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Artigo de método

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

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DOI:

10.3791/66350

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7 de junho de 2024

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1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um guia passo a passo para a aquisição de um pâncreas suíno para isolamento e purificação de ilhotas.

Resumo

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento emergente para diabetes tipo I; no entanto, é limitado pela correspondência e disponibilidade de doadores. O xenotransplante de ilhotas suínas oferece uma alternativa promissora ao alotransplante, com potencial para produção em larga escala de ilhotas funcionais sob demanda. O rendimento e a viabilidade das ilhotas isoladas são altamente suscetíveis à qualidade do pâncreas doador e ao método de obtenção, particularmente à duração do tempo de isquemia quente. Para melhorar a preservação do órgão e o subsequente rendimento e viabilidade das ilhotas, desenvolvemos um protocolo para perfusão cirúrgica e ressecção do pâncreas suíno. Este protocolo emprega canulação aórtica infrarrenal direta e perfusão de órgãos para minimizar o tempo de isquemia quente e simplificar o procedimento para operadores que não possuem ampla experiência cirúrgica. A perfusão arterial subsequente do pâncreas através da aorta libera o sangue estagnado da microvasculatura, reduzindo assim a trombose e o dano oxidativo ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para perfusão cirúrgica e ressecção do pâncreas suíno, seguido de isolamento e purificação das ilhotas.

Introdução

O diabetes tipo 1 é causado pela destruição autoimune das células beta pancreáticas1. Consequentemente, os pacientes são dependentes de insulina exógena, colocando-os em flutuações glicêmicas de alto risco com episódios de hiper e hipoglicemia2. O alotransplante de ilhotas é uma cura potencial para o diabetes tipo I; no entanto, a disponibilidade limitada de doadores de órgãos pancreáticos continua sendo uma grande barreira para a adoção generalizada do procedimento 2,3. O xenotransplante de ilhotas de doadores suínos é uma alternativa promissora, pois esses animais estão prontamente disponíveis. A otimização e o dimensionamento do isolamento das ilhotas pancreáticas suínas serão essenciais para o progresso do xenotransplante das ilhotas.

Embora várias técnicas de aquisição de pâncreas suíno tenham sido publicadas anteriormente, muitos desses procedimentos descrevem pancreatectomia após indução de morte cardíaca ou exsanguinação 4,5,6,7,8,9,10. Uma grande desvantagem dessas técnicas é a variável tempo isquêmico quente (WIT) que ocorre entre o momento da morte cardíaca e o início da infusão intra-arterial e/ou intraductal da solução de preservação. Mesmo 10 minutos de WIT afetarão negativamente o rendimento e a viabilidade das ilhotas5. A minimização do WIT requer perfusão imediata do pâncreas com uma solução de preservação. Durante a captação de órgãos abdominais, a canulação aórtica seguida de perfusão intracorpórea com solução da Universidade de Wisconsin (UW) é crucial para remover sangue, prevenir trombose intravascular, proteger contra danos isquêmicos e minimizar a lesão celular11,12.

Estudos anteriores demonstraram que, durante a obtenção do pâncreas suíno, a lavagem de baixa pressão do tronco celíaco e da artéria mesentérica superior com solução UW melhora o rendimento e a pureza das ilhotas4. No entanto, métodos publicados anteriormente para a aquisição de pâncreas suíno incluem a canulação aberta da aorta, que pode ser tecnicamente desafiadora, principalmente para suínos menores 13,14,15. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado, passo a passo, com recursos visuais que acompanham a perfusão cirúrgica e a obtenção do pâncreas suíno, seguido de isolamento e purificação das ilhotas. Esta nova técnica de canulação aórtica durante o isolamento pancreático foi desenvolvida especificamente para minimizar o WIT e permitir que a captação pancreática seja realizada em um campo sem sangue como meio de maximizar o rendimento e a viabilidade do isolamento das ilhotas.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Divisão de Medicina Comparada da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Porcos Yorkshire adultos com variação de 35 a 35 kg são ideais para este procedimento; no entanto, o protocolo pode ser adaptado para suínos de diferentes tamanhos, dependendo do contexto experimental. Todo o procedimento deve ser realizado de forma estéril em uma configuração de sala de cirurgia.

1. Preparo pré-operatório e anestesia

  1. Sedar o porco com um coquetel de 4 mg/kg de tiletamina e zolazepam, 20 mg/kg de cetamina e 2 mg/kg de xilazina injetados por via intramuscular.
  2. Estabeleça o acesso venoso periférico através da veia auricular.
  3. Induza a anestesia geral com isoflurano inalado a 1% -3% em oxigênio a 100% e intube endotraquealmente o porco.
    NOTA: Pode ser preferível usar propofol ou qualquer outro agente de indução intravenosa em vez de inalante para indução para um procedimento de indução e intubação mais suave. Os sinais vitais, o COexpirado 2, a saturação de oxigênio e a forma de onda cardíaca são monitorados continuamente para avaliar e manter a profundidade da anestesia. O plano cirúrgico abdominal é confirmado por meio de ultrassonografia à beira do leito.
  4. Faça a barba e prepare o porco com gluconato de clorexidina da fúrcula esternal até as virilhas bilaterais.
  5. Cubra o campo operatório com uma visão clara de todo o abdômen (Figura 1A).

2. Configuração operatória e exposição do retroperitônio

  1. Realize uma incisão de laparotomia na linha média (Figura 1B).
    1. Use um bisturi de 10 lâminas e eletrocautério para fazer uma laparotomia na linha média do processo xifóide para o púbis. Tome cuidado para curvar a incisão ao redor da abertura urogenital abdominal inferior.
  2. Execute uma rotação visceral direita.
    1. Exteriorize o cólon direito e o intestino delgado, envolvendo-os em uma toalha estéril.
    2. Retraia suavemente o cólon e o intestino para a esquerda para expor o retroperitônio direito, evitando torção intestinal ou má rotação.
  3. Drene a bexiga (opcional).
    1. Se a bexiga estiver cheia e impactando a exposição, segure a bexiga entre duas pinças DeBakey e use um bisturi de 11 lâminas para incisar a parede ventral da bexiga.
    2. Coloque uma ponta de sucção Yankauer na bexiga para drenar a urina e descomprimir a bexiga.
  4. Configure um afastador abdominal para facilitar a exposição ideal do retroperitônio direito (Figura 1C).

3. Dissecção retroperitoneal

  1. Inicie a dissecção retroperitoneal (Figura 2A).
    1. Usando eletrocautério, incisar o peritônio à direita da linha média, desde o nível do rim direito até a bifurcação aórtica.
    2. Exponha nitidamente a aorta infrarrenal, a veia cava inferior (VCI) e a artéria e veia renais direitas
  2. Obtenha controle circunferencial da aorta infrarrenal distal com uma alça de vaso grande.
  3. Ligue o VCI (Figura 2B).
    1. Obtenha controle circunferencial da VCI infrarrenal média.
    2. Ligue o IVC usando uma gravata de seda 2-0.
  4. Ligue os vasos renais (Figura 2C).
    1. Obtenha o controle circunferencial das artérias e veias renais direita e esquerda.
    2. Ligue essas estruturas usando gravatas de seda 2-0.
    3. Se houver várias artérias renais, isole e ligue cada um desses vasos da mesma forma.

4. Dissecção intratorácica

  1. Incisar o hemidiafragma direito (Figura 3A).
    1. Retraia suavemente o fígado inferiormente para expor o hemidiafragma direito. Aplique duas pinças Allis na porção membranosa do hemidiafragma direito e faça uma incisão no diafragma entre as duas pinças usando eletrocautério.
    2. Estenda a miotomia do diafragma para aproximadamente 7 cm horizontalmente.
  2. Obtenha controle circunferencial da VCI intratorácica (Figura 3B).
    1. Coloque uma gravata de seda 2-0 ao redor da VCI intratorácica. Quebre as extremidades da sutura com um pequeno hemostático sem ocluir a VCI.
  3. Estenda a diamiomiotomia para o hemidiafragma esquerdo (Figura 3C).
    1. Use dois grampos Allis para retrair a borda da diafragmiotomia inferiormente e estender até o hemidiafragma esquerdo.
      NOTA: Evite entrar no pericárdio durante a diafragmiotomia.
  4. Exponha a aorta torácica descendente na região torácica posteromedial esquerda.

5. Canulação da aorta infrarrenal, isolamento visceral e perfusão

  1. Anticoagular sistemicamente o porco.
    1. Administrar heparina sistêmica (100 U/kg) via acesso venoso periférico. Aguarde 3 minutos antes de prosseguir com a canulação da aorta.
  2. Acesse a aorta infrarrenal com agulha de micropuntura 18 G (Figura 4A).
  3. Passe um fio j pela agulha para a aorta e remova a agulha sobre o fio.
  4. Coloque uma bainha de 10Fr sobre o fio na aorta e remova o fio (Figura 4B).
  5. Conecte a tubulação IV à bainha de 10Fr e, de forma estéril, infunda a solução UW através da bainha. Infundir solução UW a uma taxa de 40-60 gotas/min.
    NOTA: O fluxo não começará até que a aorta torácica seja pinçada. Certifique-se de que o tubo intravenoso não esteja em tensão para evitar o deslocamento da bainha intra-aórtica.
  6. Realize isolamento visceral e perfusão em rápida sucessão.
    1. Clampeie a aorta infrarrenal usando uma pinça aórtica.
    2. Clampeie a aorta torácica descendente usando um clamp aórtico.
    3. Amarre a VCI intratorácica com o empate de 2 a 0 colocado anteriormente.
    4. Administre 100 mg / kg de KCl para eutanásia via acesso venoso periférico.
      NOTA: A morte cardíaca começa com a administração de KCl.
    5. Fazer uma venotomia na VCI infrarrenal, superior ao empate 2-0, e inserir sucção com ponta de piscina através da venotomia (Figura 4C).
    6. Perfunda as vísceras com 2-3 L de solução UW fria.
    7. Prossiga com a dissecção para pancreatectomia total durante a perfusão.
      NOTA: As vísceras, e o pâncreas em particular, devem ficar pálidas à medida que a solução de UW é perfundida na região do órgão sólido (Figura 5A).

6. Pancreatectomia total

  1. Libere o intestino delgado da retração enquanto a solução UW está perfundindo.
  2. Comece a dissecção dos lobos duodenal, de conexão e esplênico do pâncreas durante a perfusão visceral. Retraia o estômago superiormente para expor o pâncreas. Com uma combinação de dissecção romba e eletrocautério, disseque o pâncreas de suas inserções omentais.
    NOTA: O corpo do pâncreas envolve efetivamente a veia porta. Tome cuidado para evitar que a veia porta corra posteriormente ao lobo duodenal e depois anteriormente à ponte e aos lobos de conexão.
  3. Isole o ducto pancreático (Figura 5B). Localize o ducto pancreático onde ele entra no duodeno. Ligue o duto usando dois laços de seda 3-0 e passe o duto entre os laços.
  4. Pancreatectomia completa (Figura 5C).
    1. Disseque o restante do lobo duodenal da alça C do duodeno até que ele se mova livremente.
    2. Separe o pâncreas de seus anexos restantes. Ligue e divida cuidadosamente os pequenos vasos da artéria mesentérica superior ao pâncreas.
    3. Separe o pâncreas da veia porta. Disseque o corpo do pâncreas e o lobo de conexão da veia porta. Ligue quaisquer ramos venosos da veia porta para o pâncreas, incluindo a veia esplênica.
      1. Passe a ponte do pâncreas entre o lobo de conexão e o lobo esplênico para permitir a mobilização livre da veia porta.
        NOTA: Tome cuidado para não romper o lobo duodenal pancreático do lobo esplênico.
  5. Mergulhe todo o pâncreas em solução UW estéril fria, colocando o recipiente imediatamente no gelo. Transporte o pâncreas para um capuz estéril para isolamento das ilhotas. Prossiga com o isolamento das ilhotas pancreáticas (Figura 6).

7. Canulação do ducto pancreático

  1. Coloque o pâncreas em uma bandeja estéril com gelo dentro do gabinete de biossegurança.
  2. Disseque o excesso de tecido fibroso e sangue do pâncreas.
  3. Se necessário, corte o duto transversalmente para visualizar melhor o lúmen. Localize e avance a cânula para dentro do ducto com um cateter de tamanho apropriado (16 G).
  4. Prenda o cateter no lugar com um laço de seda 2.0, mas evite ocluir o lúmen.
  5. Preparar três soluções de descontaminação e submergir o pâncreas canulado em cada solução de descontaminação durante 60 s.

8. Perfusão e distensão do pâncreas

  1. Preparar a solução de digestão enzimática (figura 6).
    1. Misture 100 mg de soluções de colagenase 1 e 2 disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes) com a quantidade desejada de 1x HBSS e 10.000 U de solução de heparina. Se o tecido pancreático isolado estiver entre 100 g e 200 g, misture a enzima com 200 mL total de 1x HBSS e solução de heparina.
  2. Infundir o pâncreas com a solução enzimática.
    1. Com força moderada controlada, infundir solução enzimática em bolus de 60 mL no ducto pancreático. Continue este processo até que toda a solução enzimática seja infundida no pâncreas.
      NOTA: A infusão eficaz deve fazer com que o tecido do pâncreas se distenda.
    2. Se alguma solução enzimática vazar do tecido do pâncreas para a bandeja estéril, reinjete essa solução restante no pâncreas na etapa 8.3 ou coloque-a na câmara de Ricordi na etapa 9.2.
  3. Injete diretamente qualquer solução enzimática restante em qualquer segmento de parênquima pancreático mal distendido usando uma agulha de 22 G.

9. Digestão do pâncreas

  1. Coloque o reservatório do circuito contendo 500 mL de 1x HBSS em banho-maria ajustado para 47 °C para pré-aquecer a solução do reservatório.
    NOTA: A solução enzimática funciona de forma ideal a 36-38 °C e esta temperatura deve ser atingida dentro de 5 minutos após o arranque da bomba peristáltica. A temperatura do conteúdo do Ricordi, incluindo o pâncreas com infusão enzimática, é inicialmente de 4 °C. Ao pré-aquecer o reservatório do circuito a 47 °C, o conteúdo do reservatório e da câmara Ricordi se misturará, elevando a temperatura de todo o circuito para 36-38 °C dentro de 5 minutos após a partida da bomba peristáltica.
  2. Remova e descarte o cateter do ducto pancreático e corte o pâncreas em pedaços de ~ 1-3 cm.
  3. Prepare o circuito de digestão. A bomba peristáltica circulará a solução do reservatório do circuito de digestão, através da serpentina de aquecimento e para a câmara Ricordi (Figura 6).
  4. Coloque os pedaços do pâncreas com nove bolinhas de nitreto de silício de 1,5 cm dentro da câmara Ricordi e encha até o nível do filtro com a solução enzimática restante.
  5. Para vedar a câmara Ricodi, coloque o filtro de malha e a junta de borracha, seguidos da tampa na câmara Ricodi. Fixe a tampa da câmara Ricordi apertando os parafusos e certifique-se de que a câmara está bem vedada antes de prosseguir.
  6. Coloque a serpentina de aquecimento em banho-maria quente a 47 °C.
  7. Coloque as cânulas de entrada e saída no reservatório do circuito de digestão contendo 500 mL de 1x HBSS.
  8. Inicie a bomba a uma taxa de fluxo de 450 mL / min até que toda a câmara esteja cheia com a solução de digestão. Diminua a taxa de fluxo para 100 mL/min à medida que o fluido circula dentro do circuito.
  9. Agite manualmente a câmara de digestão para agitar o tecido com as bolinhas de nitreto de silício.
  10. Começando com 8 minutos de digestão, pegue uma amostra de 1 mL do reservatório do circuito para coloração com ditizona (DTZ) para monitorar o progresso da digestão.
    1. Para preparar a coloração DTZ, dissolva 10 mg de DTZ em 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Adicione 10 μL da coloração DTZ preparada a 1 mL da amostra de digestão. Inspecione a amostra com ampliação de 4x. As ilhotas aparecerão de vermelho escuro a preto com coloração DTZ.
      NOTA: A digestão está completa quando a maioria ou todas as ilhotas observadas estão "livres" e intactas, com o tecido acinar disperso em grupos menores.
  11. Quando a digestão for considerada completa, transfira a serpentina para o banho de gelo, remova a cânula de entrada do reservatório e aumente a velocidade da bomba para 210-250 mL / min. Deixe o tecido digerido drenar da câmara de Ricordi para o reservatório do circuito.
    NOTA: É típico ver muito pouco tecido remanescente na câmara de Ricordi após a digestão. Normalmente, <10% do tecido pancreático não digerido permanecerá, embora isso possa variar devido a fatores específicos da amostra.
  12. Pese o tecido restante para determinar a eficiência da digestão. Transfira o tecido digerido do reservatório do circuito para tubos cônicos de 250 mL que são mantidos frios no gelo.

10. Coleta de tecido pancreático

  1. Centrifugue o tecido pancreático digerido em tubos cônicos de 250 mL a 250 × g por 1 min a 4 ° C sem freio.
  2. Retirar os tubos da centrífuga com precaução e aspirar o sobrenadante com uma pipeta serológica, evitando ao mesmo tempo a ruptura do sedimento.
  3. Ressuspenda os pellets em cada tubo cônico suavemente e combine-os em um tubo cônico de 250 mL. Se houver ≤50 mL de tecido, ressuspenda o pellet para um volume total de 100 mL em solução de coleta de ilhotas. Se houver >50 mL de tecido, ressuspenda o pellet até um volume total de 200 mL em solução de coleta de ilhotas. No caso de mais de 100 mL de tecido serem coletados, execute dois ciclos de purificação do processador celular.
  4. Ressuspenda o tecido em meio RPMI para fazer um volume total de 100 mL (assumindo que 50 mL de tecido foram coletados) e carregue no processador de células.

11. Purificação de ilhotas usando o método de gradiente contínuo

  1. Prepare o processador celular de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Carregue 125 mL de solução de gradiente de alta densidade no formador de gradiente contínuo e, em seguida, carregue a solução de gradiente de alta densidade no processador de células usando uma bomba ajustada a 200 mL/min.
  3. Inicie a função de centrífuga do processador de células a 1.000 RPM.
  4. Libere o ar do sistema e reescorve com a solução de gradiente de alta densidade.
  5. Adicione 125 mL de solução de gradiente de alta densidade e 130 mL de solução de baixa densidade ao formador de gradiente.
  6. Carregue os 100 mL de suspensão de tecido digerido.
  7. Aumente a velocidade do processador celular para 2.000 RPM por 3 min.
  8. Preparar 16 tubos cónicos de 50 ml para a recolha de fracções de ilhéus purificadas. Adicione 25 mL de meio RPMI a cada tubo e organize todos os tubos em ordem crescente.
  9. Recolher as fracções purificadas dos ilhéus nos tubos cónicos de recolha preparados.

12. Avaliação e coloração das ilhotas

  1. Coletar alíquotas de 100-200 μL de cada uma das frações de ilhotas purificadas e colocá-las em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para coloração DTZ para avaliar o conteúdo das ilhotas e de cada fração de purificação. Inspecione cada fração usando microscopia de luz com ampliação de 4x. As ilhotas aparecerão de vermelho escuro a preto com coloração DTZ.
  2. Uma vez identificados os ilhéus, selecione as frações com maior teor de ilhéus. Centrifugar a fracção purificada a 250 × g durante 1 min a 4 °C sem travão.
  3. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento do ilhéu em meio de crescimento do ilhéu. Transferir os ilhéus purificados para 1-4 balões de cultura T-125.
  4. Após a purificação, avalie as ilhotas quanto à quantidade, viabilidade e função.
    1. Use um contador de células de ilhotas para avaliar o número de ilhotas e a distribuição de tamanho (Figura 7A). Um pâncreas inteiro normalmente produz 1-2 milhões de equivalentes de ilhotas.
    2. Para coloração de viabilidade, misture 2 μL de calceína AM e 2 μL de homodímero de etídio-1 (CaAM / EthD-1) com 1.000 μL de PBS ( Figura 7B ). Deixe as ilhotas serem coradas por 30 minutos e, em seguida, avalie-as com uma ampliação de menos de 4x ou 10x. As ilhotas viáveis ficarão verdes, enquanto as ilhotas não viáveis ficarão vermelhas.

13. Cultura de células de ilhotas pancreáticas

  1. Durante as 48 h iniciais, cultivar as ilhotas em meio de recuperação a 37 °C para fornecer nutrientes suficientes (~ 1.000 ilhotas / mL de meio de recuperação).
  2. Dos dias 2 a 21, cultivar os ilhéus em meio de crescimento padrão a 37 °C.

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Resultados

A configuração operatória e a laparotomia da linha média são mostradas na Figura 1. A incisão da laparotomia deve ser curvada para evitar a abertura urogenital (Figura 1B). Ao configurar o retrator, prenda o poste do afastador Omni ou Bookwalter no canto inferior esquerdo da mesa. A retração ideal inclui duas lâminas retratoras para a parede abdominal direita, duas para a parede abdominal esquerda e 1-2 para o cólon direito e intestino delgado envoltos em uma to...

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Discussão

O xenotransplante de ilhotas pancreáticas com doadores suínos é uma estratégia promissora para o tratamento do diabetes tipo I. O isolamento das ilhotas é desafiador, e a viabilidade e o rendimento final das ilhotas são altamente suscetíveis à hipotensão e isquemia tecidual encontradas durante a aquisição de órgãos16,17. Para otimizar a captação e preservação do pâncreas, este protocolo apresenta um novo método de canulação aórti...

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Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este manuscrito foi apoiado por uma bolsa de inovação clínica da Mid-America Transplant Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 M NaOH, 100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 a 30 &graus; C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL Tubos cônicosMillipore SigmaCLS430236-6EA
Anfotericina B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
Anti-séptico Povidona Iodo 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient FormerBioRad395
Cloreto de Cálcio dihidratadoThermo Fisher10035-04-8
Processador de Células COBEEbay317690 
Reservatório do circuito de digestão, garrafa Gibco, 1 LThermo Fisher10341001
Dimetilsulfóxido (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Kit de conexão de formador de gradienteBioRad1652008
Heparina [1000 U/mL]Produtos Médicos de Emergência0409-2720-01
Tampão HEPES (1 M), 100 mLThermo Fisher15630080
Albumina Sérica Humana 25%, 100 mLCelprogenHSA2001-25-1
IsofluranoCovetrusItem#:11695067772
CetaminaPattersonItem #:07-894-8462
Liberase (100 mg)Millipore Sigma5401020001
VIVO/MORTO Kit de Viabilidade/CitotoxicidadeThermo FisherL3224
Linfólito 1.1 Meio 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 TubulaçãoMasterfle96419-16
Bomba Peristáltica MasterflexMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg/mL)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/frasco)Dornase Alfa8931278
Meio de Recuperação, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Meio de Cultura Padrão, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (Tiletamina e zolazepam) Injeção CPattersonItem #:07-894-6240
Solução da Universidade de Wisconsin (UW), 3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
Banho-mariaSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinePattersonItem #:07-891-6165

Referências

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