Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Resumo

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Resumo

O transporte bidirecional de cargas ao longo do axônio é fundamental para manter sinapses funcionais, conectividade neural e neurônios saudáveis. O transporte axonal é interrompido em várias doenças neurodegenerativas, e os neurônios de projeção são particularmente vulneráveis devido à necessidade de transportar materiais celulares por longas distâncias e sustentar massa axonal substancial. Modificações patológicas de várias proteínas relacionadas à doença afetam negativamente o transporte, incluindo tau, β amilóide, α-sinucleína, superóxido dismutase e huntingtina, fornecendo um potencial mecanismo comum pelo qual as proteínas patológicas exercem toxicidade na doença. Métodos para estudar esses mecanismos tóxicos são necessários para entender os distúrbios neurodegenerativos e identificar possíveis intervenções terapêuticas.

Aqui, neurônios primários do hipocampo de roedores cultivados são co-transfectados com vários plasmídeos para estudar os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal rápido usando imagens confocais de células vivas de proteínas de carga marcadas com fluorescência. Começamos com a colheita, dissociação e cultura de neurônios primários do hipocampo de roedores. Em seguida, co-transfectamos os neurônios com construções de DNA de plasmídeo para expressar proteína de carga marcada com fluorescência e tau selvagem ou mutante (usada como exemplo de proteínas patológicas). Os axônios são identificados em células vivas usando um anticorpo que se liga a um domínio extracelular de neurofascina, uma proteína do segmento inicial do axônio e uma região axonal de interesse é fotografada para medir o transporte de carga fluorescente.

Usando o KymoAnalyzer, uma macro ImageJ disponível gratuitamente, caracterizamos extensivamente a velocidade, a frequência de pausa e a densidade de carga direcional do transporte axonal, todos os quais podem ser afetados pela presença de proteínas patológicas. Por meio desse método, identificamos um fenótipo de aumento da frequência de pausa de carga associado à expressão da proteína tau patológica. Além disso, construções de shRNA silenciadoras de genes podem ser adicionadas à mistura de transfecção para testar o papel de outras proteínas na mediação da interrupção do transporte. Este protocolo é facilmente adaptável para uso com outras proteínas relacionadas a doenças neurodegenerativas e é um método reprodutível para estudar os mecanismos de como essas proteínas interrompem o transporte axonal.

Introdução

Os neurônios dependem do transporte bidirecional de carga ao longo do axônio para manter as sinapses funcionais e a conectividade neural. Acredita-se que os déficits de transporte axonal sejam contribuintes críticos para a patogênese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (DA) e outras tauopatias, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington ^1,2,3. De fato, modificações patológicas em várias proteínas relacionadas à doença afetam negativamente o transporte (revisado em ⁴). O desenvolvimento de métodos para investigar os mecanismos pelos quais as proteínas patológicas exercem toxicidade na doença é necessário para entender os distúrbios neurodegenerativos e identificar alvos potenciais para intervenção terapêutica.

Vários insights importantes sobre o transporte de axônios, incluindo a descoberta da cinesina convencional, as vias dependentes de quinase e fosfatase que regulam as proteínas motoras e os mecanismos pelos quais as proteínas patológicas interrompem a regulação do transporte de axônios, foram feitos usando o modelo isolado de axoplasma de lula ^4,5. A perfusão do axoplasma da lula com formas patológicas da proteína tau inibe o transporte axonal rápido anterógrado (FAT), um efeito dependente da exposição do domínio ativador da fosfatase da tau, que ativa a proteína fosfatase 1 (PP1)^6,7,8. O PP1 ativa a glicogênio sintase quinase 3 (GSK3), que por sua vez fosforila as cadeias leves de cinesina, causando a liberação de carga. Outra proteína patológica na DA é a β amilóide. As formas oligoméricas de β amilóide inibem o FAT bidirecional através da caseína quinase 2, que fosforila as cadeias leves de cinesina⁹. Além disso, a proteína huntingtina patológica que abriga uma expansão de poliglutamina e um mutante SOD1 ligado à ALS familiar interrompem o transporte axonal no axoplasma da lula através da quinase N-terminal c-Jun e da atividade da proteína quinase ativada por mitógeno p38, respectivamente^10,11.

Embora o modelo de axoplasma de lula continue a ser uma ferramenta valiosa na compreensão dos efeitos das proteínas patológicas no transporte axonal, o acesso limitado ao equipamento e às amostras impede que ele seja mais amplamente utilizado. Desenvolvemos um ensaio de transporte usando imagens de microscopia confocal de células vivas de neurônios primários de roedores (camundongos e ratos). Este modelo representa uma abordagem baseada em neurônios de mamíferos facilmente adaptável e manipulável usando fontes celulares e sistemas de microscopia amplamente disponíveis. Por exemplo, uma variedade de proteínas patológicas (por exemplo, que abrigam modificações relacionadas à doença) são expressas para identificar como modificações específicas dessas proteínas afetam o transporte nos axônios. Da mesma forma, uma variedade de proteínas de carga marcadas com fluorescência pode ser usada para examinar mudanças específicas de carga. Além disso, os mecanismos moleculares subjacentes são estudados com relativa facilidade, visando a expressão (ou seja, knockdown ou superexpressão) de proteínas selecionadas que podem mediar esses efeitos. Este método também é facilmente adaptado para neurônios primários derivados de uma ampla variedade de modelos animais.

Apresentamos um protocolo detalhado descrevendo o ensaio de transporte de axônios de células vivas que foi usado anteriormente em neurônios primários do hipocampo para mostrar que as proteínas tau mutantes associadas a demências lobares frontotemporais (FTLD; P301L ou R5L tau) aumentam a frequência de pausa de proteínas de carga marcadas com fluorescência bidirecionalmente¹². Além disso, o knockdown da isoforma PP1γ resgatou os efeitos de pausa¹². Isso fornece suporte para o modelo de interrupção patológica induzida por tau que é mediada pela ativação aberrante de uma via de sinalização iniciada por PP1, conforme descrito acima ^6,7,12. Em um estudo separado, mostramos que a pseudofosforilação de tau em S199 / S202 / T205 (o fosfoepítopo AT8 patogênico relevante para tauopatias) aumentou a frequência de pausa de carga e a velocidade do segmento anterógrado. Esses efeitos foram dependentes do domínio de ativação da fosfatase N-terminal da tau¹³. Esses exemplos destacam a utilidade desse modelo para identificar os mecanismos de como as proteínas patológicas interrompem o transporte de axônios em neurônios de mamíferos.

Este artigo fornece uma descrição detalhada do método, começando com a colheita, dissociação e cultura de neurônios primários do hipocampo de camundongos, seguida pela transfecção dos neurônios com proteínas de carga fundidas com uma proteína fluorescente e, finalmente, a abordagem de imagem e análise de imagem de células vivas. Demonstramos como esse método é usado para estudar os efeitos da tau modificada no transporte bidirecional da proteína associada à vesícula, sinaptofisina, por exemplo. No entanto, há flexibilidade na proteína patogênica e na proteína de carga de transporte de interesse, o que torna esta uma abordagem versátil para estudar o transporte axonal.

Protocolo

Esses protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Michigan State University. Este protocolo foi aplicado com sucesso a camundongos Tau Knockout no fundo C57BL / 6J e ratos Sprague Dawley do tipo selvagem. Outras cepas também devem ser aceitáveis.

1. Colheita primária de neurônios do hipocampo

1. Cubra uma lâmina de câmara de fundo de vidro de 4 poços com poli-d-lisina (PDL) filtrada a 0,5 mg / mL em tampão borato (borato de sódio deca-hidratado 12,5 mM e ácido bórico 50 mM). Adicione 750 μL / poço e incube em temperatura ambiente durante a noite.
2. Lave a lâmina da câmara 4x com água deionizada estéril. Seque ao ar após a última lavagem e mantenha a 4 °C para armazenamento de curto prazo (<1 semana).
   NOTA: Não permita que o PDL seque na lâmina antes e entre as lavagens, pois isso é tóxico para as culturas. Descobrimos que o armazenamento de longo prazo de lâminas revestidas com PDL pode afetar a saúde neuronal e que a manutenção de intervalos consistentes entre o revestimento e o plaqueamento reduz a variabilidade entre corridas na viabilidade da cultura.
3. Obtenha um camundongo ou rato grávido cronometrado.
   NOTA: Animais grávidas cronometrados podem ser encomendados a várias empresas ou criados internamente. O dia zero embrionário refere-se ao dia em que o tampão vaginal é encontrado, e tivemos sucesso na cultura de neurônios primários do hipocampo e corticais do camundongo E16-18 com essa abordagem. Os neurônios de ratos também são colhidos no dia embrionário 18.
4. Em E18, eutanasiar a fêmea grávida por um método aprovado. Corte a parede abdominal e remova os dois chifres uterinos. Transfira-os para uma placa de Petri contendo solução salina a 0,9% gelada. Enxágue até que a solução salina esteja limpa.
   NOTA: Administramos uma overdose de pentobarbital sódico (pelo menos 100 mg / kg) por injeção intraperitoneal.
5. Decapite os filhotes. Começando no forame magno (a abertura na parte de trás do crânio), use uma tesoura de microdissecção para cortar a pele e o crânio ao longo da linha média, inclinando a ponta inferior da tesoura contra a parte interna do crânio para evitar danos ao tecido cerebral.
6. Remova a pele sobrejacente e remova cuidadosamente o crânio para expor o cérebro.
7. Use uma pinça para segurar a área da boca/nariz e vire o crânio de forma que o cérebro fique voltado para baixo sobre uma placa de Petri cheia de solução salina a 0,9%. Vire o cérebro para fora do crânio e corte os nervos e o tronco cerebral para liberar o cérebro na solução salina.
8. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecação para dissecação do hipocampo. Insira a tesoura na linha média do cérebro, incline a tesoura de modo que a lâmina superior empurre um dos hemisférios cerebrais para fora e corte para separar o hemisfério das regiões subcorticais.
9. Faça um corte vertical no córtex de modo que o córtex frontal fique anterior e o hipocampo posterior ao local do corte. Insira a ponta inferior da tesoura no orifício resultante e corte cuidadosamente ao longo do ápice do córtex, parando na extremidade posterior.
10. Usando a pinça, balance cuidadosamente o córtex e termine o corte posterior. O hipocampo deve se assemelhar a uma forma crescente. Apare cuidadosamente o córtex restante para que o hipocampo mantenha sua forma arredondada e crescente.
11. Usando fórceps e tesouras, remova suavemente as meninges do hipocampo.
    NOTA: É importante remover todas as meninges do cérebro para reduzir o número de células não neuronais que são coletadas, evitando danificar ou rasgar o tecido do hipocampo.
12. Corte o hipocampo em quatro pedaços iguais e coloque o tecido em um tubo cônico de 15 mL cheio de tampão gelado sem cálcio e magnésio (CMF; PBS de Dulbecco com 0,1% de glicose, 2,5 μg/mL de Anfotericina B e 50 μg/mL de Gentamicina).
    NOTA: Para obter melhores resultados, colete os hipocampos de 5 a 10 filhotes por dissociação. Cada hipocampo deve fornecer aproximadamente 300.000 células para camundongos e 500.000 células para ratos.

2. Dissociação e plaqueamento do neurônio primário do hipocampo

1. Remova o CMF com uma pipeta Pasteur e enxágue o tecido com CMF fresco e frio 4x, girando suavemente entre os enxágues.
2. Remova o CMF e adicione 3 mL de solução filtrada de tripsina a 0,125% (diluir 2,5% de tripsina em CMF pré-aquecido [37 ° C]). Incubar o tecido por exatamente 15 min a 37 °C; Agite suavemente a cada 5 min.
   NOTA: Faça a solução de tripsina imediatamente antes de usar.
3. Prepare 5 mL de solução de inativação de tripsina (TIS; Solução salina balanceada de Hanks, soro de bezerro recém-nascido a 20% e 1x solução de DNase I [estoque de 10x: acetato de sódio 5 mM, cloreto de cálcio 1 μM, 0,5 mg/mL de DNase I]).
4. Remova a solução de tripsina e lave 2x com CMF frio. Adicione 3 mL de TIS frio.
5. Dissociar as células por meio de trituração com seringa de 3 mL com agulhas de diâmetro progressivamente menor: triturar 30x com agulha de 14 G, 30x com agulha de 15 G, 20x com agulha de 16 G, 20x com agulha de 18 G e 15x com agulha de 21 G. Use 2 s com as primeiras quatro agulhas e 3 s com a agulha 21 G.
   NOTA: Outros métodos de trituração (por exemplo, pipetas de vidro polido a fogo ^14,15) também podem ser usados. Descobrimos que o uso de agulhas de seringa de metal padronizadas reduz substancialmente a variabilidade na aglomeração e viabilidade celular.
6. Usando a agulha 21 G, coloque uma gota da suspensão celular em uma lâmina de microscópio e verifique se há aglomerados de células. Se forem observados vários aglomerados, triturar mais três vezes através de uma agulha de 22 G e verificar novamente. Repita este processo até obter uma suspensão unicelular homogênea, tendo o cuidado de triturar suavemente durante todo o processo.
7. Filtre 5 mL de soro fetal bovino (FBS) usando um filtro de seringa de 0,22 μm. Coloque suavemente a suspensão celular no FBS em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células (200 × g a 4 °C) durante 5 min.
8. Remova o máximo de FBS possível sem interromper o pellet. Ressuspenda em 1 mL de meio neurobasal quente (37 ° C) livre de antibióticos (NBM; suplementado com 1x substituto de glutamina e 1x B-27).
9. Diluir a suspensão celular em azul de tripano (0,4%) e obter uma contagem de células.
   NOTA: Uma diluição de 1:1 funciona bem para um contador automático de células e use uma diluição de 1:60 para contagem manual com um hemacitómetro. Para continuar no revestimento celular, a viabilidade do neurônio deve ser superior a 90% neste momento. Isso aumenta significativamente a probabilidade de uma cultura de neurônios saudável após a dissociação.
10. Plaquear as células a uma densidade de 175.000 células/poço (70.000 células/mm²) em uma lâmina de câmara de quatro poços revestida com PDL pré-aquecida em 750 μL de NBM livre de antibióticos. Além disso, coloque 200.000 células/poço em quatro poços de uma placa de 24 poços revestida com PDL em 1,5 mL de NBM livre de antibióticos para uso como meio condicionado na transfecção descrita na seção 3. Incubar as células em uma câmara de CO₂ de 37 °C e 5% com umidade controlada.
    NOTA: A densidade das células pode ser ajustada com base nos resultados. Altas densidades podem dificultar a imagem dos neurônios, enquanto baixas densidades podem afetar negativamente a saúde da cultura e a sobrevivência dos neurônios. Em nossa experiência, os neurônios de ratos podem ser plaqueados em uma densidade mais baixa em comparação com os neurônios de camundongos.

3. Transfecção de neurônios

NOTA: Os neurônios podem ser transfectados no DIV 7 ou DIV 8 sem alterações notáveis na eficiência da transfecção ou nos resultados do transporte. Esses volumes são para quatro poços de uma lâmina de câmara de fundo de vidro de quatro poços em volume de 750 μL / poço. Este protocolo descreve a transfecção usando reagentes de transfecção lipídica. Deixe os reagentes de mídia e transfecção aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.

1. Prepare o reagente estoque de transfecção adicionando 4,4 μL de reagente de transfecção a 127,6 μL de meio de soro reduzido. Balance suavemente com a mão para misturar e incubar em temperatura ambiente por 30 min.
2. Prepare estoques de DNA durante a incubação da transfecção lipídica. Adicione 200 ng de DNA de carga fluorescente (pFIN mApple-synaptophysin; 12.112 pares de bases) e 200 ng de DNA para expressar a proteína de interesse (plasmídeos tau usados foram construções pCMV tau-Flag; 5.036 pares de bases) em meio de soro reduzido ou sem soro até um volume final de 32 μL¹². Adicione 0,8 μL de reagente intensificador de transfecção (2 μL por μg de DNA). Misture bem à mão.
   NOTA: Descobrimos que um derivado de RFP funciona melhor (mApple ou mCherry), mas GFP também pode ser usado. Além disso, uma construção de DNA para expressar um pequeno RNA de grampo de cabelo silenciador de genes (shRNA) pode ser incluída para testar mecanismos de fenótipos observados com a expressão da proteína de interesse. Para fazer isso, inclua 150 ng de cada uma das três construções de DNA na mistura de DNA e ajuste a quantidade de reagente intensificador de transfecção de acordo. A alteração dos parâmetros do DNA ou do reagente de lipofecção pode afetar a eficiência da transfecção e pode ser ajustada com base na necessidade de transfecções mais ou menos eficientes.
3. Adicione 32 μL de mistura de transfecção lipídica a cada tubo de DNA. Balance suavemente com a mão para misturar. Incubar em temperatura ambiente por 30 min.
4. Adicione lentamente 64 μL de mistura de DNA / reagente de transfecção às células, colocando a ponta da pipeta logo abaixo da superfície do meio e movendo-se em um movimento serpentino por todo o poço. Balance suavemente a lâmina da câmara com a mão 3x após a adição a todos os poços para misturar ainda mais e coloque a lâmina da câmara na incubadora. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 2 h.
   NOTA: Minimize a quantidade de tempo que os neurônios ficam fora da incubadora, pois são muito sensíveis a mudanças de temperatura e pH, que podem ocorrer rapidamente.
5. Realize uma troca de meio meio 2 h após a transfecção com meio condicionado + anticorpo Neurofascina. Imediatamente antes da mudança do meio, agrupe 1,5 mL de NBM livre de antibióticos condicionados das células cultivadas na placa de 24 poços. Adicione 0,75 μL de anticorpo Neurofascin 186 (NF-186) (500 ng/mL) ao meio condicionado.
   NOTA: O anticorpo NF-186 detecta um domínio extracelular de neurofascina que é enriquecido no segmento inicial do axônio (AIS) para identificar definitivamente o axônio para imagem.
6. Efectuar uma mudança completa do meio 18 h após a transfecção com meio condicionado contendo o anticorpo secundário. Adicione 1 μL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado a AlexaFluor 647 a 3 mL de NBM condicionado (livre de antibióticos) agrupado da placa de 24 poços. Misture bem.

4. Imagem de neurônios

1. Prepare-se para a imagem 2 dias após a transfecção. Aqueça o acessório da câmara de células vivas para o microscópio confocal a 37 °C (incluindo a objetiva de 60x e o óleo da lente) e equilibre a câmara a 5% de CO₂.
2. Use uma objetiva de alta ampliação e uma câmara de células vivas para obter imagens das células.
   NOTA: Usamos uma objetiva de 60x 1,40 NA em um microscópio confocal de varredura a laser, mas outros sistemas de microscopia de fluorescência confocal (por exemplo, disco giratório) ou de campo amplo também podem ser usados se forem capazes de atingir altas taxas de quadros de imagem.
3. Identifique visualmente os neurônios transfectados no canal que contém a proteína de carga usando as oculares. Em seguida, crie imagens dos neurônios para identificar o AIS no canal Cy5 (Figura 1).
4. Defina o campo de visão para uma caixa retangular de 32 pixels por 128 pixels e mova-o para criar uma imagem de uma região do axônio ~ 50-150 μm distal ao AIS. Anotar e registrar a direcionalidade do transporte de carga e a orientação do ROI. Os pontos na caixa aparecerão como a parte superior e direita, respectivamente, de quaisquer imagens e filmes subsequentes. Registre qual lado da imagem está mais próximo do corpo celular e qual está mais próximo do terminal do axônio para que a polilinha do quimógrafo na etapa 5.1 possa ser desenhada com a orientação correta.
   NOTA: Ao selecionar a região de interesse, a área de imagem de um axônio isolado deve ser relativamente reta e cruzar o campo de visão em cada extremidade. Todo o segmento deve estar dentro do mesmo plano focal. A área deve exibir claramente o transporte ativo de carga. Neurônios excessivamente brilhantes normalmente expressam a proteína de carga e as proteínas de interesse em níveis que provavelmente são tóxicos para o neurônio e devem ser evitados.
5. Defina a potência do laser 561 para 1,40, o orifício para 7,8, o tamanho para 128 px² e a velocidade para 32 quadros / s. Ajuste o ganho para visualizar o transporte de vesículas de carga individuais sem que ele seja obscurecido pelo sinal de fundo (normalmente entre 10 e 50 resulta em quimógrafos de alta qualidade).
   NOTA: A potência extremamente baixa do laser é alcançável devido aos detectores GaAsP altamente sensíveis e evita potenciais efeitos fototóxicos e fotobranqueamento de cargas em movimento. O tamanho do orifício é definido o mais amplo possível para aumentar a profundidade focal e garantir que toda a ROI seja visualizada, pois o axônio pode não ficar perfeitamente plano na superfície da lâmina.
6. Defina o ROI selecionando Desenhar ROI retangular... no menu suspenso ROI . Desenhe o ROI para que cubra todo o campo de visão. Clique com o botão direito do mouse no ROI e selecione Usar como ROI de estimulação: S1.
7. Prepare a configuração do ND incluindo as etapas a seguir na guia Configuração do ND.
   NOTA: Este é o protocolo de aquisição de cinco etapas que é configurado uma vez e será executado pelo software sempre que os filmes forem coletados.
   1. Adquira a imagem para coletar a imagem de referência de pré-estimulação.
   2. Estimulação; ROI: S1; Intervalo: NoDelay; Duração 1.64 s, Loops: 7. Esta etapa branqueia a fluorescência de fundo com vários pulsos do laser.
   3. Adquirir imagem. Esta etapa coleta uma imagem de referência pós-estimulação.
   4. Esperando; Nenhuma ação; 2 min. Esta etapa fornece um período de recuperação para carga fluorescente para repovoar o ROI branqueado.
   5. Aquisição; Intervalo: NoDelay; Duração 5 min, Loops: 8.615. Esta etapa coleta imagens na taxa máxima para o período de imagem de 5 minutos.
8. Depois que o protocolo de configuração ND for configurado, clique no botão Aplicar configurações de estimulação na guia Configuração ND . Clique em Executar agora quando estiver pronto para criar imagens do transporte de carga. Isso iniciará o protocolo de aquisição ND a partir da etapa 4.7.
   NOTA: Embora a taxa de quadros esteja definida para 32 quadros/s, a taxa de quadros prática pode ser mais lenta (~28,7 quadros/s). Este valor deve ser registado para uma análise quimiográfica precisa na secção 5. Idealmente, a imagem de transporte de células vivas é feita com a taxa de quadros mais rápida possível (por exemplo, >25 quadros/s) para decifrar melhor os movimentos da carga.
9. Redefina o campo de visão para toda a imagem; em seguida, colete e salve uma imagem do neurônio completo nos canais 561 e 647 com a caixa ROI incluída. Registre as coordenadas XY onde a imagem foi tirada para confirmação pós-fixação da expressão da proteína de interesse.
10. Colete vídeos de transporte de pelo menos dois neurônios para análise. Certifique-se de que cada réplica independente venha das médias das variáveis medidas de uma colheita individual de neurônios primários (ou seja, não de neurônios individuais).
    NOTA: Para uma determinada colheita de neurônios primários, coletamos vídeos de 2 a 4 neurônios por condição.
11. Fixe as células removendo o meio e incubando com paraformaldeído a 4% pré-aquecido por 20 min em temperatura ambiente. Remova o tampão e lave as células por 3 x 5 min cada em TBS.
    NOTA: Para a fixação do paraformaldeído, usamos tampão citoesqueleto, um tampão comum que mantém a estrutura do citoesqueleto (10 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ e 4 mM EGTA, pH 6,1). Outros tampões (por exemplo, TBS, PBS) também podem ser usados para fixação.
12. Confirme se os neurônios analisados expressam tanto a proteína de interesse quanto a proteína de carga marcada com fluorescência por meio da coloração por imunocitofluorescência. Coloração para tau humana (Tau12) para confirmar a expressão de tau exógena e tubulina β-III (Tuj1) para verificar se os neurônios permaneceram saudáveis durante todo o processo de imagem.
    NOTA: Observamos a co-expressão de ambas as construções de DNA em quase todas as células transfectadas usando esses métodos.

5. Gerar e analisar quimógrafos

NOTA: Os quimógrafos podem ser gerados e analisados usando uma variedade de programas diferentes. Descrevemos brevemente o software KymoAnalyzer (v. 1.01) disponível gratuitamente usando seis plug-ins ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. Esses plug-ins podem ser baixados dos desenvolvedores no site do laboratório Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Instruções mais detalhadas sobre o uso deste software podem ser encontradas neste site.

1. Agrupe os filmes gerados na etapa 4.9 com base em condições experimentais e replique. Execute a macro BatchKymographGeneration e selecione a pasta apropriada. Desenhe uma polilinha de quimógrafo para traçar o axônio começando com a extremidade proximal nessa imagem específica. Os quimógrafos resultantes são armazenados na pasta selecionada (Figura 2).
2. Atribua trilhas manualmente executando a macro Trilhas, selecionando uma pasta de filme individual, selecionando sim para adicionar uma trilha e clicando para acompanhar a trajetória de cada partícula. Execute o clique inicial na parte superior da trilha e clique novamente em cada ponto em que a partícula muda de velocidade ou direção para que a polilinha se sobreponha ao traço da partícula no quimógrafo. Depois que a polilinha for colocada sobre toda a trilha, clique em OK. Repita até que todas as faixas sejam atribuídas.
3. Execute as macros restantes, atribuindo taxa de quadros e tamanho de pixel com base nos parâmetros de imagem. Primeiro, execute CargoPopulation, depois NetCargoPopulation e, em seguida, Segments. Introduza o tamanho do pixel e a taxa de fotogramas das filmagens quando solicitado (0,22 μm e 28,7 fotogramas/s, respetivamente, com estas definições). Por fim, execute a macro poolData para calcular e agrupar dados de parâmetros de transporte de todos os kymographs na pasta selecionada.
4. Plote os resultados dos arquivos de dados e compare as várias condições com as réplicas independentes representadas pelos valores médios de todos os neurônios analisados dentro de uma condição experimental para uma colheita individual de neurônios.

Resultados

Usando esses métodos, caracterizamos o transporte axonal na presença de formas selvagens ou relacionadas à doença da proteína tau para examinar os mecanismos potenciais de neurotoxicidade patológica induzida por tau na doença ^12,13. O software KymoAnalyzer calcula e agrupa uma variedade de parâmetros diferentes de todos os quimógrafos dentro de uma determinada pasta. As taxas de transporte são calculadas apenas quando a carga está em movimento (velocidade segment...

Discussão

Há evidências crescentes de que várias proteínas patológicas associadas a uma variedade de distúrbios neurodegenerativos interrompem o transporte axonal rápido nos neurônios. Isso representa um potencial mecanismo comum de neurotoxicidade nessas doenças. Para entender melhor o processo pelo qual essas proteínas interrompem o transporte, precisamos de ferramentas e modelos que nos permitam abordar questões específicas. O método descrito aqui permite o exame de mecanismos envolvidos por pr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,4% Trypan blue	Gibco	15250-061
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL	DOT	RN1700-GMT
2,5% tripsina	Gibco	15090-046
Seringa de 3 mL com agulha de 21 G	Seringa de plástico Fisher	14-826-84
10 mL	Agulha Fisher	14-823-2A
14 G	Fisher	14-817-203
Agulha de 15 G	Agulha de
	Fisher	14-817-104
Agulha de 18 G	Fisher	14-840-97
Agulha de 22 G	Fisher	14-840-90
32% de paraformaldeído	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 IgG anti-coelho de cabra (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Anfotericina B	Gibco	15290-026
Pinça de Cápsula Micro Embrionária Arruga, Curvada; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Suplemento (50x), sem soro	Placas
BioCoat de 24 poços	Fisher	08-774-124
ácido bórico	Sigma	B6768-1KG
Cloreto de cálcio	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Longo 8 x 0,15 mm Ângulo Tesoura afiada	Roboz	RS-5658	autoclave
Dispositivo			automático ou manual
Microscópio confocal com fixação	de câmara de células vivas
			imagem confocal
D-(+)-glicose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	pentobarbital sódico; outros métodos aprovados de eutanásia podem ser usados
Soro fetal bovino	Invitrogen	16000044
Solução de reagente de gentamicina	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	substituto de glutamina
Solução salina balanceada de Hanks	Gibco	24020-117
ImageJ versão 1.51n	ImageJ		Life-Line versão 2017 30 de maio: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (versão 1.01)	Encalada Lab		O pacote inclui todas as 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use com reagente intensificador de transfecção P3000
Cloreto de magnésio	Fisher	AC223211000
MES hidrato	Sigma	M8250
Tesoura de Micro Dissecação 3.5" Reta Afiada/Afiada	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus médio	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Funciona em neurônios de rato, NÃO em neurônios de camundongo
Neurofascina 186 (D6G60) Sinalização	de células	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Funciona em neurônios de camundongos, não testamos em neurônios
de ratos soro de bezerro recém-nascido	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
placa de Petri, vidro de 100 x 10 mm	Fisher	08-748B	Para dissecação; placa de Petri em autoclave
, vidro de 100 x 20 mm	Fisher	08-748D	Para colocar chifres uterinos; autoclave
Poly-D-lisina	Sigma	P7886-100MG
Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (15 mL)	Fisher	14-955-238
Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (50 mL)	Fisher	14-955-238
Cloreto de potássio	Fisher	P217-500
Acetato de sódio	Sigma	S5636
borato de sódio decahidratado	VWR	MK745706
Tesoura de Operação de Lâmina Reta Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Filtros de Seringa, 0.22 µ m	VWR	514-1263
Pinça de curativo para o polegar, serrilhada, 4,5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Poços Fundo de Vidro	Ibidi	80427