Method Article

Usando um sistema de perfusão tecidual in vitro para detectar as atividades funcionais de tubos intestinais isolados em tempo real

DOI:

10.3791/66243

⸱

July 26th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical and Life Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Chengdu Integrated TCM and Western Medicine Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um método para isolar tubos intestinais de ratos e avaliar o impacto dos medicamentos em sua tensão, frequência e amplitude in vitro. Este método oferece uma abordagem valiosa para pesquisadores que investigam tubos intestinais.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As doenças gastrointestinais, que têm alta incidência, representam desafios consideráveis para os seres humanos. O intestino delgado é parte integrante da digestão e absorção de alimentos e medicamentos e desempenha um papel crucial no tratamento dessas doenças. O experimento de movimentação do tubo intestinal, um método in vitro comum e essencial, é utilizado para estudar a dinâmica gastrointestinal. Isso inclui a preparação do tubo intestinal isolado, bem como a suspensão do tubo intestinal preparado no banho e sua conexão a um detector de sinal. Segue-se o registro e análise de uma série de parâmetros, como a tensão, que pode ser usada para avaliar a função motora intestinal, bem como considerações para manter o tubo intestinal ativo in vitro. O programa padronizado desde a amostragem até a coleta de dados melhora muito a repetibilidade dos dados experimentais e garante a autenticidade do registro da tensão intestinal após intervenção fisiológica, patológica e medicamentosa. Aqui apresentamos os principais problemas na operação experimental e um valioso protocolo experimental de referência para estudar drogas que regulam a motilidade gastrointestinal.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As doenças gastrointestinais, uma condição prevalente, afetam gravemente a vida e a saúde humanas1. O distúrbio da motilidade gastrointestinal é uma parte importante das doenças gastrointestinais funcionais, manifestando-se principalmente em sintomas debilitantes, retardo do esvaziamento gástrico e problemas gástricos graves2. Pode atrapalhar a coordenação gastrointestinal, dificultar o esvaziamento gástrico, impactar a intolerância alimentar intestinal e até causar obstrução funcional no intestino delgado ou grosso3. Para pacientes submetidos a cirurgia gastrointestinal, esse distúrbio pode levar diretamente à insuficiência intestinal. Além disso, o distúrbio intestinal não está relacionado apenas a doenças gastrointestinais, mas também aos fatores patogênicos de várias outras doenças, como hepatite e doenças do sistema nervoso central. As comunidades microbianas intestinais desempenham um papel regulador crucial na fisiologia intestinal, incluindo a motilidade, que subsequentemente influencia a colonização dentro do ecossistema microbiano4. À medida que a infecção pelo vírus da hepatite B progride para hepatite B crônica, há vários graus de alterações na flora intestinal. A modulação da flora intestinal tem demonstrado benefícios no tratamento do vírus da hepatite B5. Além disso, o sistema nervoso central pode influenciar o intestino e alterar sua composição microbiana. Avanços recentes na tecnologia de sequenciamento da microflora descobriram interações bidirecionais entre a microflora intestinal e a função do sistema nervoso central, intimamente associadas à ocorrência e progressão de doenças do sistema nervoso central 6,7.

Com o envelhecimento da sociedade, a incidência de distúrbio da motilidade gastrointestinal está aumentando, ligada ao declínio ou perda da função neuronal no sistema nervoso entérico e na inervação intrínseca do intestino8. À medida que nossa compreensão das doenças gastrointestinais se amplia, surgem inúmeras novas ideias e abordagens, potencialmente levando ao desenvolvimento de novos medicamentos. No entanto, muitas dessas ideias ainda são hipotéticas ou aguardam resultados positivos de ensaios clínicos para sematerializarem 9,10. Métodos de pesquisa eficazes são cruciais para superar doenças gastrointestinais. Nos últimos anos, uma extensa pesquisa se concentrou em medicamentos gastrointestinais e regulação da motilidade. Drogas gastrointestinais e dinâmica gastrointestinal são inseparáveis, e muitas outras drogas sistêmicas têm efeitos variados na dinâmica gastrointestinal. Por exemplo, anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são usados para dor e inflamação e movimentos gastrointestinais lentos, aumentando o risco de úlcera péptica11. Por outro lado, alguns antidepressivos podem afetar a motilidade gastrointestinal12. Atualmente, o principal experimento farmacológico in vitro que estuda os efeitos de drogas gastrointestinais e outras drogas sistêmicas na motilidade gastrointestinal é o ensaio de movimento intestinal in vitro 13. Ao simular condições fisiológicas, eles observam o impacto direto das drogas na contração e relaxamento da musculatura lisa intestinal, avaliando seus efeitos gastrointestinais. No entanto, a causa precisa dos distúrbios da motilidade gastrointestinal permanece obscura, provavelmente uma interação complexa de fatores genéticos, ambientais, dietéticos e neuroendócrinos. Consequentemente, o tratamento dos distúrbios da motilidade gastrointestinal continua a apresentar desafios significativos.

O intestino delgado, sendo um local crucial para a digestão, absorção e metabolismo de drogas, tem importância na função gastrointestinal. Como resultado, o teste de movimento isolado do tubo intestinal é uma ferramenta essencial para o estudo de doenças gastrointestinais. Isso envolve preparar e colocar o tubo intestinal isolado do animal em um banho, conectá-lo a um trocador de energia, utilizar um transdutor para converter movimentos mecânicos em sinais elétricos para amplificação e registrar por um gravador fisiológico. Vários parâmetros, como frequência, amplitude média de vibração, tensão e área sob a curva, podem ser medidos para avaliar a função motora do tubo intestinal. Este método oferece vantagens como simplicidade, viabilidade econômica, fácil controle das condições experimentais, fatores de influência mínimos, alta reprodutibilidade e resultados precisos e confiáveis. Além disso, é particularmente útil para investigar o mecanismo de ação do medicamento. No entanto, existem desafios notáveis na operação do experimento do tubo intestinal isolado, por exemplo, a atividade intestinal é difícil de manter por muito tempo. Para abordar essas questões e aproveitar as experiências em experimentos in vitro , este artigo fornecerá uma introdução detalhada aos principais problemas na operação experimental e apresentará um protocolo experimental de referência valioso para estudar drogas que regulam a motilidade gastrointestinal.

Protocol

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Esse protocolo é derivado da literatura publicada anteriormente 14,15,16,17. Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de idade) foram utilizados para o presente estudo. O protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Gestão da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Registro nº 2023017). Antes do experimento, os ratos foram instruídos a jejuar por 24 horas. Durante o experimento, os ratos foram mantidos em uma câmara de animais e tiveram livre acesso a comida e água.

1. Preparação da solução

  1. Prepare uma solução salina fisiológica (PSS) contendo 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgCl2∙6H2O, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glicose e 5 mM de HEPES (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Saturar as soluções e borbulhar com um gás misto de 95% de O2 e 5% de CO2. Enquanto isso, mantenha os valores de pH da solução entre 7,38 e 7,42 com 2 mM de NaOH.
  3. Pré-arrefecer 1/3 do PSS a 4 °C e pré-aquecer o restante a 37 °C para experiências subsequentes.
    NOTA: o PSS foi originalmente preparado à temperatura ambiente nas etapas 1.1-1.2

2. Dissecção do canal intestinal de ratos

  1. Reúna placas de Petri cheias de PSS a 4 ° C, pinças cirúrgicas e tesouras. Administrar isoflurano a 2% para anestesiar o rato por inalação por aproximadamente 5 min. Verifique se o rato está profundamente anestesiado realizando um teste de pinça do dedo do pé. Se necessário, administre anestésicos adicionais. Em seguida, exponha o canal intestinal abrindo a cavidade abdominal em uma mesa de operação.
  2. Coloque rapidamente os tubos do estômago e do intestino em uma placa de Petri cheia de 4 ° C PSS (pH 7,40) com 95% de O2 e 5% de CO2 saturado. Localize o duodeno, que é o início do intestino delgado, no piloro do estômago. Usando uma pinça, levante delicadamente o tecido adjacente e corte-o cuidadosamente da borda do intestino com uma tesoura. Posteriormente, divida o intestino em segmentos de 1-2 cm; todo esse processo é ilustrado na Figura 1.

3. Suspensão e fixação do canal intestinal (Figura 2)

  1. Ligue o sistema de perfusão tecidual in vitro e ajuste a temperatura do banho no instrumento para 37 °C. Coloque o PSS (37 °C) no banho.
  2. Prepare uma sutura cirúrgica de 15 cm (consulte a Tabela de Materiais) e mergulhe-a em PSS a 4 ° C saturado com 95% de O2 + 5% de CO2. Usando a sutura, prenda uma extremidade do canal intestinal e use um gancho de agulha de aço para prender a outra extremidade.
  3. Instale o tubo intestinal. Monte o segmento com o gancho de agulha de aço na parte inferior do banho e prenda a outra extremidade da linha cirúrgica ao transdutor. Ligue o interruptor de gás para permitir que bolhas surjam no banho.
  4. Abra o software de aquisição de dados (consulte a Tabela de Materiais) e clique em Iniciar para garantir que o sinal do caminho correspondente esteja sendo registrado.

4. Normalização

  1. Gire o eixo espiral do banho no sentido anti-horário para relaxar os tubos intestinais ao seu estado natural. Clique em Setup-Zero All Inputs para garantir que a tensão inicial do tubo intestinal seja definida como 0 g no software.
  2. Gire o eixo espiral do banho no sentido anti-horário para puxar o valor da tensão para 1 g e estabilizá-lo no pH = 7,40, 95% O2 + 5% CO2 saturado 37 ° C PSS por 30 min.
    NOTA: A normalização do tubo intestinal é ajustar sua pré-carga para um estado ideal. Para amostras de cavidade, uma pré-carga ideal foi necessária para manter uma atividade excepcional in vitro. A pré-carga ideal do tubo intestinal de rato foi de 1 g18.

5. Detecção de reatividade

  1. Observe as ondas de contração espontâneas rítmicas no software e prossiga para o próximo experimento, pois isso indica uma resposta suficiente.

6. Observação experimental

  1. Adicione o medicamento de teste (como acetilcolina, etc.) ao banho para estudar o efeito do medicamento na função do tubo intestinal.
    NOTA: O efeito da droga foi avaliado comparando as alterações pré e pós-administração na curva de constrição intestinal. Quando o medicamento é adicionado, é apropriado aumentar a bolha para misturar o medicamento e, em seguida, ajustar a bolha ao normal após a mistura.

7. Análise dos dados

NOTA: O sistema de perfusão tecidual in vitro possui quatro canais que podem realizar simultaneamente testes sobre os efeitos de quatro drogas idênticas ou diferentes em quatro tubos intestinais. Como os parâmetros experimentais e os métodos de análise são os mesmos para todos os canais, um canal é selecionado como exemplo para análise de dados.

  1. Pare o software de aquisição de dados e execute a análise de dados neste software de aquisição de dados. Edite o quadro de dados e selecione os parâmetros de análise da seguinte forma: Clique em Window-Data Pad e escolha a tensão média para o canal.
  2. Selecione a curva de contração antes da administração e clique em Adicionar ao bloco de dados; selecione a curva de contração após a administração e clique em Adicionar ao bloco de dados. O valor médio de tensão antes e depois da administração aparecerá sucessivamente no bloco de dados.
  3. Clique em Window-Data Pad para copiar os dados para outro software de análise estatística (consulte a Tabela de Materiais) para análise estatística.
  4. Analise outros parâmetros, como amplitude média, frequência média e integral (área sob a curva), basta substituir a tensão média pelo respectivo parâmetro, e a operação é a mesma das etapas 6.1-6.3.
  5. Salvar curva de contração: Selecione a curva de contração, clique em Editar-Copiar dados do Labchart para copiar os dados para o software de desenho (consulte a Tabela de Materiais) para desenhar a curva de contração.

8. Tratamento pós-cirúrgico

  1. Após a cirurgia, eutanasiar os animais seguindo os protocolos aprovados institucionalmente.
    NOTA: Para o presente estudo, os animais foram eutanasiados por inalação de excesso de isoflurano.

Results

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A primeira parte do estudo se concentra no processo de separação de tubos intestinais isolados do corpo e conversão deles em tubos de 2 cm in vitro. Esse processo é ilustrado em detalhes na Figura 1. A segunda parte envolve a suspensão e padronização do anel tubário intestinal isolado. O sucesso desse processo é demonstrado na Figura 2, que mostra a contração rítmica automática de um tubo normal. Por fim, o estudo examina os efeitos de agentes contráteis e relaxantes representativos no anel tubular intestinal isolado. Verificou-se que a acetilcolina (0,3 μmol/L) e o cloreto de bário (1,2 mmol/L) aumentaram a tensão nesses tubos, enquanto a atropina (300 μmol/L), a epinefrina (1 μmol/L) e a nifedipina (10 μmol/L) inibiram sua tensão, conforme ilustrado na Figura 3.

Este método introduz principalmente a determinação da função motora do tubo intestinal isolado. Os movimentos intestinais são afetados por vários fatores, e a maioria dos efeitos é exercida por meio de receptores no intestino. No trato gastrointestinal, existem vários receptores, incluindo receptores M colinérgicos, receptores de α e β adrenérgicos, receptores 5-HT, receptores de histamina e receptores de hormônios gastrointestinais19. O espasmo no intestino isolado pode ser causado pela ação da acetilcolina nos receptores M. Esse efeito pode ser bloqueado pela atropina, que atua como um agente bloqueador dos receptores M (Figura 3A). No entanto, o espasmo no músculo liso do segmento intestinal, causado pela entrada de íons bário no cloreto de bário e sua ligação com a calmodulina, não pode ser bloqueado pela atropina (Figura 3B). A epinefrina funciona como um agonista para os receptores α e β ( Figura 3C ). Ele excita o receptor α e o receptor β2 do intestino delgado, resultando no relaxamento do músculo liso e uma contração enfraquecida do intestino delgado. Como resultado, o peristaltismo é retardado e a taxa de absorção é reduzida. Em contraste, a nifedipina impede o fluxo interno de Ca2+ e promove o relaxamento intestinal (Figura 3D). Isso ajuda a aliviar o espasmo intestinal, diminuir a pressão intestinal e facilitar a absorção de água no intestino.

figure-results-1
Figura 1: O isolamento dos tubos intestinais. (A) tubos intestinais em ratos; (B) Os tubos intestinais foram removidos do corpo e colocados em uma placa de Petri contendo solução salina fisiológica a 4 °C; (C) tubo intestinal após a remoção do tecido circundante; (D) tubo intestinal de 2 cm de comprimento usado no experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: O processo de suspensão e padronização dos anéis isolados do tubo intestinal. (A) Sistema de perfusão tecidual in vitro (ver Tabela de Materiais); (B) fixação de ambas as extremidades do tubo intestinal com um gancho de ferro e uma linha cirúrgica em uma placa de Petri contendo solução salina fisiológica a 4 °C; C) Fixar o tubo intestinal num dos banhos contendo uma solução salina fisiológica a 37 °C; (D) dando pré-carga e registrando a forma de onda normal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Efeitos dos fármacos nas trompas intestinais isoladas. Efeitos de (A) acetilcolina (0,3 μmol/L) e atropina (300 μmol/L), (B) cloreto de bário (1,2 mmol/L), (C) epinefrina (1 μmol/L) e (D) nifedipina (10 μmol/L) em tubos intestinais isolados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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A motilidade gastrointestinal é realizada por uma série de contrações e relaxamentos do músculo liso coordenados com precisão. Esse processo envolve contração rítmica de um grupo de grupos musculares, contração coordenada de múltiplos grupos e contração propulsora especial20,21. A ocorrência de distúrbios da motilidade gastrointestinal pode estar associada a disfunções em diferentes níveis, como sistema nervoso central, sistema nervoso autônomo, sistema nervoso entérico e músculo liso gastrointestinal. Essas estruturas teciduais funcionam juntas por meio da liberação de vários neurotransmissores e fatores humorais, que se ligam aos receptores correspondentes para realizar diferentes funções fisiológicas22. Portanto, estudar o mecanismo local de ação do medicamento é essencial, e a realização de experimentos in vitro no intestino delgado pode fornecer informações mais precisas, excluindo a interferência de substâncias estranhas e a regulação do sistema nervoso central.

Amostras isoladas de tubo intestinal de íleo de cobaia, jejuno de coelho e duodeno são comumente usadas em animais experimentais. Além disso, o íleo, duodeno e jejuno de ratos e gatos também podem ser usados para experimentos in vitro . Este método é adequado para tecidos isolados. O músculo liso intestinal tem as características de contração rítmica automática e é afetado pelo plexo nervoso na parede intestinal. Os tubos intestinais isolados de muitos animais podem manter sua função motora espontânea em um ambiente de sobrevivência adequado. O experimento in vitro com tubo intestinal tem as vantagens de operação simples, fácil controle das condições experimentais, poucos fatores de influência, boa reprodutibilidade, resultados precisos e confiáveis, e é mais propício para a discussão do mecanismo de ação do medicamento. Além disso, este método é considerado econômico e viável.

O experimento do tubo intestinal in vitro também tem suas limitações, como o uso de preparações brutas não purificadas da medicina chinesa que contêm impurezas, íons inorgânicos, saponinas e taninos, o que pode afetar a confiabilidade do experimento. Portanto, é necessário avaliar completamente a influência das impurezas e fatores físico-químicos nos resultados experimentais, incluindo o pH do líquido e de várias partículas eletrolíticas e de impurezas. Além disso, é necessário melhorar a estabilidade do instrumento experimental in vitro e da técnica de preservação do tubo intestinal in vitro. Ao projetar experimentos in vitro, é essencial considerar se os medicamentos ou preparações usados atendem aos requisitos desses experimentos (por exemplo, níveis de impurezas).

Nesse método, existem vários cuidados que precisam ser observados. Para começar, o tubo intestinal deve ser removido da cavidade abdominal do rato e embebido em um PSS frio antes do experimento. Além disso, é importante cortar todo o tubo em vários pedaços e armazená-los na geladeira, minimizando qualquer estimulação nos intestinos. Durante o processo de dosagem, é crucial garantir que o tubo de dosagem não entre em contato com a linha na qual o tubo intestinal está suspenso. Além disso, a quantidade de medicamento adicionada ao banho deve ser precisa, e o medicamento não deve ser adicionado à parede do banho ou diretamente ao tubo intestinal para evitar influenciar os resultados. Ao enxaguar o tubo intestinal, deve-se usar uma abordagem suave e evitar o enxágue de alta pressão para evitar a contratura do tecido. Recomenda-se manusear o tubo intestinal com uma pinça e evitar expô-lo ao ar por longos períodos para evitar qualquer perda de atividade.

Este artigo apresenta uma demonstração da metodologia experimental para experimentos isolados com tubos intestinais, utilizando os efeitos de vários medicamentos tradicionais que atuam nos receptores intestinais para ilustrar seu impacto no movimento do tubo intestinal, o que fornece uma abordagem eficaz para investigar o mecanismo de ação de medicamentos que regulam a motilidade gastrointestinal no trato gastrointestinal.

Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Talentos Especiais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu para o "Plano de Promoção de Pesquisa de Talentos de Xinglin e Talentos Disciplinares" (33002324).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetilcolina Sigma, EUAA6625
atropinaSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaIA06501
Cloreto de bárioMacklin Biochemical Co., Ltd., Xangai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA501330
D-glicoseSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA610219
software de desenhoGraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA—
EpinefrinaSigma, EUAE4642
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
Sistema de perfusão tecidual in vitroPowerLab, ADInstruments, AustráliaML0146
KClSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100781
LabChart Professional versão 8.3 ADInstruments, Austrália—
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100288
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100865
nifedipinaMacklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, ChinaAnálise estatística N5087
softwareGraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA—
Suturas cirúrgicasJohnson, EUA—

References

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