Uma abordagem de clonagem perfeita para a construção do vetor de expressão do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

Ming Yang; Lijuan Cui; Xuesha Liu

doi:10.3791/66320

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Uma abordagem de clonagem perfeita para a construção do vetor de expressão do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

1.5K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/66320

⸱

17 de maio de 2024

Ming Yang^*¹^,² , Lijuan Cui^*³ , Xuesha Liu¹

¹College of Life Sciences, China West Normal University, ²Sichuan Sports College, ³Pathology Department, Suining Central Hospital

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.

Resumo

A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.

Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.

O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.

Introdução

Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos¹. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição ^2,3 e recombinação mediada p....