a estratégia de gating para detecção das populações de interesse, iniciando-se com a seleção de células (P1) na fração digerida e CD45/Ter119 depletada através do perfil de dispersão anterior e lateral. Exemplos de ag.......

Discussion

Modelos de leucemia murina têm sido extensivamente utilizados para identificar sinais intrínsecos e de nicho celular que promovem progressão agressiva da leucemia mieloide ^6,19,21. Aqui, um protocolo abrangente baseado em citometria de fluxo para definir a composição celular do microambiente da medula óssea em modelos murinos de SMD e LMA é apresentado.

Antes de adquirir dados de citometria de fluxo d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pontas de pipeta de 1 mL	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL	AVANT	L211511-CS
10 µ L Pontas de pipeta	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL Pipetas serológicas estéreis embaladas individualmente	Globe scientific	1760
1000 mL Balão de filtração a vácuo	NEST	344021
Tubo de centrífuga de 15 mL	VWR	10026-076
Pipeta de aspiração de 2 mL	NEST	325011
200 µ L Pontas de pipeta	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas Individualmente	Globe scientific	1780
Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas Individualmente 5 mL	Globe scientific	1740
Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL  Tubo de Fundo Redondo	Falcon	352054
5 mL de Poliestireno com Tampa de Filtro de Células 12 x 75 mm estilo	Falcon
Tubo de Centrífuga de 50 mL	NEST	602052
6 Poços, Fundo Plano com Tampa de Baixa Evaporação Falcon		353046
Absorventes com Barreira à Prova d'Água	VWR	56616-031
APC MicroBeads	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro Separador	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141	0,5 mg/mL
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Violeta brilhante 421 anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J Camundongos	Jackson Laboratory	664
Tanque de Gás de Dióxido de Carbono	Airgas	CD50
CD31 (PECAM-1) Anticorpo Monoclonal (390), PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0,2 mg/mL
CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11), APC	Invitrogen	17-0451-82	0,2 mg/mL
Cell Strainer 70 µ m Nylon	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials Almofariz e Pilão; Ágata, 125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
Colgenase de Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
Colgenase Tipo I	STEMCELL	7415
Corning Mini Centrífuga	CORNING	6770
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller	Corning	4099
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II, pó	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333-57
Etanol absoluto, KOPTEC, atende às especificações analíticas da BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)	VWR	89125-174
Tesoura fina - afiada	Ferramentas de Ciência Fina	14061-10
Foundation B Fetal Soro Bovino	GeminiBio	900-208
Gilson  Kits Iniciais de Pipeta PIPETMAN L	FisherScientific
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x	gibco	14185-052
Hemocitômetro	Fisher	02-671-10
Incubadora	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD Classe II, Tipo A2 Gabinete de Segurança Biológica	Nuaire	NU-425-400
LD Colunas	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE Misturador de Vórtice	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS MULTI STAND	Rotador de Tubo MACsmix Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) Laboratório	Jackson de Camundongos
PE anti-camundongo CD51 Anticorpo (RMV-7)	Biolegend	104106	0,2 mg/mL
PE/Cianina5 anti-camundongo CD140a Anticorpo (RUO)	Biolegend	135920	0,2 mg/mL
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	Seringa de 3 mL Plastipak 10.000 U/mL
	Becton, Dickinson and Company	309657
Propidium Iodide - Solução de 1,0 mg/mL em Água	ThermoFisher Scientific	P3566
QuadroMACS  Separador	Centrífuga Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus Series	Thermo Scientific
TER-119 Anticorpo Monoclonal (TER-119), APC	Invitrogen	17-5921-82	0,2 mg/mL
Solução Azul de Tripano 0,4%	Gibco	15-250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-038