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Imunoensaio Portátil Baseado em Papel Combinado com Aplicativo para Smartphone para Detecção Colorimétrica e Quantitativa do Antígeno NS1 da Dengue

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DOI:

10.3791/66130

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26 de janeiro de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

Neste artigo

Resumo

Atendendo às necessidades urgentes de diagnóstico da dengue, apresentamos aqui um dispositivo analítico baseado em papel para dengue NS1 integrado ao aplicativo para smartphone (DEN-NS1-PAD) para quantificar a concentração do antígeno NS1 da dengue em amostras clínicas de soro/sangue. Essa inovação aprimora o manejo da dengue, auxiliando a tomada de decisões clínicas em vários ambientes de saúde, mesmo aqueles com recursos limitados.

Resumo

A infecção pelo vírus da dengue (DENV), que é transmitido por mosquitos Aedes , é um grande problema de saúde pública em países tropicais e subtropicais. Com uma incidência anual de aproximadamente 10 milhões de casos e 20.000-25.000 mortes, particularmente entre crianças, há uma necessidade urgente de ferramentas práticas de diagnóstico. A presença da proteína não-estrutural 1 (NS1) da dengue durante a infecção precoce tem sido associada à liberação de citocinas, extravasamento vascular e disfunção endotelial, tornando-a um marcador potencial para dengue grave.

Imunoensaios baseados em papel, como ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (PADs), ganharam popularidade como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo, especificidade e facilidade de interpretação. No entanto, os imunoensaios convencionais baseados em papel para detecção de NS1 da dengue normalmente dependem de inspeção visual, produzindo apenas resultados qualitativos. Para abordar essa limitação e aumentar a sensibilidade, propusemos um ensaio de detecção de dengue NS1 altamente portátil em um Dispositivo Analítico Baseado em Papel (PAD), ou seja, DEN-NS1-PAD, que integra um aplicativo de smartphone como um leitor colorimétrico e quantitativo. O sistema de desenvolvimento permite a quantificação direta das concentrações de NS1 em amostras clínicas.

Amostras de soro e sangue obtidas dos pacientes foram utilizadas para demonstrar o desempenho do protótipo do sistema. Os resultados foram obtidos imediatamente e podem ser empregados para avaliação clínica, tanto em instalações de saúde bem equipadas quanto em ambientes com recursos limitados. Esta combinação inovadora de um imunoensaio baseado em papel com um aplicativo de smartphone oferece uma abordagem promissora para detecção e quantificação aprimoradas do antígeno NS1 da dengue. Ao aumentar a sensibilidade além das capacidades a olho nu, esse sistema tem grande potencial para melhorar a tomada de decisão clínica no manejo da dengue, particularmente em áreas remotas ou carentes.

Introdução

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é a doença transmitida por mosquitos de mais rápida propagação1, e mais de 390 milhões de pessoas estão infectadas com 96 milhões de infecções sintomáticas, 2 milhões de casos de doença grave e mais de 25.000 mortes por ano ocorrem no mundo 1,2. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 3,9 bilhões de pessoas estejam em risco de dengue; ~70% vivem em países da Ásia-Pacífico e principalmente no Sudeste Asiático3. Em 2019, o número de casos de dengue relatados à OMS foi de 4,2 milhões, e a Tailândia contribuiu com pelo menos 136.000 casos de dengue e 144 casos de morte por infecção por dengue4. O surto de dengue na Tailândia ocorre durante a estação chuvosa, de abril a dezembro, em áreas urbanas e rurais, especialmente na área nordeste.

As infecções por DENV têm diferentes manifestações clínicas, desde sintomas subclínicos, dengue leve (FD) até dengue hemorrágica grave (FHD). A principal característica da condição grave de FHD é o aumento da permeabilidade vascular, seguido de choque e disfunção orgânica1. A compreensão da via molecular que pode causar o extravasamento vascular é muito importante no desenvolvimento de tratamentos eficazes para a dengue. A proteína não-estrutural 1 (NS1) do dengue é uma glicoproteína secretada durante a infecção viral precoce 5,6 e funciona como cofator para a replicação do RNA viral7. A NS1 pode desencadear a liberação de citocinas e contribuir para o extravasamento vascular ao se ligar ao receptor toll-like 4 (TLR4) e ao glicocálice endotelial 8,9. Pesquisas in vitro mostraram que a NS1 interage com células endoteliais e induz apoptose. Essa condição pode contribuir para disfunção endotelial e extravasamento vascular10. Os níveis séricos do antígeno NS1, correlacionados com os níveis séricos de Interleucina (IL)-10, estavam aumentados significativamente em pacientes com doença clínica grave11. A NS1 do dengue também contribui para a patogênese da doença ao induzir IL-10 e suprimir as respostas específicas de células T DENV12,13. Além disso, a proteína NS1 da dengue foi relacionada à doença clínica grave, e a concentração de NS1 > 600 ng mL-1 nos primeiros 3 dias de doença foi associada ao desenvolvimento de FHD14.

A persistência do antígeno NS1 da dengue em pacientes com FHD poderia ser utilizada como marcador de denguegrave6. Existem vários métodos para detectar a NS1 em amostras clínicas, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o testerápido15. O padrão-ouro para medir a concentração de proteínas NS1 em um ambiente clínico é o método ELISA. No entanto, o método ELISA é caro e requer pessoal qualificado e instalações laboratoriais16. Portanto, o desenvolvimento de tecnologia para detecção e quantificação de proteínas NS1 no teste point-of-care (POCT) ainda está em andamento. Na última década, imunoensaios baseados em papel, como os ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (μPADs), tornaram-se populares como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo e especificidade 17,18,19. Em um imunoensaio baseado em papel, vários marcadores têm sido usados para gerar sinais, como nanopartículas de ouro (AuNPs)20, nanopartículas magnéticas21,22, pontos quânticos23 e materiais de fluorescência24,25. AuNPs são os rótulos mais comuns usados em imunoensaios baseados em papel devido ao seu custo barato de produção, facilidade de fabricação, estabilidade e leitura simples. Atualmente, os ensaios de fluxo lateral (AFLs) para a NS1 da dengue são notoriamente utilizados no cenário clínico26,27. No entanto, a detecção convencional de rótulos de LFA comumente usa o olho nu e fornece apenas resultados qualitativos.

Na última década, mais de 5 bilhões de smartphones foram amplamente utilizados globalmente, e há potencial para o desenvolvimento de detecção portátil28,29. Os smartphones possuem capacidades multifuncionais, como sensores físicos integrados, processadores multi-core, câmeras digitais, portas USB, portas de áudio, wireless e software aplicativo, tornando-os adequados para uso em diversas plataformas de biossensores30. Além disso, as tecnologias sem fio permitem que os dados sejam enviados rapidamente e podem ser usados para monitoramento em tempo real e no local31. combinaram o imunoensaio baseado em papel e smartphones para desenvolver uma plataforma POCT portátil, livre de equipamentos, rápida, de baixo custo e fácil de usar para malária, tuberculose e HIV32. relataram um ensaio de fluxo lateral combinado com uma câmera de smartphone para detectar quantitativamente a atividade da fosfatase alcalina no leite33. Hou e col. também desenvolveram um sistema de imagem de dupla modalidade baseado em smartphone para sinais quantitativos de cor ou fluorescência no ensaio de fluxo lateral34. Além disso, usar o smartphone como leitor colorimétrico e quantitativo pode melhorar a sensibilidade, enquanto o olho nu não pode relatar com confiança a presença do alvo35.

Apresentando um avanço no diagnóstico da dengue, o DEN-NS1-PAD 36,37,38 (doravante denominado dispositivo) oferece uma solução portátil e eficiente. Usando a tecnologia à base de papel microfluídico impresso em cera, este dispositivo quantifica a NS1 com alta sensibilidade e especificidade através do processamento de imagens. Para melhorar ainda mais sua utilidade, desenvolvemos um aplicativo de smartphone amigável para leitura colorimétrica e quantitativa. A validação clínica usando amostras de pacientes de hospitais tailandeses ressalta seu impacto imediato na avaliação do paciente em tempo real. Nossa inovação marca um avanço fundamental no gerenciamento simplificado da dengue no ponto de atendimento, prometendo revolucionar os diagnósticos em cenários de saúde com recursos limitados.

Protocolo

O Comitê de Ética do Comitê de Revisão Institucional, Departamento Médico do Exército Real Tailandês, Hospital Phramongkutklao, Bangkok, Tailândia (IRBRTA 1218/2562) concedeu aprovação. Na realização deste estudo, foram cumpridas todas as normas éticas necessárias.

1. Fabricação do dispositivo de imunoensaio baseado em papel

NOTA: O dispositivo de imunoensaio em papel foi fabricado seguindo métodos previamente estabelecidos36,37, e o pedido de patente tailandês nº 19010081638.

  1. Projeto e desenho de padrões: Projetar o dispositivo analítico de papel (Figura 1A,B) com 18 padrões de cera PAD em um computador.
    NOTA: O design é específico e destina-se a papel de tamanho A5. O número de PADs está relacionado ao tamanho do papel, conforme a necessidade do usuário.
  2. Imprima o padrão projetado no papel celulose usando uma impressora de cera (Tabela de Materiais).
  3. Derreta o papel impresso com cera num forno de laboratório durante 75 s a 150 °C. Posteriormente, guarde-o em uma caixa de sílica até que seja necessário para as etapas subsequentes.
  4. Aplicar 0,5 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,025% nas áreas de teste e controle. Incubar à temperatura ambiente (TR) durante 2 min numa caixa de sílica e, em seguida, aquecer no forno a 65 °C durante 5 min.
  5. Aplicar 0,5 μL de 1 μg μL-1 de anticorpo IgG de cabra anti-rato na área de controlo e 0,5 μL de 1 μg μL-1 do anticorpo de captura na área de ensaio. Deixe as gotas secar em uma caixa de sílica gel em RT por 30 min.
  6. Aplicar 2 μL do tampão de bloqueio na área da amostra, 3 μL na área conjugada e 2 μL na área de detecção. Deixe as gotas secar em RT em uma caixa de sílica gel por 30 min.
  7. Aplicar 2 μL de solução do complexo nanopartícula-anticorpo de ouro (AuNPs-Ab) na área conjugada e deixar secar em uma caixa de sílica gel em RT por 30 min.

2. Montagem do Imunoensaio em papel

  1. Remova cuidadosamente a película protetora no verso da placa de suporte de plástico adesivo para expor o adesivo.
  2. Alinhe o papel celulose tratado com o cartão de suporte de plástico adesivo e pressione firmemente as duas camadas juntas.
    OBS: Evite tocar no campo hidrofílico para minimizar o risco de contaminação ou danos ao aparelho.
  3. Aplique um filme plástico para revestir o papel e pressione-os.
  4. Corte a peça desejada de dispositivos usando tesouras de folhas de dispositivos completamente montados.
  5. Os DEN-NS1-PADs (Figura 1C) agora estão prontos para uso. Para estabilidade a longo prazo, armazene-os a 4 °C.

3. Preparação do conjugado AuNPs-Ab

NOTA: A AuNPs-Ab foi preparada conforme descrito anteriormente por Prabowo et al.36.

  1. Combinar 10 μL de 1 mg mL−1 de anticorpo anti-NS1 em PBS, 1 mL de coloide de AuNPs de 40 nm e 0,1 mL de tampão borato 0,1 M (pH 8,5).
  2. Girar a mistura a 50 rpm por 60 min e incubar em TR.
  3. Aplicar 0,1 mL de 10 mg mL−1 de BSA em BBS, girar a 50 rpm e incubar em RT por 15 min.
  4. Centrifugar a solução a 20,187 × g e 4 °C durante 30 min.
  5. Pipetar cuidadosamente e separar o sobrenadante dos AuNPs-Ab precipitados.
  6. Ressuspender o AuNPs-Ab em 500 μL de BBS e dispersá-lo usando sonicação.
  7. Repetir a centrifugação a 20,187 × g e 4 °C durante 30 minutos.
    NOTA: Repita os processos de dispersão e centrifugação 3x.
  8. Adicionar 50 μL do tampão conjugado à suspensão, deixando-a pronta para aplicação na área conjugada.

4. Desenvolvimento de aplicativos móveis

  1. Processamento de imagens e desenvolvimento de machine learning
    1. Reúna um conjunto de dados para um modelo de imagem supervisionado coletando mais de 900 imagens de foco automático de DEN-NS1-PADs, capturando várias condições, como diferentes concentrações, marcas de câmeras (12-13 megapixels), rotações (90° e 180°) e configurações de iluminação. Procure 30 imagens em cada condição específica.
    2. Rotule a verdade fundamental identificando e anotando duas regiões de interesse como as áreas de teste e controle dentro das imagens coletadas para aprendizado supervisionado.
    3. Crie um algoritmo para identificar a faixa de fundo. Localize a linha central entre as regiões de teste e controle, calcule seu ponto médio e estabeleça uma região quadrada proporcional ao tamanho médio das duas regiões principais, mantendo a mesma orientação rotacional.
    4. Crie um modelo de segmentação de imagem usando o conjunto de dados e os rótulos verdade de base das etapas 4.1.1 e 4.1.2 para treinar um modelo de segmentação de imagem para identificar as regiões de interesse.
  2. Algoritmo de aplicação
    1. Aplique o modelo de segmentação de imagem treinado a novas imagens para localizar automaticamente as regiões de teste, controle e plano de fundo.
    2. Use técnicas básicas de processamento de imagens para obter um único valor de intensidade para cada uma das três regiões de interesse (teste, controle e fundo).
    3. Transforme a imagem em uma representação de matriz 3D (canal y, x) para acessar valores de pixel.
    4. Converta a imagem em escala de cinza calculando a média dos valores RGB e aplique a inversão com a fórmula (255-x).
    5. Normalize os valores da área de teste e controle subtraindo o valor da área de fundo.
    6. Use a curva de calibração preestabelecida para calcular a concentração de NS1.
    7. Classificar os resultados em positivos ou negativos com base em um valor de corte de 0,1103 derivado das intensidades normalizadas da escala de cinza37.

5. Curva de calibração e sensibilidades

  1. Preparar amostra NS1 em soro humano para calibração com concentrações de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 μg mL-1.
  2. Lançar 50 μL de cada concentração sobre a área da amostra e efectuar medições em triplicata.
  3. Deixe as amostras entrarem completamente no dispositivo, o que pode levar de 20 a 30 minutos para obter resultados.
  4. Capture imagens do dispositivo usando uma câmera digital ou smartphone após 5 min de incubação.
  5. Analise as áreas de teste e controle usando o ImageJ e um aplicativo móvel personalizado.
  6. Construa a curva de calibração com base nos dados do ImageJ e do aplicativo móvel.
  7. Calcule o limite de branco (LOB), o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) usando as equações (1-3) abaixo:
    LOB = Média dos dados em branco + 1:645* ð (desvio padrão dos dados em branco) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (desvio padrão dos dados de concentração mais baixa) (2)
    LOQ = Média dos dados em branco + 10*ð (desvio padrão dos dados em branco) (3)

6. Realização de um imunoensaio em papel com amostras clínicas

  1. Coletar e processar 300 μL de sangue periférico de 30 pacientes no primeiro dia de internação em tubos de EDTA de topo roxo, seguindo boas práticas clínicas.
  2. Centrifugar o sangue a 2.884 × g e 4 °C durante 20 minutos.
  3. Transfira o componente líquido (plasma) para um tubo de polipropileno limpo usando uma pipeta.
  4. Conservar o plasma no congelador imediatamente a -20 °C para análise subsequente.
  5. Aplicar 20 μL de plasma na área da amostra na parte superior do dispositivo. Em seguida, adicionar 30 μL de tampão de lavagem (0,05% v/v Tween 20 em solução salina tamponada com fosfato 1x).
  6. Deixe a amostra entrar completamente no dispositivo, o que pode levar de 20 a 30 minutos para obter os resultados.
  7. Capture imagens do dispositivo usando uma câmera digital ou smartphone após 5 min de incubação à temperatura ambiente.
  8. Analise as áreas de teste e controle usando o ImageJ e um aplicativo móvel personalizado.

7. Quantificação com aplicativo móvel

NOTA: A intensidade do imunoensaio em papel é analisada no aplicativo móvel (Figura 2).

  1. Abra o aplicativo móvel desenvolvido no smartphone.
  2. Selecione Usar câmera ou Carregar da Galeria para escolher ou carregar a fonte de dados. Faça isso por meio da captura da câmera ou selecionando uma imagem da galeria do dispositivo.
  3. Navegue até a seção analítica e toque no botão Analisar na tela.
  4. Aguarde até que o aplicativo analise os dados e exiba os resultados.

Resultados

A seleção de um método de fabricação é fundamental para garantir desempenhos de ensaio reprodutíveis em dispositivos de imunoensaio baseados em papel. Em nosso estudo, exploramos vários processos de fabricação e materiais no contexto da demonstração de um imunoensaio baseado em papel. Nosso método escolhido utiliza um sistema de impressão de cera para criar barreiras hidrofóbicas dentro de dispositivos microfluídicos à base de papel. Essa abordagem se destaca pela simplicidade, rapidez e resultados consistentes. Vale ressaltar que oferece a vantagem de evitar o uso de produtos químicos fotorresistentes, que têm o potencial de interferir na adsorção de proteínas e aumentar a hidrofobicidade do papel celulose. Além disso, a impressão em cera garante dimensões consistentes dos canais fluídicos, contribuindo para o desempenho do ensaio repetível.

Após a formação de barreiras hidrofóbicas, os reagentes necessários para o imunoensaio foram aplicados na superfície do papel celulósico. Com a adsorção eletrostática, o PLL auxiliou na imobilização de biomoléculas, interagindo tanto com a carga positiva dos grupos funcionais da amina quanto com o anticorpo carregado negativamente. Esta etapa facilita a modificação e imobilização de anticorpos e a aplicação de conjugados marca-anticorpo durante os processos de fabricação. É importante ressaltar que essa etapa pode ser conduzida em paralelo. A montagem dos dispositivos de imunoensaio de papel (DEN-NS1-PAD, como mostrado na Figura 1A) é concluída empilhando o papel modificado em um cartão de suporte plástico adesivo e laminando-o com um filme plástico.

O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método amigável utilizando um smartphone para medir as concentrações de NS1. Essa abordagem poderia ser usada como um dispositivo de teste de ponto de atendimento (POCT) em ambientes domiciliares e clínicos. Dada a ampla faixa de concentrações de NS1 no soro dos pacientes, modelos lineares simples foram empregados com base nos resultados desses experimentos. Para cada concentração de NS1, um conjunto de dados composto por três dispositivos de teste foi preparado. As fotos dos dispositivos foram capturadas usando um smartphone sob configurações padrão e condições ideais de iluminação, eliminando a necessidade de uma caixa escura. A zona de teste dos PADs contém o anticorpo monoclonal NS1 da dengue de camundongo, enquanto a zona de controle apresenta o anticorpo IgG de cabra anti-camundongo. Com um formato de ensaio sanduíche, maiores concentrações de NS1 nas amostras correspondem ao aumento da intensidade da cor vermelha na zona de teste. Em contraste, a intensidade da cor na zona de controle permanece relativamente constante. A Figura 1B mostra imagens de smartphones não processadas, que proporcionam uma observação visual vantajosa sem a necessidade de equipamentos especializados.

Usando um aplicativo móvel dedicado, normalizamos as intensidades e computamos modelos lineares simples para concentrações de NS1 acentuada em amostras de soro - o coeficiente de correlação (r2) obtido a partir do aplicativo móvel. O coeficiente de correlação (r2) obtido a partir do aplicativo móvel foi de 0,92 (Figura 3), alinhando-se às expectativas. Essa abordagem baseada em smartphone superou a observação a olho nu, aumentando significativamente a sensibilidade em 178%. Adicionalmente, o limite de branco (LoB), limite de detecção (LoD) e limite de quantificação (LoQ) foram calculados para as intensidades normalizadas, conforme apresentado na Tabela 1.

Amostras clínicas do mundo real foram utilizadas para demonstrar a funcionalidade prática dos DEN-NS1-PADs em ambientes clínicos. O imunoensaio baseado em papel produziu leituras qualitativas de cores dentro de 20-30 min, permitindo a determinação visual de resultados negativos ou positivos. Amostras de soro de pacientes com suspeita de dengue foram submetidas ao dispositivo. A Figura 4 ilustra e compara os resultados obtidos tanto do aparelho quanto de um teste de diagnóstico rápido (TDR) comercial. A Tabela 2 resume os resultados das leituras visuais e do sistema baseado em smartphone. O RDT comercial e o aparelho apresentaram resultados semelhantes, com sete resultados positivos e 23 negativos da leitura visual. Por outro lado, o sistema leitor baseado em smartphone aplicado exclusivamente ao dispositivo relatou nove resultados positivos e 21 negativos de amostras clínicas.

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Figura 1: Imagens do DEN-NS1-PAD projetado e fabricado. (A,B) Um único canal da barreira hidrofóbica com padrão de cera é projetado e representado em três estados (C) antes e (D,E) depois de introduzir a solução da amostra na área designada e mostrar os resultados (D) negativos e (E) positivos, respectivamente. A solução da amostra atravessa o canal (ver seta marcada), interagindo com os componentes em locais-chave - AuNPs-Ab na área conjugada, anticorpo anti-NS1 na área de teste (indicativo de um resultado positivo de NS1 para dengue) e IgG anti-camundongo na área de controle. Os resultados são facilmente observáveis a olho nu e podem ser quantificados pelo processamento de imagens usando um scanner de mesa ou câmera de smartphone. Abreviação: AuNPs-Ab = nanopartículas de ouro-conjugado anticorpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Capturas de tela da tela do telefone do aplicativo móvel. (A) Tela do usuário do aplicativo Android em execução no dispositivo de telefone celular, (B) exibição da tela do aplicativo, (C) menu principal do aplicativo que os usuários podem selecionar para usar a câmera ou fazer upload de imagem da galeria, (D) exibição de uma imagem relacionada para teste, (E) exibição do tempo de contagem regressiva para análise, (F) exibição dos resultados dos testes, incluindo a intensidade da zona de teste e controle, a decisão da infecção (positiva/negativa) e a concentração de NS1 na amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Curva de calibração linear para detecção de NS1 no soro. O dispositivo foi utilizado e as imagens interpretadas por processamento por meio de um aplicativo baseado em dados do smartphone. As barras de erro mostram ±1 desvio padrão, n = 3. Abreviaturas: T = área de teste; C = área controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagem do DEN-NS1-PAD do ensaio da amostra clínica. O soro (50 μL) foi utilizado em imunoensaio em papel. (A) Exemplo de resultado negativo, (B) resultados positivos, (C) resultados gerais e comparação de RDT versus imunoensaio baseado em papel. Abreviações: RDT = Teste de Diagnóstico Rápido; Pos = positivo; Neg = negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ParâmetroOlhos nusAplicativo móvel
Limite de Branco (LoB)-43,15 ng mL-1
Limite de Detecção (LoD)200 ng mL-1112,19 ng mL-1
Limite de Quantificação (LoQ)-373,58 ng mL-1

Tabela 1: LoB, LoD e LoQ do ImageJ e aplicativo móvel sobre o padrão de calibração de dados NS1 no soro. Abreviaturas: LoB = limite de branco; LoD = limite de detecção; LoQ = limite de quantificação.

Paciente nº.Olhos NusAplicativo para SmartphoneImagemJ
RDTImunoensaio em papel
1----
2----
3----
4----
5----
6----
7----
8----
9++++
10--++
11----
12++++
13----
14----
15----
16++++
17++++
18----
19----
20----
21++++
22++++
23----
24++++
25----
26----
27----
28----
29----
30--++

Tabela 2: Comparação dos resultados da leitura visual e do sistema leitor baseado em smartphone para amostras de soro. (+) e (-) indicam interpretações positivas e negativas dos resultados, respectivamente.

Discussão

Um dos parâmetros de projeto importantes para um sistema leitor baseado em smartphone é a capacidade de fornecer processamento de imagem reprodutível de amostras. Neste estudo, para simplicidade e conveniência, as imagens foram capturadas de três marcas diferentes de smartphones com câmeras de 12 a 13 MP, sem o uso de caixa de imagem ou acessórios. Condições variáveis de captura de imagem, como a resolução da câmera, o tempo de captura da imagem, as condições de iluminação e o ambiente, podem influenciar a intensidade de cor do teste e os pontos de controle no dispositivo. O impacto de diferentes tempos de captura de imagens sobre a iluminação e secagem da DAOP sobre as intensidades de sinal dos aparelhos foi minimizado com o uso das intensidades de sinal normalizadas, que permaneceram consistentes ao longo das imagens capturadas em vários momentos36. A subtração do sinal de fundo surgiu como uma estratégia para aumentar a precisão das medidas de intensidade de cor, mitigando efetivamente a influência das condições de iluminação. Nosso achado está alinhado com pesquisas anteriores que destacaram a eficácia das técnicas de subtração basal ou de fundo na minimização dos efeitos ambientais39,40.

O debate em curso em torno da superioridade do uso de uma caixa de imagem ou de um método livre de acessórios tem implicações para o processamento de imagens39,41. Uma caixa de imagem pode aumentar a robustez dos resultados do processamento de imagens minimizando as variações nas condições de imagem 41,42,43. Neste estudo, utilizamos um aplicativo móvel baseado em aprendizado de máquina em nuvem para processamento de imagens. Essa abordagem aproveita o aprendizado de máquina em uma plataforma baseada em nuvem para classificar, extrair e enriquecer dados de imagem automaticamente. O aplicativo efetivamente identificou e processou a região de interesse dentro das imagens, englobando as zonas de fundo, teste e controle. Esse passo foi fundamental para diferenciar essas zonas38. Pesquisas anteriores sugerem que o processamento de imagens envolvendo aprendizado de máquina produz classificação superior entre os resultados para amostras de controle e teste 43,44,45. Neste estudo, o emprego da localização fixa e da subtração de fundo gerou um sinal de fundo consistente a partir dos μPADs de celulose, aumentando a consistência e a precisão da classificação das leituras fornecidas pelo aplicativo móvel40,43.

Em relação aos desempenhos consistentes na demonstração de um imunoensaio baseado em papel, o método de fabricação desempenha um papel importante. Em um estudo anterior36, várias condições de otimização para o projeto e método de fabricação de DEN-NS1-PAD, tais como concentrações de PLL, substância bloqueadora e anticorpo NS1, foram estudadas. O dispositivo testou com sucesso a NS1 em tampão, cultura de células e soro humano, tanto qualitativa quanto quantitativamente.

Efeitos de matriz decorrentes de componentes séricos podem interferir no limite de detecção do dispositivo ao testar amostras de soro. No entanto, os resultados indicam que o imunoensaio desenvolvido foi capaz de detectar com sucesso as concentrações de NS1 em amostras de soro, produzindo resultados comparáveis aos do RDT comercial (Tabela 2). Foram observados os resultados aparentes utilizando a inspeção visual e o aplicativo móvel (Figura 4), ressaltando a eficácia do ensaio para o teste sérico. Embora a maior viscosidade do soro possa afetar os tempos de análise, isso não prejudica a interpretação dos resultados36. A utilização de um aplicativo móvel pode fornecer resultados mais positivos para ensaios de amostras, pois o uso de um aplicativo móvel melhora significativamente a sensibilidade dos testes de amostra46. É importante notar que comparações adicionais com ensaios moleculares como RT-PCR 15,47,48 para dengue NS1 são necessárias para determinar potenciais resultados falso-positivos ou falso-negativos.

Uma limitação notável deste estudo surge quando se considera uma matriz amostral mais complexa, como o sangue. Os componentes presentes no sangue poderiam, sim, interferir no limite de detecção do dispositivo. Nesses casos, o emprego de absorventes adicionais para aumentar a absorção do tampão de corrida representa uma solução potencial. Essa modificação pode auxiliar a coagulação sanguínea, potencializando as propriedades hemotípicas da celulose por influenciar as plaquetassanguíneas 49. Outra abordagem envolve a aplicação de gotas de soro fisiológico a 4% (p/v) no coxim da amostra para melhorar a coagulação sanguínea. Pesquisas prévias demonstraram que sais como cloreto de cálcio e cloreto de sódio induzem a coagulação das hemácias50,51. O Na+ pode desestabilizar a suspensão de hemácias no sangue, suprimindo a dupla camada elétrica na superfície das hemácias e reduzindo a repulsão de carga entre as hemácias. Além disso, uma alta concentração de sal também induz a agregação sanguínea52. Além disso, a carga de valência de íons do Na+ suprime a espessura da dupla camada carregada de hemácias, levando à agregação das hemácias desinsuflados. A adição de solução salina (NaCl) a 4% (p/v) facilita a separação do plasma em papel celulósico51. Entretanto, a otimização cuidadosa da concentração salina é necessária para evitar a indução de efeitos indesejáveis sobre a agregação sanguínea e a agregação de nanopartículas de ouro53,54.

As impressoras de cera comerciais proporcionaram uma combinação ideal de custo e simplicidade de prototipagem. Como essas impressoras foram descontinuadas em 2016, métodos alternativos de fabricação foram necessários, como impressão a jato de tinta55, serigrafia56 e fotolitografia57. Uma impressora de toner de escritório é uma boa candidata para a fabricação de μPAD. A resina de poliéster no toner cria padrões hidrofóbicos a 200 °C por 60 min com vários designs58.

O anticorpo NS1 sorotipo dois, conforme especificado pela empresa, foi utilizado nesta pesquisa. Entretanto, observamos que esse anticorpo também interage com todos os sorotipos 36,37. As sensibilidades para detecção do DENV-4 são menores (87,5%) em comparação com outros sorotipos. A sensibilidade do DENV-1 e do DENV-2 é de aproximadamente 88,89%, e do DENV-3 é de 100%37. Esses achados estão de acordo com pesquisas anteriores, que também relataram menor sensibilidade do RDT ao DENV-4 em comparação com outros sorotipos59. A sensibilidade geral do dispositivo é de ~88,89%, com uma especificidade de aproximadamente 86,67%. Vale ressaltar que a sensibilidade real do DEN-NS1-PAD pode superar a do RDT comercial. Entretanto, o TDR demonstra valor preditivo positivo (VPP) de 84,62% e acurácia de 87,67%. Notadamente, o DEN-NS1-PAD apresentou melhor desempenho na detecção de infecção por dengue nos primeiros 5-6 dias, enquanto o RDT é efetivo apenas nos primeiros 5 dias37.

Em resumo, a combinação de um imunoensaio portátil baseado em papel (DEN-NS1-PAD) com um aplicativo de smartphone é uma grande promessa para a medição da dengue NS1. O aplicativo móvel aumenta significativamente a sensibilidade e a eficiência na quantificação de NS1 em amostras de soro em comparação com a observação a olho nu. Os benefícios do aplicativo móvel incluem tempo de análise reduzido, facilidade de uso e compatibilidade com diversos dispositivos smartphones, posições e condições de iluminação. No entanto, mais aprimoramentos são necessários para melhorar a sensibilidade e o desempenho. Enquanto isso, a modificação do imunoensaio baseado em papel é necessária para melhorar seu desempenho ao lidar com amostras de sangue. Além disso, avaliações abrangentes são necessárias do DEN-NS1-PAD para detectar dengue usando um número mais significativo de sorotipos de infecção primária e amostras selecionadas coletadas de vários pacientes (crianças e adultos).

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

M.H.P. agradece o fundo de pesquisa de bolsas da Universitas Islam Indonesia (UII). Os autores estendem sua gratidão ao Sr. Nutchanon Ninyawee por sua valiosa experiência e assistência durante o desenvolvimento do aplicativo móvel e suas contribuições para o manuscrito. Além disso, os autores agradecem o apoio financeiro fornecido pela Tailândia Science Research and Innovation (TSRI), Fundo de Pesquisa Básica: Ano fiscal de 2023 (projeto nº. FRB660073/0164) no âmbito do Programa Smart Healthcare da Universidade de Tecnologia de Thonburi do Rei Mongkut.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
0,1 M solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) 
BBS contendo 0,1% de Tween 20, 10% de sacarose e 1% de caseína   o tratamento da área conjugada e o tampão de bloqueio
salina tamponada com borato (BBS) (25 mM de borato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio em pH 8,2) suplementado com 1% de BSA o tampão de lavagem durante o processo de conjugação AuNPs com o anticorpo
Ácido bóricoMerck10043-35-3
Albumina sérica bovina fração V (BSA)   PAA Lab GmbH (Alemanha)K41-001 
CaseínaMerck9005-46-3
Papel para Cromatografia Grau 2 GE Healthcare3002-911
Filme laminado transparente3M (Papelarias)
Hidrogenofosfato dissódicoMerck7558-79-4
Fita dupla lateralPapelaria
Cabra anti-rato IgG anticorpo MyBiosource (EUA)MBS435013
Nanopartículas de ouro (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Tailândia)
Anticorpo policlonal IgG humano   MerckAG711-M
Camundongo dengue NS1 monoclonal anticorpo MyBiosource (EUA)MBS834415
Anticorpo monoclonal NS1 da dengue de camundongoMyBiosource (EUA)MBS834236
antígenos do sorotipo 2 NS1MyBiosource (EUA)MBS 568697
PBS 1X contendo 0,1% de Tween 20 foi usado comotampão de eluição
de apoio de plástico 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Tailândia)
Poli-L-lisina (PLL)Sigma AldrichP4832
Cloreto de potássioMerck104936
Monofosfato de potássioMerck104877
Cloreto de SódioMerck7647-14-5
Tetraborato de sódio Sigma Aldrich1303-96-4
SucroseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 leitor multimodoBioTek
Telefones celularesHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Scanner de fotos
Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Documentação de detecção de objetosGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, EUA
Software
Solução Cartão Impressora de cera Memmert de forno Epson Perfection V30 Inkscape 0.91

Referências

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