Um modelo de queimadura suína para investigar o processo de cicatrização em múltiplas feridas de queimaduras de profundidade

Resumo

Este protocolo descreve um modelo reprodutível de queimadura de várias profundidades em miniporcos de Yucatán.

Resumo

A cicatrização de queimaduras é um processo complexo e longo. Apesar da vasta experiência, os cirurgiões plásticos e as equipes especializadas em centros de queimados ainda enfrentam desafios significativos. Entre esses desafios, a extensão do tecido mole queimado pode evoluir na fase inicial, criando um equilíbrio delicado entre tratamentos conservadores e remoção de tecido necrosante. As queimaduras térmicas são o tipo mais comum e a profundidade da queima varia de acordo com vários parâmetros, como temperatura e tempo de exposição. A profundidade da queima também varia com o tempo, e o agravamento secundário da "zona de sombra" continua sendo um fenômeno pouco compreendido. Em resposta a esses desafios, vários tratamentos inovadores foram estudados e outros estão em fase inicial de desenvolvimento. Nanopartículas em curativos modernos e pele artificial são exemplos dessas terapias modernas ainda em avaliação. Em conjunto, tanto o diagnóstico de queimaduras quanto os tratamentos de queimaduras precisam de avanços substanciais, e as equipes de pesquisa precisam de um modelo confiável e relevante para testar novas ferramentas e terapias. Dentre os modelos animais, os suínos são os mais relevantes devido às suas fortes semelhanças na estrutura da pele com os humanos. Mais especificamente, os miniporcos de Yucatán apresentam características interessantes, como pigmentação de melanina e crescimento lento, permitindo o estudo de fototipos altos e cicatrização a longo prazo. Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo confiável e reprodutível para estudar queimaduras de múltiplas profundidades em miniporcos de Yucatán, permitindo o acompanhamento a longo prazo e fornecendo um modelo relevante para estudos diagnósticos e terapêuticos.

Introdução

As queimaduras são um grande problema de saúde pública e afetam mais de 480.000 pacientes nos EUA a cada ano, de acordo com o National Burn Repository ^1,2. Isso leva a mais de 50.000 hospitalizações anuais por casos complexos não fatais que requerem cuidados aprofundados². Além disso, as queimaduras são uma causa fundamental de mortalidade e morbidade militar e são responsáveis por 10% a 30% das baixas militares ^3,4. O manejo das queimaduras permaneceu praticamente inalterado por muito tempo, apesar de seus imensos e diversos impactos nos pacientes, variando de físicos a psicológicos e emocionais⁵.

O diagnóstico inicial e a avaliação das queimaduras levam a uma classificação basal de acordo com o tipo de queimadura (primeira, segunda e terceira) ou a profundidade do tecido afetado (superficial, parcial e profunda)^6,7,8. As queimaduras de espessura parcial (primeiro e segundo grau) envolvem a epiderme e diferentes profundidades da derme (derme superficial ou profunda, ou seja, queimaduras superficiais e profundas de segundo grau)⁹. Em particular, danos aos apêndices na derme profunda excluem a possibilidade de reepitelização do epitélio anexial¹⁰. Por definição, as queimaduras de espessura total atingem a gordura subcutânea, a fáscia e/ou o músculo subjacente (queimaduras de terceiro grau) e, às vezes, o osso (também chamadas de queimaduras de quarto grau)^11,12.

Após a hospitalização, os pacientes queimados recebem cuidados especiais envolvendo uma estratégia que consiste em um delicado equilíbrio entre desbridamento e preservação do tecido. O tecido mole danificado e/ou secundariamente infectado precisa ser removido progressivamente até que o tecido saudável seja exposto, permitindo o uso de curativos específicos e enxertos de pele para melhorar o processo de cicatrização 13,14,15,16. No entanto, é necessário cautela durante a cirurgia para evitar a remoção não intencional do tecido em cicatrização e reduzir as complicações para uma recuperação ideal. Biologicamente, as queimaduras exibem uma área necrótica central circundada por uma zona de 'sombra' ou 'estase', indicando isquemia potencialmente reversível. Essa área pode se deteriorar, resultando em uma zona de necrose estendida, ou cicatrizar revertendo o processo apoptótico^17,18. Essa gravidade variável das queimaduras apresenta desafios para os cirurgiões avaliarem com precisão, complicando o equilíbrio entre tratamentos conservadores e excisão cirúrgica¹⁹. Até o momento, nenhuma ferramenta eficiente está disponível para ajudar a caracterizar essa "zona de sombra" que precede a conversão de queima. O desenvolvimento de tais ferramentas é crucial para otimizar esse delicado equilíbrio.

Vários tratamentos foram testados para ajudar a diminuir a conversão secundária de queimaduras. No entanto, nenhuma terapia específica está disponível atualmente na clínica¹⁸. Outros exemplos de avanços no tratamento de queimaduras incluem o desenvolvimento de curativos e nanomateriais modernos^20,21, pele de engenharia de tecidos^22,23 e novas abordagens de cultura epidérmica^24,25. Além disso, a cirurgia reconstrutiva moderna e os retalhos fasciocutâneos melhoraram o manejo dos efeitos posteriores a longo prazo, particularmente as contraturas de queimaduras após a cicatrização patológica das áreas de dobra^26,27. Esses avanços trazem perspectivas promissoras para pacientes queimados, melhorando suas estratégias de tratamento e qualidade de vida, mas resultados recentes mostram que o impacto funcional ainda permanece substancial, tanto na esfera física quanto na psicológica²⁸. Em conjunto, a demanda por avanços inovadores no diagnóstico e tratamento de queimaduras é substancial.

No geral, muitas abordagens visam melhorar o diagnóstico, o manejo e o tratamento de casos complexos de queimaduras, e os pesquisadores precisam de um modelo reprodutível e relevante para testar essas novas abordagens. Devido à sua complexidade biológica, envolvendo vários órgãos e reações sistêmicas, nenhum modelo in vitro se mostrou relevante para o estudo do processo de queimadura²⁹. Modelos de roedores mostraram grandes discrepâncias com humanos devido a grandes diferenças na biologia, arquitetura da pele, elasticidade e falta de aderência às estruturas subjacentes²⁹. Em contraste, o modelo suíno mostrou-se relevante devido à semelhança estrutural da pele suína com a pele humana 30,31,32. Apresenta-se com vascularização, composição de fibras elásticas e tempo de renovação semelhantes. Além disso, o folículo piloso e os anexos apócrinos permitem a reepitelização ilhada, como pode ser observado em queimaduras superficiais clínicas^33,34. Mais especificamente, os modelos de minipig de Yucatán fornecem características interessantes, tornando-os relevantes para o estudo da pele pigmentada³⁵ e resultados de longo prazo com alterações físicas mínimas³⁶.

O objetivo deste artigo é descrever um modelo confiável de queimadura de vários graus em porcos de Yucatán, permitindo o estudo de várias queimaduras de segundo e terceiro graus sobre o mesmo assunto. Isso fornece um modelo relevante e reprodutível para o estudo de inovações diagnósticas e terapêuticas para o manejo de queimaduras. Além disso, este modelo apresenta diferentes tipos e gravidade de queimaduras, um acompanhamento de longo prazo que permite o estudo da contratura da queimadura e cicatrização patológica, e comportamento diferencial da pele pigmentada, que é conhecida por ter características específicas.

Protocolo

Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com a lista de verificação ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments)³⁷ e estava em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC) sob o protocolo #2021N000271. O cuidado humano foi prestado aos animais, seguindo o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório³⁸. Cinco miniporcos fêmeas de Yucatán de 30 kg foram usados para esses experimentos. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Cuidados pré-operatórios e anestesia

1. Jejuar os animais por 12 h antes da anestesia geral.
2. Inicie a anestesia por uma injeção intramuscular de 2-4 mg / kg de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam e 1-2 mg / kg de xilazina, seguida de inalação de isoflurano (2-3% em oxigênio) (ver Tabela de Materiais) para manter a anestesia durante o procedimento.

2. Projeto e randomização de queimaduras

1. Para estudar queimaduras parciais e totais com controles negativos no mesmo animal (sem variação interindividual), crie oito feridas no dorso de cada porco na área paravertebral. Execute três feridas de espessura total, três feridas de espessura parcial e duas feridas de controle.
2. Numere as feridas de 1 a 8 e realize a randomização para alocar diferentes graus de queimadura (espessura parcial, espessura total, controle) para diferentes locais anatômicos nas costas.
   NOTA: A randomização de cada ferida (profundidade e localização) é realizada para melhorar a significância: Sabe-se que a derme do porco varia em termos de espessura e composição de colágeno³⁹. Portanto, a randomização em cada animal é usada para diminuir possíveis vieses.

3. Delimitação da ferida da tatuagem

NOTA: O primeiro procedimento consiste na criação de tatuagens circulares no dorso do porco para localizar e numerar as feridas aleatórias (Figura 1). Isso é realizado dois dias antes do procedimento inicial de queimadura para permitir uma melhor aclimatação, mas pode ser realizado no dia do procedimento de queimadura.

1. Após a anestesia (ver Passo 1) e intubação orotraqueal em decúbito dorsal⁴⁰, coloque o porco em decúbito ventral e coloque cunhas macias (lençóis) sob o animal para seu conforto e estabilização (sob os membros anteriores, a região umbilical e os membros posteriores)⁴¹. Coloque um cobertor de aquecimento de ar forçado na cabeça e no pescoço do animal para manter a temperatura corporal adequada.
2. Coloque uma linha reta no centro do dorso do porco para permitir a simetrização dos desenhos.
3. Desenhe duas linhas verticais usando uma caneta dermográfica (ver Tabela de Materiais) em ambos os lados da linha central, colocada 6,5 cm lateralmente a ela. As duas linhas laterais serão usadas para colocar o centro dos círculos.
4. Desenhe cada par de círculos de 4,5 cm de diâmetro simetricamente, mantendo uma distância mínima de 4 cm entre dois círculos distintos (Figura 1A).
5. Uma vez feitos os desenhos, execute uma preparação de pele em uma única etapa (iodopovidona 7,5%) para diminuir a flora bacteriana da pele.
6. Realize o procedimento de tatuagem⁴² de oito círculos de 4,5 cm usando uma máquina de tatuagem com agulha, tinta preta estéril e uma agulha esterilizada de 5 pontos (consulte a Tabela de Materiais). O resultado final é apresentado na Figura 1B.
7. No caso de um procedimento de criação de queimaduras retardado, aplique pomada antibiótica tripla nas tatuagens e cubra-as com curativos adesivos transparentes.

4. Criação de feridas de queimadura e curativo avançado

NOTA: As queimaduras serão criadas colocando o bloco de latão em contato com a pele no local dedicado (randomização) por 30 s (invariável). A temperatura determinará a profundidade da queima.

1. No dia do procedimento de queimadura, uma vez que o animal esteja anestesiado e colocado em decúbito ventral, conforme discutido na Etapa 1, coloque blocos cilíndricos de latão em recipientes de aço inoxidável cheios de contas de alumínio (consulte a Tabela de Materiais). Coloque os recipientes em uma placa de aquecimento com temperatura controlada. Defina uma placa de aquecimento para 65 °C (para as queimaduras de espessura parcial) e a segunda para 93 °C (para a queima de espessura total, Figura 2).
   NOTA: O recipiente pode ser mantido seco para evitar queimaduras (2-3 h necessárias para atingir o equilíbrio de temperatura) ou meio cheio de água (30 min para atingir o equilíbrio de temperatura). Se for usada água, os blocos de latão precisam ser completamente secos antes da etapa 4.5 para evitar queimaduras subsequentes devido a queimaduras.
2. Insira um termômetro no cilindro de latão através de sua abertura central para monitorar sua temperatura central e confirme a temperatura da superfície com uma pistola de temperatura. Se necessário, aumente a temperatura da placa de aquecimento para 65 °C ou 93 °C no cilindro, apesar de uma pequena dissipação de calor.
   NOTA: A folha de alumínio pode ser usada para cobrir o recipiente e minimizar ainda mais a dissipação de calor, atingindo a temperatura desejada mais rapidamente.
3. Paralelamente, coloque o animal em decúbito ventral para o procedimento de queima, semelhante ao procedimento de tatuagem (etapa 3.1).
4. Quando o animal estiver pronto em decúbito ventral, prepare a pele em três etapas (iodopovidona 7,5%, solução salina 0,9%, secagem).
5. Segure o bloco de latão com luvas resistentes ao calor e coloque-o no local dedicado à tatuagem, dependendo da randomização. Inicie o cronômetro assim que o bloco de latão tocar a pele. Tenha cuidado para não aplicar mais pressão na pele do que o próprio peso do bloco de latão.
6. Após 30 s, remova o bloco de latão da pele e coloque-o de volta em seu recipiente de aquecimento dedicado. Monitore a temperatura até atingir o alvo e repita o procedimento para todas as feridas.
7. Realize um curativo avançado de várias camadas para garantir a estabilidade do curativo após a recuperação do animal.
   1. Coloque uma gaze impregnada de petróleo em cada local de queimadura, incluindo controles, e cubra-a com uma gaze não tecida seca e um curativo adesivo grande e transparente.
   2. Pulverize uma tintura de solução de benjoim na pele circundante para melhor aderência dos pensos transparentes à pele.
   3. Envolva o animal em curativo adesivo auto-aderente, prestando atenção para não apertá-lo demais (restrição de volumes pulmonares).
   4. Complete o curativo adicionando uma camada final de meia tubular (tamanho adaptado ao animal) (ver Tabela de Materiais). Alternativamente, jaquetas de suínos personalizadas podem ser usadas se o animal não conseguir manter o curativo limpo durante o estudo
   5. Garanta a analgesia correta colocando um adesivo opióide transdérmico (fentanil) no pescoço do animal após injetar uma dose única de buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg, IM) e uma dose única de carprofeno (2-4 mg / kg, IM).
   6. Após cada anestesia, monitore os animais de perto até 2 h após a recuperação. Use uma almofada quente, se necessário, e forneça comida livremente depois que uma posição totalmente em pé for alcançada.

5. Escarotomia de queimadura de espessura total

NOTA: Entre 1 e 3 dias de pós-operatório, os animais receberão excisão cirúrgica de espessura total da escara após as queimaduras de terceiro grau.

1. Após uma preparação semelhante do animal, incluindo anestesia, intubação e colocação do animal em decúbito dorsal, prepare a pele por meio da preparação da pele em três etapas, execute o drapeado estéril nas costas do animal.
2. Realize biópsias por punção de 4 mm (consulte a Tabela de Materiais) na ferida para confirmar o tipo de lesão.
3. Realizar a escarotomia^43,44 por uma incisão circular da escara com lâmina de bisturi estéril (n°15) até atingir a derme profunda.
4. Segure um lado da escara firmemente com um par de pinças de tecido Adson estéreis (com 2/1 dentes) (consulte a Tabela de Materiais) e engate-a para cima para revelar o limite profundo da escara.
5. Continue a escarotomia usando a lâmina do bisturi enquanto permanece no mesmo plano dentro da derme profunda / fáscia subjacente. Uma derme sangrando é considerada um sinal de viabilidade tecidual.
   1. Se uma arteríola for cortada durante o processo, faça uma cauterização mínima usando uma pinça de coagulação bipolar (consulte a Tabela de Materiais). CUIDADO: A cauterização extensa do leito da ferida criada pode resultar em cicatrização atrasada e deve ser estritamente evitada.
6. Coloque um primeiro conjunto de guaze seco no leito da ferida por 5 minutos para aumentar a hemostasia local antes de colocar o curativo definitivo.
7. Cubra as feridas da mesma forma que anteriormente (passo 4.7), com a adição de várias gazes secas para preencher a cavidade. Aplique as mesmas camadas mencionadas anteriormente: spray de benjoim de tintura, curativo transparente adesivo, envoltório autoadesivo, meia tubular.
8. Forneça analgesia trocando o adesivo transdérmico opióide e injetando Caprofeno (2-4 mg / kg, IM).

6. Curativos de acompanhamento

NOTA: Os curativos subsequentes são realizados a cada 2 a 7 dias, dependendo do desenho do tratamento experimental e da tolerância do animal. Os curativos podem ser interrompidos após 21 dias para permitir a reepitelização em ambiente seco e melhorar a tolerância do animal. Alternativamente, se o grupo de tratamento necessitar de um ambiente úmido ou úmido, os curativos podem ser prolongados até o final do estudo. O período de acompanhamento foi estendido por até 10 semanas para estudar os processos de cicatrização agudos e prolongados.

1. Anestesiar o animal por um curto período e colocá-lo em decúbito dorsal com um cone nasal (isoflurano 2-5 L/min).
2. Remova os curativos anteriores e limpe as feridas com soro fisiológico estéril a 0,9% e gaze estéril.
3. Aplicar o tratamento experimental, se aplicável.
4. Da mesma forma, realize biópsias subsequentes durante este procedimento, se necessário para o estudo. O animal deve então receber analgésicos como carprofeno (2-4 mg / kg, IM, efeito de 24 horas).
5. Cubra todos os locais da ferida, incluindo feridas de controle, com gaze impregnada de petróleo ou equivalente, gaze seca e não tecida e curativo adesivo transparente.

Resultados

A Figura 2A,B mostra os resultados de múltiplas queimaduras no dorso de um minipig Yucatàn. As feridas (I) e (VII) são feridas de controle (37 °C). Feridas de segundo grau (II; III e VIII) apresentam vermelhidão intensa e bolhas. Em contraste, feridas de terceiro grau (IV; V; e VI) são pálidos e endurecidos à palpação. Deve-se notar que a ferida VIII parece intermediária entre o segundo e o terceiro grau: para fins de um estudo em andamento, aumentamos o tempo de contato para 45 s a 65 graus. A Figura 2C mostra o aspecto das feridas após a escarotomia no 3º dia de pós-operatório. Uma blisterectomia foi realizada nas feridas de segundo grau, e a excisão "em bloco" do tecido queimado endurecido foi realizada nas feridas de terceiro grau, a fim de criar um leito viável para cicatrização secundária. Uma cauterização mínima do plexo dérmico foi realizada se o sangramento não estivesse parando espontaneamente. As Figuras 2D-F mostram o aspecto das feridas em pontos de tempo subsequentes (Semana 2, Semana 3 e Semana 7, respectivamente).

Os resultados histológicos são mostrados na Figura 3 (H&E, 5,5x e 20x). A pele controle (Figura 3A,B) mostra uma epiderme íntegra (braquete azul), incluindo um estrato córneo (seta azul) aderente ao restante do tecido cutâneo. A derme mostra eosinofilia homogênea rosa-pálida (fibras colágenas e elásticas - asterisco vermelho). As queimaduras de segundo grau (Figura 3D,E) revelam perda do estrato córneo em comparação com os controles (plano de clivagem, correspondente às bolhas). A derme superficial mostra eosinofilia mais forte e fissuras/fraturas dentro das estruturas dérmicas (setas azuis). Os vasos sanguíneos profundos são preservados (seta vermelha). As queimaduras de terceiro grau (Figura 3G,H) mostram lesões extensas com aumento da eosinofilia da derme, desde que fraturas dérmicas graves (setas azuis), atingindo a derme profunda até a hipoderme (vacuidade dos adipócitos, asterisco verde). Finalmente, a coloração tricrômica (Figura 3C,F,I) permite uma melhor avaliação do tecido conjuntivo. Ele usa as diferenças na capacidade de coloração do colágeno desnaturado pelo calor para mostrar a profundidade da queimadura. A Figura 3C mostra claramente as características azuis na derme intacta da biópsia da ferida de controle com a camada epidérmica superior. Isso contrasta com a queimadura de segundo grau (Figura 3F), onde a perda do epitélio é acompanhada pela desnaturação do colágeno na camada superior da derme (asterisco branco). Por fim, a ferida de terceiro grau (Figura 3I) mostra a perda da camada epidérmica com extensa coloração vermelha (seta amarela) da camada dérmica, indicando desnaturação completa do colágeno nessa camada da pele.

Figura 1: Posicionamento da sala cirúrgica, configuração do dispositivo de queimadura e desenho do estudo. O animal é anestesiado, intubado, ventilado e colocado em decúbito dorsal. O bloco de latão é colocado no recipiente pré-aquecido cheio de contas de alumínio +/- água. Um termômetro é colocado centralmente no bloco de latão para permitir o monitoramento da temperatura central. A temperatura desejada depende da profundidade de queima desejada de acordo com o desenho do estudo. Para provocar queimaduras de espessura parcial, recomenda-se um contato de 30 s a 65 °C sem pressão adicional. Para queimaduras de terceiro grau, recomenda-se um contato de 30 s a 93 °C sem pressão adicional. As queimaduras de segundo e terceiro graus devem ser randomizadas para evitar vieses devido à espessura diferencial da pele. A localização da ferida pré-tatuada permite um fácil monitoramento de cada ferida aleatória durante o acompanhamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos dos aspectos da ferida após queimaduras randomizadas de várias profundidades em um Minipig de Yucatán. (A) O procedimento de tatuagem é feito colocando-o no local de todos os 8 pontos da ferida. Cada local é numerado para facilitar o monitoramento. (B) Aspecto das feridas após a criação da queimadura. As feridas I e VII são controles, e as feridas II, III e VIII são feridas de espessura parcial. As feridas IV, V e VI são feridas de terceiro grau. (C) Aspecto das feridas após escarotomia das feridas de terceiro grau em POD3. Uma blisterectomia também foi realizada nas feridas de espessura parcial. (D) Aspecto da cicatrização da ferida no POD14 mostrando um leito limpo das feridas de terceiro grau (II e V) e ilhas de reepitelização dos apêndices cutâneos nas feridas de espessura parcial (III, IV, VI, VII, VIII). (E) Aspecto do processo de cicatrização de feridas no POD21 mostrando contratura dos leitos das feridas de terceiro grau e posterior reepitelização nas feridas de segundo grau. (F) Aspecto das feridas em POD49 mostrando contratura avançada nas feridas de terceiro grau e epitelização subtotal das feridas de espessura parcial com importante hiperpigmentação pós-inflamatória. Observe que as feridas exibidas podem apresentar cicatrizes no local da biópsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados histológicos. Resultados representativos do aspecto histológico das feridas [Microscopia de luz 10x (A,C,D,F,G,I) e 20x (B,E,H); hematoxilina e eosina (A,B,D,E,G,H); Tricrômico de Masson (C, F, I)]. A pele controle (A,B) mostra uma epiderme intacta (braquete preto), incluindo um estrato córneo (seta preta) aderente ao restante do tecido cutâneo. A derme mostra eosinofilia homogênea rosa-pálida (fibras colágenas e elásticas - asterisco vermelho). A coloração tricrômica (C) revela aspecto normal da camada epidérmica e do tecido conjuntivo e das fibras colágenas dérmicas. Queimaduras de segundo grau (D,E) revelam perda do estrato córneo em comparação com os controles (plano de clivagem, removido durante a blisterectomia). A derme superficial mostra eosinofilia mais forte e fissuras/fraturas dentro das estruturas dérmicas (setas azuis). Os vasos sanguíneos profundos são preservados (seta vermelha). O tricrômico (F) revela perda do epitélio, acompanhada de desnaturação do colágeno na camada superior da derme (seta amarela). As queimaduras de terceiro grau (E,F) apresentam lesões extensas com aumento da eosinofilia da derme, desde que fraturas dérmicas graves (setas azuis), atingindo a derme profunda até a hipoderme (vacuidade dos adipócitos, asterisco verde) e extensa coloração vermelha (I, seta amarela) da camada dérmica com tricrômico, indicando desnaturação completa do colágeno. Barras de escala: A, D, G, 500 μm; B,E,H, 100 μm; C,F,I, 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desenho de engenharia do bloco de latão usado para a criação de queimaduras. (A) Ilustração exibindo as dimensões do bloco de latão que foi usado para construir o bloco. Um diâmetro de 40 mm permite feridas de tamanho ideal, permitindo projetar 8 feridas em um minipig Yucatán de 20-30 kg. (B) Diagrama mostrando o aspecto final do bloco de latão com um túnel central permitindo que o termômetro meça a temperatura central do bloco. (C) Imagem destacando o bloco de latão aquecido a 65 ° C, conforme exibido pelo termômetro de mercúrio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A cicatrização de feridas após queimaduras é um processo longo que pode levar vários meses, com várias opções de tratamento e considerações para o atendimento ao paciente ^2,13. Para estudá-lo, é necessário um modelo confiável e reprodutível. Vários modelos animais foram descritos, incluindo principalmente roedores 29,45,46 e suínos ^29,47. O modelo suíno é mais relevante devido às suas semelhanças com a estrutura da pele humana^34,48. O tamanho de um porco adulto significa que várias feridas podem ser realizadas no mesmo animal, aumentando a significância estatística e eliminando a variabilidade interindividual entre os tratamentos experimentais e seus controles⁷. Recomendamos escolher os sujeitos por peso e não necessariamente por idade. O modelo atual permite realizar até 8 feridas, mantendo-se abaixo de 10% da superfície corporal total. Isso permite ficar longe de consequências hemodinâmicas, bem como de dor controlável.

Um ponto crítico está relacionado à raça. Embora a maioria dos protocolos suínos existentes use porcos Yorkshire 29,31,47,48, desenvolvemos o modelo Yucatan Minipig por vários motivos. Em primeiro lugar, esta raça minipig apresenta pouco crescimento ao longo dos meses de acompanhamento^36,49. Isso permite minimizar a variação do tamanho da ferida relacionada ao crescimento e, portanto, uma melhor comparação intraindividual. A menor variação de peso em comparação com os porcos Yorkshire também garante melhor otimização e dosagem dos medicamentos anestésicos. Em segundo lugar, a alta quantidade de melanina é relevante para o estudo das reações pigmentadas da pele a queimaduras e cicatrização, sugerindo melhor aplicabilidade aos fototipos humanos 3 a 6 35,50,51. Rice et al. encontraram diferenças substanciais de cicatrização entre Yucatán e porcos brancos domésticos após dermoabrasões como tratamento para queimaduras químicas⁵². Além disso, fototipos mais altos apresentaram clinicamente maiores taxas de cicatrizes patológicas, como hipertróficas e queloides 53,54,55, embora a raça Red Duroc pareça permanecer a mais precisa para avaliação de cicatrizes hipertróficas ^34,56. Além disso, a epiderme pigmentada em cicatrização também facilita a medição do processo de reepitelização a partir das margens externas, bem como dos anexos. Finalmente, este modelo mostra sinais claros de hiperpigmentação pós-inflamatória (Figura 2D-F), o que também é de interesse para pesquisas futuras. Outros autores usaram esse modelo de minipig para estudar a toxicidade dérmica farmacológica e a fototoxicidade e encontraram valores preditivos impressionantes de segurança e eficácia para desfechos humanos de 89% e 100%, respectivamente⁵⁷. Se essas características enfatizam a relevância do modelo de minipig de Yucatán para o estudo da cicatrização de feridas, a literatura no campo específico de queimaduras permanece pobre. Portanto, pareceu-nos necessário descrever um modelo reprodutível para possibilitar o estudo da cicatrização de queimaduras e das diversas intervenções diagnósticas e terapêuticas.

Protocolos anteriores foram descritos para estudar queimaduras no modelo suíno. Branski et ^al.58 publicaram um modelo em 2008 para queimaduras de contato térmico de espessura total usando uma barra de alumínio aquecida a 200 °C. Sua técnica, inspirada em várias publicações anteriores, implementou uma pressão controlada usando uma seringa de 50 mL presa à barra de alumínio. Embora esse recurso pareça relevante, uma vez que a pressão influencia a extensão das queimaduras, a precisão de seu dispositivo pode não ser exatada (a pressão do operador na própria seringa não é considerada e o nível de pressão é baseado nas mudanças na posição do pistão). Mais recentemente, Kim et ^al.59 e Seswandhana et ^al.60 demonstraram queimaduras reprodutíveis usando um dispositivo personalizado com um dispositivo aquecido eletricamente e controle de temperatura. Ambos os dispositivos incluíam monitoramento de pressão medindo forças descendentes. O ciclo de feedback, conforme descrito por Kim, torna possível manter as temperaturas do núcleo e da superfície durante o contato. Ambos os autores mostraram uma boa correlação entre a profundidade da queimadura e a pressão, enfatizando a importância do controle da pressão. Optamos por não aplicar nenhuma pressão suplementar ao bloco de latão além de seu peso, e a ação do operador é simplesmente estabilizadora. O objetivo foi simplificar o modelo e minimizar o número de variáveis. Fan et ^al.61 descreveram um modelo semelhante usando um ferro de solda modificado preenchido com glicerina, que tem a desvantagem de criar resistência térmica interfacial suplementar. Os blocos foram feitos de latão com uma capacidade térmica específica (c) de 395 W/m*K e uma condutividade térmica (k) de 134 J/kg*K¹. Em comparação com outros metais comuns, como ferro (c = 490 W / m * K, k = 66 J / kg * K) e alumínio (c = 949 W / m * K, k = 240 J / kg * K), essas propriedades permitem atingir a temperatura desejada mais rapidamente e também permitem que o máximo de calor seja transferido para a pele rapidamente para produzir as queimaduras. Para aumentar a reprodutibilidade, a Figura 4 mostra as características do bloco de latão que foi usado para fazer queimaduras. A Figura 4A mostra o desenho de engenharia do bloco de latão com todas as dimensões em mm. Como mostrado, o diâmetro externo do bloco é de 40 mm x altura 151 mm. A linha pontilhada mostra um orifício coaxial através do bloco para inserção de um termômetro, com diâmetro de furo de 9 mm e 128 mm de profundidade. A Figura 4B, C mostra o termômetro inserido no bloco de latão para medição da temperatura do núcleo.

Um limite do modelo atual é a persistência de zonas não queimadas devido aos relevos das nervuras, o que é principalmente problemático em queimaduras de espessura parcial (Figura 2). Isso pode influenciar o processo de reepitelização, fornecendo uma fonte central de migração de queratinócitos. No entanto, parece difícil evitar esse problema ao usar materiais duros para criar as queimaduras. Além disso, a superfície total das áreas não queimadas é menor, e o diâmetro de 4 cm dos blocos de latão fornece superfície de ferida suficiente para realizar estudos com longos acompanhamentos, apesar das biópsias repetidas por punção.

Outra variável importante é o momento da escarotomia em queimaduras de espessura total, planejada no POD3 neste protocolo. Esse ponto de tempo tardio foi escolhido para atingir a zona de sombra com lesões teciduais tardias, também conhecida como conversão de queimaduras na prática clínica^62,63. O objetivo era remover todo o tecido lesionado, o que foi facilitado pela coesão da escara neste momento. Esse tempo também permite estudar intervenções precoces com o objetivo de diminuir lesões tardias da "zona de sombra", como anti-inflamatórios^64,65,66, terapia com células-tronco 18,67,68, terapia fria ⁶⁹ ou anticoagulação 65,70,71 por até 3 dias. Além disso, enquanto a maioria dos autores descreveu curtos períodos de acompanhamento de 2 a 4 semanas^29,47, um período de acompanhamento estendido de 8 a 10 semanas foi adotado aqui, permitindo estudar não apenas a fase aguda, mas também as etapas secundárias de cicatrização.

Durante esse acompanhamento prolongado, os cuidados pós-operatórios e o curativo são fundamentais: a equipe precisa ser treinada para prestar cuidados adequados ao animal. A raça Yucatán costuma apresentar pele seca e precisa receber loção umectante várias vezes por semana para diminuir o prurido, que é um sinal de desconforto e pode levar a subsequentes automutilações das feridas. O curativo multicamadas apresentado neste manuscrito é o resultado de vários anos de experiência em modelos semelhantes em nosso centro ^7,72. Os animais não mostram sinais de desconforto ou dor. Nenhuma infecção foi encontrada no estudo, mas o monitoramento diário nas primeiras duas semanas ainda é necessário para detectar precocemente essas possíveis complicações. Isso enfatiza a conformidade com a segurança e o bem-estar animal, que são de extrema importância na pesquisa moderna. Optamos por interromper os curativos após 3 semanas para permitir a exposição ao ar e a reepitelização a seco ^73,74. No entanto, na era moderna de géis²⁰ à base de nanopartículas e reticulados³⁵ para melhorar a cicatrização de queimaduras, curativos oclusivos contínuos podem ser implementados neste protocolo.

Finalmente, uma das principais características deste modelo é que ele permite estudar diferentes profundidades de feridas no mesmo sujeito. Os resultados histológicos confirmam a relevância do protocolo a esse respeito. Esse recurso é de interesse para fins de diagnóstico, como novas tecnologias para ajudar a medir a profundidade da queimadura, deterioração durante a fase inicial ou melhora durante o processo de cicatrização, mas também para avaliar novas terapias e sua ação diferencial em queimaduras de primeiro, segundo e terceiro graus. Como o processo de cicatrização é substancialmente diferente dependendo da profundidade inicial da queima, esse modelo permite medir os efeitos diferenciais de terapias potenciais, evitando variações interindividuais. No entanto, uma limitação é que a mistura de vários tipos de queimaduras no mesmo animal impossibilita a avaliação de biomarcadores sistêmicos, como metaloproteinases, citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, que sabidamente variam com a profundidade da ferida e a área total da superfície queimada⁷⁵.

Em conclusão, o atual modelo de queimadura do Yucatan Minipig se destaca por sua capacidade de fornecer uma plataforma confiável para estudar a cicatrização de feridas após queimaduras. Aproveitando a proximidade fisiológica entre a pele suína e humana, este modelo de porco oferece vantagens distintas, incluindo comparações intraindividuais controladas e a capacidade de acomodar vários tipos de feridas em um único animal. Técnicas de indução de queimaduras reprodutíveis, tempo de intervenções e tempo de acompanhamento prolongado são pontos críticos que aumentam a relevância clínica e a confiabilidade desse modelo. A pele de Yucatán permite estudar fenômenos específicos da pele pigmentada, como cicatrizes hipertróficas e hiperpigmentação pós-inflamatória. Novas ferramentas de diagnóstico com o objetivo de orientar o clínico com a conversão de queimaduras da "zona de sombra" e tratamentos modernos, como nanopartículas ou enxertos de pele impressos em 3D, são exemplos que ilustram a necessidade de um modelo pré-clínico tão precioso para estudar as fases agudas, tardias e de longo prazo da queimadura.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça de tecido Adson	Jarit	130-234
Contas de alumínio	Lab Armor	42370-002	Contas de armadura de laboratório
Cloridrato de buprenorfina	Ranbaxy Pharmaceuticals	NDC:12469-0757-01	Buprenex Carprofeno injetável
	Pfizer	NADA 141-199	Rymadyl 50mg/ml injetável
Bloco de latão cilíndrico	Feito à mão	N/A	Desenho de engenharia incluído no manuscrito
Caneta dermográfica	McKesson	Marcador de pele cirúrgico estéril
descartável #15 bisturis cirúrgicos	Medline	MDS15315	lâminas de bisturi
Adesivo de fentanil	Mylan	NDC:60505-7082	Sistema Transdérmico de Fentanil
Isoflurano	Piramal	NDC:66794-013-25	Isoflurano, USP
McPherson Pinça de coagulação bipolar	Bovie	A842	Reutilizável, autoclavável
Miltex socos de biópsia variados (3,4 e 5 mm)	Integra	33-38	Punções de biópsia- tamanho para se adaptar ao estudo
Gaze não tecida	Starryshine	GZNW22	2 x 2" almofadas de gaze médica não tecida de 4 camadas
Povidona-Iodo	Betadine	NDC:0034-9200-88	Esfoliante cirúrgico 7.5%
Solução isotônica estéril de cloreto de sódio 0,9%	Aqualite Sistema	RL-2095	Solução salina estéril
Tinta de tatuagem	Spaulding & Rogers	Black - 2 oz - #9053
Marcador de tatuagem	Spaulding & Rogers	Special Electric Tattoo Marker
Agulha de tatuagem	Spaulding & Rogers	1310251	Tattoo 5 agulha
de ponta Tegaderm Filme Transparente Curativo	3M	1.628	Grande curativo adesivo transparente
Placa quente com temperatura controlada	Cole-Parmer	03407-11	Agitador de placa quente StableTemp
Termômetro	American Scientific	U14295	Tubo termômetro de mercúrio
Tiletamina e cloridrato de	zolazepamZoetis	NDC: 54771-9050
Tintura Telazol de Benjoim Spray	Smith & Sobrinho	407000	Spray de camada adesiva
Pomada antibiótica tripla	Fougera	NDC 0168-0012-31	Pomada antibiótica tripla
Stockinette tubular	Medline	NONNET02	Curad Medline Redes elásticas sem látex
Manta de aquecimento	3M	Bair Hugger 750 unidade
Xeroform Tira de gaze oclusiva	Covidien	8884433301	Curativos de xilazina Vetone
		NDC:13985-704-10	AnaSed LA
Yucatà n minipigs (fêmea, 30 kg)	Sinclair Bio Resources	N/A	Pigmentação total