Method Article

Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

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Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Abstract

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Na última década, a transcriptômica de célula única evoluiu significativamente e se tornou um método laboratorial padrão para análise simultânea de perfis de expressão gênica de células individuais, permitindo a captura da diversidade celular. A fim de superar as limitações impostas por tipos de células difíceis de isolar, uma abordagem alternativa com o objetivo de recuperar núcleos únicos em vez de células intactas pode ser utilizada para sequenciamento, tornando o perfil do transcriptoma de células individuais universalmente aplicável. Essas técnicas se tornaram uma pedra angular no estudo dos organoides cerebrais, estabelecendo-os como modelos do cérebro humano em desenvolvimento. Aproveitando o potencial da transcriptômica de célula única e núcleo único na pesquisa de organoides cerebrais, este protocolo apresenta um guia passo a passo que abrange procedimentos-chave, como dissociação de organoides, isolamento de célula única ou núcleo, preparação de biblioteca e sequenciamento. Ao implementar essas abordagens alternativas, os pesquisadores podem obter conjuntos de dados de alta qualidade, permitindo a identificação de tipos de células neuronais e não neuronais, perfis de expressão gênica e trajetórias de linhagem celular. Isso facilita investigações abrangentes sobre processos celulares e mecanismos moleculares que moldam o desenvolvimento do cérebro.

Introduction

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Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos 1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença4. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas 4,5,6.

Com o advento das tecnologias de perfil de transcriptoma de célula única, tecidos humanos primários e modelos in vitro complexos podem ser estudados com um nível de granularidade sem precedentes, fornecendo insights mecanicistas sobre as mudanças na expressão gênica no nível de subpopulações celulares na saúde e na doença e informando sobre novos alvos terapêuticos putativos 7,8,9. O campo organoide progrediu utilizando o perfil do transcriptoma de célula única para avaliar a composição celular, a reprodutibilidade e a fidelidade das tecnologias organoides cerebrais 10,11,12. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permitiu a classificação celular e a identificação de desregulação genética em organoides doentes13,14. É importante ressaltar que é a complexidade dos tecidos organoides que exige a implementação de técnicas que permitam o perfil de células individuais. A caracterização de organoides usando métodos como perfil de transcriptoma em massa (sequenciamento de RNA em massa) leva à heterogeneidade celular mascarada e perfis de expressão gênica que são calculados em média em todos os tipos de células dentro do tecido complexo, limitando nossa compreensão dos processos em andamento durante o desenvolvimento de organoides na saúde e na doença 15,16,17. À medida que os métodos scRNA-seq continuam avançando, um número crescente de atlas está sendo criado, exemplificado por recursos como o Allen Brain Atlas ou o Atlas de célula única de organoides cerebrais humanos de Uzquiano et al.18.

A realização bem-sucedida do scRNA-seq a partir de organoides cerebrais depende do isolamento efetivo e da captura de células intactas. Como a dissociação de organoides cerebrais para obter células individuais é baseada na digestão enzimática, ela pode influenciar os padrões de expressão gênica, induzindo estresse e dano celular19,20. Portanto, a dissociação do tecido em células individuais é a etapa mais crucial. Uma abordagem alternativa é o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq), que facilita a extração livre de enzimas de núcleos de tecidos frescos e congelados21,22. No entanto, o isolamento de núcleos de um tecido apresenta outros desafios, como o enriquecimento dos tipos celulares de interesse e o baixo conteúdo de RNA dos núcleos em comparação com as células.

Estudos de transcriptoma de organoides cerebrais são comumente conduzidos usando scRNA-seq 10,18,23. No entanto, o isolamento de núcleos únicos pode fornecer um método ortogonal e suplementar para investigar o perfil transcriptômico de organoides. Aqui, apresentamos uma caixa de ferramentas para scRNA- e snRNA-seq para organoides cerebrais e discutimos os pontos críticos para obter os dados de sequenciamento de melhor qualidade.

Protocol

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O protocolo descrito é realizado em um laboratório de nível de biossegurança 1 do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprovação: 138/08), de acordo com os requisitos e em conformidade com as normas comunitárias e nacionais sobre ética em pesquisa.

1. Derivação de organoides do prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)

NOTA: Este protocolo foi testado para várias linhagens diferentes de iPSC cultivadas em uma variedade de meios de células-tronco de diferentes empresas (Tabela 1). A geração de organoides do prosencéfalo é altamente dependente de iPSCs de alta qualidade e uma confluência de 60% a 70% antes de iniciar o protocolo. Aqui usamos uma linha celular disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).

  1. Dia 0: Formação do corpo embrióide
    1. Para o tratamento de uma placa de 96 poços com solução plurônica, adicione 80 μL de solução plurônica filtrada estéril a 2% por poço de uma placa de fundo em U de 96 poços. Incubar durante, pelo menos, 15 min à temperatura ambiente (RT) ou a 37 °C.
      NOTA: As placas tratadas com plurônico podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas e podem ser usadas diretamente sem nenhuma etapa de lavagem para a formação do corpo embrióide.
    2. Remova a solução plurônica de cada poço usando um aspirador ou uma pipeta multicanal antes de semear as células.
    3. Antes de começar, prepare os seguintes reagentes para uma placa de 96 poços: tubo de centrífuga de 15 mL com 5 mL de DMEM pré-aquecido: meio F12; 11 mL de meio de células-tronco suplementado com 50 μM de Y-27632, placa tratada com plurônico (conforme descrito acima).
    4. Aspire o meio de um poço de uma placa de 6 poços de 60-70% de iPSCs confluentes. Lave as células uma vez com PBS. Adicione 500 μL de reagente à base de tripsina e incube por 2-6 min a 37 °C.
      NOTA: O tempo de incubação para o descolamento adequado das células com reagente à base de tripsina depende da densidade celular e das propriedades adesivas da matriz celular de cada linha iPSC. Para evitar a digestão excessiva, é aconselhável examinar a morfologia celular após 2 minutos de incubação com reagente à base de tripsina usando um microscópio de campo claro.
    5. Separe as células usando uma pipeta de 1000 μL e transfira para o tubo de centrífuga de 15 mL previamente preparado com meio DMEM:F12 para interromper a dissociação.
    6. Suspensão da célula de centrífuga por 3 min a 300 x g. Aspirar sobrenadante e manter o sedimento celular. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de células-tronco suplementado com 50 μM de Y-27632.
    7. Conte as células usando um contador de células e adicione o número desejado de células ao meio de células-tronco suplementado com 50 μM de Y-27632. A geração de um único corpo embrióide requer 3.000-12.000 células, dependendo da linhagem celular.
    8. Transfira a suspensão celular para um reservatório de reagente multicanal usando uma pipeta de 10 mL. Usando uma pipeta multicanal, coloque 100 μL/poço da suspensão celular na placa de 96 poços previamente tratada com plurônico.
    9. Colocar uma placa de 96 poços numa incubadora a 37 °C, 5% de O2 e 5% de CO2. Para evitar qualquer perturbação durante a formação do corpo embrióide, evite mover a placa.
  2. Dia 2: Exame de formação do corpo embrióide
    1. Examine a formação do corpo embrióide usando uma objetiva de 10x de um microscópio de campo brilhante. Os corpos embrióides devem apresentar bordas claras e morte celular mínima.
    2. Aspire o máximo de meio possível e substitua por 100 μL / poço de meio de células-tronco. (Crítico) Os corpos embrióides são facilmente removidos do poço durante a troca do meio. Preste atenção para não removê-los, portanto, monitore o meio após a aspiração.
  3. Dia 3: Indução do neuroectoderma
    1. Aspirar o máximo de meio possível e substituir por 120 μL/alvéolo de meio de indução e colocar a placa a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2.
  4. Dia 6: Incorporação
    1. Dependendo da linha iPSC, são necessários 3 ou 4 dias para induzir a emergência do neuroectoderma. Monitore os corpos embrióides regularmente. Uma vez que as bordas ficam brilhantes, os corpos embrióides estão prontos para serem incorporados. Use um dos dois métodos diferentes que podem ser usados para incorporação de corpos embrióides, conforme descrito abaixo24.
    2. Método de incorporação 1: Incorporação de cookies
      1. Descongele uma alíquota de gel de matriz extracelular não diluído no gelo por 1-2 h. (Crítico) Sempre mantenha o gel de matriz extracelular no gelo para evitar que se solidifique. Prepare alíquotas com antecedência para minimizar o tempo de descongelamento e os ciclos repetidos de descongelamento.
      2. Corte a ponta de uma pipeta de 200 μL usando pinças de garra e colete 16-32 corpos embrióides em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Transfira os corpos embrióides em 67 μL do meio para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 100 μL de gel de matriz extracelular usando uma ponta de pipeta cortada de 200 μL e misture suavemente.
      4. Distribua uniformemente os corpos embrióides em um prato de 6 cm e coloque a placa por 5-10 min para permitir que o gel da matriz extracelular se solidifique.
      5. Adicione cerca de 4 ml de meios de diferenciação e incube a 37 °C, 20% de O2 e 5% de CO2. No dia seguinte, coloque o prato em um agitador orbital (84 rpm). Certifique-se de que todos os corpos embrióides se desprendam do fundo. Caso contrário, use uma ponta de pipeta cortada e um meio para soltá-los com cuidado.
    3. Método de incorporação 2: Incorporação líquida
      1. Descongele uma alíquota de gel de matriz extracelular não diluído no gelo por 1-2 h e coloque os meios de diferenciação no gelo. (Crítico) A mídia deve estar gelada ao adicionar gel de matriz extracelular.
      2. Quando o meio estiver frio, adicione gel de matriz extracelular à concentração final de 2%. Corte a ponta de uma pipeta de 200 μL usando pinças de garra e transfira até 24 corpos embrióides para um poço de uma placa de 6 poços.
      3. Remova todo o excesso de mídia e adicione cerca de 4 mL de gel de matriz extracelular a 2% / meio de diferenciação em um poço de uma placa de 6 poços. Coloque imediatamente a placa no agitador orbital (84 rpm).
  5. Dia 9-20: Realize uma troca completa de mídia usando mídia de diferenciação a cada 3-4 dias.
  6. Dia 21-30: Transfira organoides para meios de maturação e realize trocas completas de meios a cada 3-4 dias.
  7. Dissociação de organoides: Para núcleos únicos e dissociação celular, use organoides de alta qualidade. Para evitar quantidades excessivas de morte celular, corte regularmente os organoides para evitar o acúmulo de um núcleo necrótico e permita que eles se recuperem por 2 semanas antes de dissociá-los para análise posterior.

2. Derivação de uma única célula a partir de organoides

NOTA: A dissociação de célula única é realizada usando o Kit de Dissociação de Tecido Neural (Tabela 2), que usa dissociação mecânica e enzimática. Aqui descrevemos uma dissociação mecânica manual. Como alternativa, uma máquina de dissociação pode ser usada.

  1. Prepare a solução STOP e 0,04% BSA no gelo. Prepare a mistura de enzimas 1 e 2 e 0,04% de BSA em PBS e coloque no gelo.
  2. Colete até 5 organoides em um poço de uma placa de 6 poços e aspire o excesso de meio e lave uma vez com PBS para remover o meio de cultura. Coloque os organoides no meio do poço e, usando um bisturi, pique bem os organoides.
  3. Adicione a mistura enzimática 1 e coloque a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2, agitando a 90 rpm por 10-15 min.
  4. Usando uma ponta de pipeta de 1000 μL, ressuspenda os organoides pipetando até 10x. Adicione a mistura enzimática 2 e misture bem pipetando usando uma ponta de pipeta de 1000 μL. Colocar a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2, agitando a 90 rpm durante 10-15 min.
  5. Pare o processo de dissociação ressuspendendo a solução celular em 10 mL de solução STOP fria. Solução de célula filtrante usando um filtro de células de 70 μM. Centrifugue a solução de célula filtrada durante 10 minutos a 300 x g a 4 °C para formar um sedimento.
  6. Aspirar meio, deixando um pellet celular e ressuspender as células em 4 mL de frio 0,04% BSA. Filtre a solução de células usando um filtro de células de 40 μM e conte as células usando um contador de células.
  7. Centrifugue a solução celular durante 10 minutos a 300 x g a 4 °C. Aspirar a solução de BSA, deixando um sedimento de células. Ressuspenda as células de acordo com um manual do kit snRNA-seq baseado em microfluídica em meio NSB+.

3. Isolamento de núcleos únicos de organoides

  1. Transfira organoides para PBS resfriado e corte cada organoide em 4 pedaços. Lave os organoides 2x com PBS resfriado.
  2. Corte com uma tesoura a ponta da pipeta de uma pipeta de 1000 μL e transfira os pedaços organoides para um douncer de 2 mL. Aspire PBS completamente e adicione 1 mL de tampão de lise NP40.
  3. Dounce 3x com pilão de dounce A e 3x com pilão de dounce B. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o douncer com mais 1 mL de tampão de lise NP40 e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL. Incubar por 5 min em RT e, posteriormente, centrifugar a suspensão por 5 min a 500 x g.
  4. Aspirar sobrenadante deixando 50 μL de sobrenadante para trás. Adicione 1 mL de NSB+ sem perturbar o pellet. Ressuspender após 5 min de incubação.
  5. Suspensão da camada no topo de um gradiente de Percoll (camada inferior: 1 mL de NSB + e 250 μL de Percoll, camada intermediária: 1 mL de NSB+ e 188 μL de Percoll, camada superior: 1 mL de NSB+ e 125 μL de Percoll). (Crítico) Execute as camadas com muito cuidado para evitar a mistura de camadas.
  6. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C, aspirar o sobrenadante e ressuspender em NSB+. Filtrar a solução dos núcleos utilizando um filtro de células de 40 μM.
  7. Corar e contar núcleos usando DAPI e uma câmara de Neubauer. Ressuspenda os núcleos de acordo com um manual do kit scRNA-seq baseado em microfluídica.

4. Preparação e sequenciamento da biblioteca

  1. Carregue 10.000 células e núcleos em um sistema microfluídico e gere a biblioteca de acordo com o manual do kit scRNA-seq baseado em microfluídica (Tabela de Materiais).
  2. Sequencie as bibliotecas com uma estimativa de 6 x 108 leituras por biblioteca snRNA-seq e 1,6 x 108 leituras por biblioteca scRNA-seq, resultando em uma saturação de sequenciamento de 87% para o conjunto de dados snRNA-seq e 36% de saturação de sequenciamento para o conjunto de dados scRNA-seq.

5. Análise

  1. Realize a análise do sequenciamento usando um pipeline de análise de dados para scRNA-seq e snRNA-seq e alinhe-o com o genoma GRCh38 humano. Sujeite a matriz de contagem gerada por esse pipeline a uma análise mais aprofundada usando o pacote R Seurat (versão 4.1.1)25.
  2. Crie o objeto Seurat considerando genes que foram representados em pelo menos 5 células e incorporando células que continham pelo menos 300 genes. Execute filtragem de controle de qualidade adicional retendo células que continham mais de 1000 genes, mas menos de 4000 genes para o conjunto de dados scRNA-seq e mais de 800, mas menos de 4000 genes por núcleo para o conjunto de dados snRNA-seq. Exclua conjuntos de dados, células e núcleos que excedam 5% de leituras mitocondriais.
  3. Para mitigar os efeitos em lote entre os dois métodos, integre os dois conjuntos de dados filtrados, normalize e visualize por meio de Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Omita o cluster 1 que exibe baixo identificador molecular único (UMI) e contagem de genes. Posteriormente, para os clusters, atribua identidades celulares com base em genes marcadores conhecidos e no conjunto de dados organoides de 30 dias de Ana Uzquiano et. al. (Arquivo de Codificação Suplementar 1)18.

Results

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Para investigar a composição do tipo celular de organoides cerebrais usando scRNA-seq e snRNA-seq, os organoides cerebrais foram colhidos após 30 dias de cultivo, pois os organoides nesta fase já exibem alças neuroepiteliais consistindo de progenitores cercados por progenitores intermediários e neurônios em estágio inicial 4,18. Monitorar a qualidade dos organoides ao longo do crescimento e cultura é essencial para obter dados confiáveis de célula única e núcleo único.

Os organoides são formados através da agregação de iPSCs em corpos embrióides (Figura 1B, C). Após a montagem, espera-se que esses corpos embrióides exibam bordas claras com detritos celulares mínimos (Figura 1C). Após a indução do neuroectoderma, os corpos embrióides manifestam um brilho observável ao redor da superfície com uma região interna comparativamente mais escura, indicando indução neural bem-sucedida (Figura 1D). Nas semanas seguintes, os organoides desenvolvem as chamadas alças, estruturas neuronais semelhantes a rosetas, compostas principalmente de células neuroepiteliais (Figura 1E, F). Embora esses organoides possam ser mantidos em cultura por vários meses, deve-se notar que, com seu tamanho crescente, há um aumento correspondente da morte celular na parte interna dos organoides devido à falta de nutrientes e disponibilidade de oxigênio, resultando no desenvolvimento de um núcleo necrótico.

A fim de explorar a diversidade celular dentro de organoides corticais por meio de análise de sequenciamento, isolamos células únicas e núcleos de organoides. Para equilibrar a heterogeneidade inerente dentro de um único lote de organoides cerebrais, realizamos o sequenciamento de quatro organoides agrupados de um lote. Além disso, para fins comparativos entre os processos de isolamento e para remover os efeitos de lote entre a biblioteca de snRNA-seq e scRNA-seq, esses organoides foram divididos em metades (oito metades no total; Figura 2). Após o isolamento enzimático de células individuais, é crucial garantir que a viabilidade celular permaneça acima de 80%, observando que as células mantêm uma morfologia arredondada (Figura 3A, B). Da mesma forma, o isolamento mecânico de núcleos individuais deve produzir núcleos intactos de tamanhos variados com detritos detectáveis mínimos ou inexistentes (Figura 3C, D).

A análise de sequenciamento revelou que mais células do que núcleos foram capturadas e sequenciadas. Ambos os conjuntos de dados mostraram uma boa qualidade avaliada pela alta contagem de genes e UMI por célula e núcleo, e a baixa porcentagem de leituras mitocondriais (Figura 4A-C). Como esperado, as leituras mitocondriais e ribossômicas compreendem uma fração maior do total de leituras recuperadas no conjunto de dados scRNA-seq em comparação com o conjunto de dados snRNA-seq. No conjunto de dados scRNA-seq, a maioria das células continha menos de 30% de leituras ribossômicas, enquanto no conjunto de dados snRNA-seq, a maioria dos núcleos continha menos de 5% de leituras ribossômicas. Além disso, a maioria das células capturadas no conjunto de dados scRNA-seq contém menos de 5% de leituras mitocondriais. Depois de filtrar as leituras mitocondriais, cerca de 10.000 células e 3.000 núcleos ultrapassaram o limite de qualidade.

A análise integrativa de ambos os conjuntos de dados revelou que todos os clusters estão representados em ambos os conjuntos de dados, indicando que ambos os métodos recuperam os mesmos tipos de células (Figura 5A, C). A anotação do conjunto de dados mostra que as principais populações de células compreendem glia radial, progenitores intermediários, progenitores subcorticais e neurônios, bem como neurônios de projeção da camada profunda recém-nascidos e tipos de células menos representados, como Cajal-Retzius, a bainha cortical e células do plexo coróide (Figura 5B). No geral, scRNA-seq e snRNA-seq podem recuperar todos os tipos de células que se espera estarem presentes em um organoide cerebral de 30 dias20.

Formação do corpo embrióide até a linha do tempo de maturação; imagens de microscopia; estágios de diferenciação celular.
Figura 1: Geração de organoides cerebrais a partir de iPSCs. Curso do tempo de geração de organoides cerebrais (A). Imagens exemplares de uma diferenciação cortical bem-sucedida de iPSCs (B), que formam corpos embrióides (72 h após a semeadura) (C) e mostram uma indução neural bem-sucedida após 7 dias de cultivo (D). Organoide descreve loops distintos no dia 15 (E) e no dia 30 (F). Barra de escala: BD 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama de sequenciamento de RNA de célula única e núcleo; dissociação enzimática, método do gradiente de Percoll.
Figura 2: Fluxo de trabalho para obter células únicas e núcleos únicos de organoides cerebrais. A dissociação de organoides em células únicas é conduzida picando organoides com um bisturi, seguido por uma digestão enzimática (topo). O isolamento dos núcleos é conduzido por dissociação mecânica, seguida de purificação por meio de um gradiente de Percoll (fundo). A suspensão de célula única e núcleos é filtrada e carregada em um sistema microfluídico para geração e sequenciamento de bibliotecas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de microscopia celular mostrando várias densidades celulares e padrões de coloração; O método inclui coloração.
Figura 3: Resultados representativos de células e núcleos isolados de organoides com 30 dias de idade. (A) Imagem exemplar de células coradas com azul de tripano tiradas usando um contador de células e (B) close-up correspondente. (C) Sobreposição de imagem de campo claro e fluorescente de núcleos corados com DAPI e (D) close-up correspondente. Barra de escala: 100 μM Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráficos de violino mostrando a variabilidade dos dados por identidade; resultados da análise estatística.
Figura 4: Controle de qualidade de scRNA- e snRNA-seq. Os gráficos de violino ilustram a contagem absoluta de UMI (A), contagem de genes (B), leituras mitocondriais (C) e ribossômicas (D) de células (azul) e núcleos (rosa-roxo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diagrama UMAP mostrando clusters scRNAseq e snRNAseq, análise de expressão gênica em células neuronais.
Figura 5: scRNA-seq e snRNA-seq recuperam populações de células semelhantes em organoides de 30 dias. UMAP incorporado integrado de organoides de 30 dias, mostrando resultados de scRNA-seq (azul) e snRNA-seq (rosa-roxo) (A), perfis integrados e anotados e individuais de scRNA-seq e snRNA-seq (B,C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Meios de cultura celular e componentes de revestimento Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Tampões de dissociação para scRNA e snRNA-seq. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo de codificação suplementar 1: Arquivo de codificação usado para analisar os dados scRNA-seq e snRNA-seq. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

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A análise transcriptômica de células únicas e núcleos únicos emergiu como uma ferramenta fundamental para a compreensão dos mecanismos reguladores de genes em tecidos complexos. Ambos os métodos permitem estudos de transcriptoma de organoides cerebrais. Para garantir um experimento geral bem-sucedido, a qualidade do material de partida é de alta relevância. Portanto, é necessário cortar os organoides regularmente para evitar a formação de um núcleo necrótico26. Também é possível eliminar esse problema com uma cultura de interface ar-líquido27. Para reduzir os efeitos de lote devido à heterogeneidade dos organoides, sugerimos o uso de pelo menos quatro organoides por extração. Alternativamente, é possível realizar várias execuções de sequenciamento de organoides individuais, o que também permite o exame da variabilidade dentro do mesmo lote17. Ao usar os dois métodos, scRNA-seq e snRNA-seq, em paralelo, cortar organoides em dois e dividi-los para cada método pode reduzir ainda mais as diferenças causadas pela heterogeneidade do organoide.

Para obter um perfil transcriptômico de boa qualidade de uma célula ou núcleo individual, é crucial que a membrana celular ou nuclear permaneça intacta durante todo o procedimento. Portanto, é crucial otimizar tanto a concentração da enzima quanto o tempo da digestão enzimática, que precisam ser ajustados à idade e ao tamanho do organoide. Além disso, é essencial usar as temperaturas e velocidade de centrifugação corretas e evitar pipetagem agressiva. Em caso de baixa viabilidade, um kit de remoção de células mortas pode ser usado após a dissociação dos organoides em células únicas. Complementarmente, para o isolamento dos núcleos é vital lavar cuidadosamente o organoide com PBS e adaptar o número de golpes com o douncer ao tamanho do organoide. Também é importante colocar cuidadosamente o gradiente de Percoll em camadas para evitar distúrbios nas camadas. Se os núcleos danificados permanecerem após o isolamento, é aconselhável implementar uma etapa de classificação por meio da classificação de células ativadas por fluorescência22. No geral, o uso de inibidores de RNAse é vital para todas as etapas, desde a dissociação da amostra até a geração de bibliotecas, para preservar o RNA de alta qualidade de cada célula ou núcleo.

Neste estudo, o scRNA-seq produziu mais células, permitindo uma visão geral mais ampla das populações de células. Além disso, as células contêm mais RNA e são mais fáceis de enriquecer para tipos específicos de células por meio de marcadores de superfície em comparação com os núcleos. No entanto, a dissociação unicelular depende de um processo enzimático que pode induzir a transcrição de RNAs relacionados ao estresse19,28. Especialmente em doenças associadas a uma resposta aumentada ao estresse, isso pode resultar em artefatos induzidos por dissociação20. Além disso, foi demonstrado que o isolamento de uma única célula resultou na perda de populações de células sensíveis 3,29. Embora isso possa não ser evidente neste estudo, é um resultado possível ao usar organoides cerebrais mais antigos, caracterizados por uma maior diversidade celular.

Como ambos os conjuntos de dados recuperam as mesmas populações de células, a escolha do método de isolamento depende fortemente de questões de pesquisa, aquisição de tecidos e gerenciamento de tempo. Embora após a dissociação a fixação e o armazenamento de células individuais de organoides cerebrais em metanol estejam bem estabelecidos30, o isolamento de núcleos únicos de organoides cerebrais congelados ainda requer otimização.

No geral, nossos protocolos fornecem uma plataforma versátil e adaptável para investigar o perfil transcriptômico de células e núcleos individuais em organoides cerebrais, abrindo caminho para investigações aprofundadas de questões relacionadas ao desenvolvimento e doenças nos modelos cerebrais humanos in vitro.

Disclosures

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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Agradecemos a Valeria Fernandez-Vallone pelas instruções originais para o kit de dissociação neural Miltenyi. Também agradecemos à Plataforma de Tecnologia Genômica do Max Delbrueck Centrum por fornecer a receita para o tampão de lise NP40 e conselhos valiosos para configurar este protocolo. Também agradecemos a Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff pelo apoio organizacional do laboratório.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
Tubos de baixa ligação de DNA de 1,5 ml Tubo de microcentrífugaVWR525-0130
10x Cellranger pipeline Pipline de análise
15 ml FalconTubo de centrífugaFalcon
2-Mercaptoetanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml Tubode centrífugaFalcon
A83-01Bio Technologies379762
Solução antibiótica/antimicótica (100X)Life Technologies15240062
Suplemento B-27 PlusLife Technologies17504044
Suplemento B-27 sem vitamina ALife Technologies12587010
Albumina de soro bovino, livre de ácidos graxos (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Filtro de células 40 µ mNeolab352340
Filtro de células 70 µ m (branco) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Próximo Kit de Acessórios GEM10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Completo,  Inibidor de Protease sem EDTA CocktailRoche 11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Conjunto de moedor de tecidos Dounce 2 mL completoSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Soro fetal bovino livre de tetraciclina (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex (revestimento)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociação masquina
GlutaMAX suplementosLife Technologies35050038
Heparina sódica cultura de células testadasSigmaH3149-10KU
humano recombinante BDNFStemCell Technologies78005.3
humano recombinante GDNFStemCell Technologies78058.3
Solução de insulina HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout substituição do soroLife Technologies10828028
LDN193189 Cloridrato 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM aminoácido não essencial (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Cloreto de magnésio (1M) Thermo livre de RNAse ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276meio de células-tronco
mTeSR1StemCell Technologies85850meio de células-tronco
N2 Suplemento StemCell Technologies17502048
Kit de Dissociação de Tecido NeuralMiltenyi Biotec BV & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
Sistema NextSeq500SequenciadorIllumina
NP-40 Surfact-Amps Solução DetergenteLife Technologies28324
PBS Dulbecco' sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicilina - Estreptomicina)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Inibidor de Rocha (Y-27632 dicloridrato) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Cloreto de sódio NaCl (5M), sem RNase-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401meio de células-tronco
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368meio de células-tronco
TC-Platte 96 Bem, fundo redondoSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, sem vermelho de fenolLife Technologies12604013Reagente à base de tripsina
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Ciências da vidaBML-WN100-0005
Falcon

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