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Coloração com Picrosirius Red para Avaliação Histopatológica Semiquantitativa da Deposição de Colágeno em Modelos Murinos de Rejeição Crônica de Aloenxerto Pulmonar

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DOI:

10.3791/66395

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21 de março de 2025

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A coloração com Picrosirius Red é um método semiquantitativo para avaliar objetivamente a deposição de colágeno no remodelamento fibrótico pulmonar murino de maneira espacialmente resolvida. Além de avaliar a deposição total de colágeno, a coloração Picrosirius Red permite diferenciar fibras colágenas de diferentes espessuras.

Resumo

A fibrose é a característica fisiopatológica da rejeição crônica após o transplante de pulmão e o principal obstáculo para a sobrevida do receptor em longo prazo. Vários modelos de transplante de pulmão murino estão disponíveis para o estudo da rejeição crônica. No entanto, eles apresentam resultados heterogêneos em relação às alterações fibróticas do enxerto, e a extensão histológica da fibrose é relatada principalmente qualitativamente. Portanto, uma abordagem espacialmente resolvida que permita a análise estatística pode auxiliar na avaliação da fibrose nesses modelos. Este estudo apresenta a coloração Picrosirius Red para uma avaliação semiquantitativa da organização do colágeno em aloenxertos pulmonares murinos e a compara com as colorações padrão de Hematoxilina e Eosina, Tricrômico de Masson e Herovici. A coloração foi realizada em cortes de dois modelos diferentes de transplante murino com base em incompatibilidades menores e maiores do complexo de histocompatibilidade (MHC). O método foi estabelecido para análise semiquantitativa da organização do colágeno em cortes de pulmão inteiro. Assim, pode servir como ferramenta para modelos experimentais murinos de doenças pulmonares fibróticas.

Introdução

O transplante de pulmão é a opção terapêutica definitiva para pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal. No entanto, a sobrevida em longo prazo é dificultada pela rejeição crônica, afetando 50% dos receptores nos primeiros cinco anos de pós-operatório1. O remodelamento fibrótico das pequenas vias aéreas e do parênquima pulmonar é a marca histológica subjacente à perda progressiva da função pulmonar na rejeição crônica do aloenxerto pulmonar2. Experimentalmente, a rejeição crônica do aloenxerto pulmonar pode ser modelada com transplante pulmonar ortotópico murino entre cepas de camundongos incompatíveis com MHC. Diferentes combinações de cepas foram propostas para atingir o fenótipo de rejeição crônica3. Entre eles, a combinação de transplante do doador C57BL/10 menor MHC incompatível e receptor C57BL/6 é frequentemente usada4. Alternativamente, os pulmões de doadores BALB/c podem ser transplantados para receptores C57BL/6 que recebem tratamento imunossupressor diário5. Esses modelos resultam em graus histologicamente diferentes de alterações fibróticas6. Essas alterações são frequentemente relatadas qualitativamente usando a coloração padrão de hematoxilina e eosina e tricrômico de Masson.

A coloração histológica padrão com hematoxilina e eosina permite uma visão geral da amostra, pois ela cora os núcleos de azul, enquanto o citoplasma e as fibras de colágeno aparecem em vermelho. Com a coloração tricrômica de Masson, os núcleos são corados de preto, as fibras de colágeno são coradas de verde a azul e o fundo, incluindo citoplasma, fibrina e músculos, é vermelho. Como a coloração tricrômica de Masson pode levar a valores subestimados, o uso da coloração Picrosirius Red é considerado benéfico7. O Picrosirius Red é um corante aniônico linear que se associa a longas fibras de colágeno catiônico e fornece coloração vermelha rica em contraste. Além disso, a coloração Picrosirius Red aumenta a birrefringência natural das fibras colágenas sob luz polarizada cruzada8. Desta forma, a espessura e o empacotamento da fibra de colágeno podem ser avaliados. Usando um filtro polarizador, o fundo fica escuro e torna-se possível distinguir a espessura do colágeno depositado. Enquanto as fibras de colágeno grossas parecem vermelhas, as fibras de colágeno finas emergem verdes sob polarização. Uma associação direta entre birrefringência e subtipo de colágeno é frequentemente descrita na literatura, com birrefringência vermelha atribuída ao colágeno I e birrefringência verde ao colágeno III9.

Este protocolo descreve o uso da coloração Picrosirius Red para avaliar fibrose em aloenxertos pulmonares murinos. Além da coloração histológica convencional, permite uma avaliação semiquantitativa da alteração fibrótica em modelos murinos de rejeição crônica, fornece um meio de distinção entre fibras colágenas grossas e finas em apenas uma coloração, é econômica e fácil de executar. Este método pode ser igualmente aplicado a outros modelos experimentais murinos caracterizados por remodelamento fibrótico do parênquima pulmonar.

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Protocolo

Todos os protocolos em animais estão em conformidade com os princípios éticos dos 3Rs para pesquisa animal sem crueldade e foram aprovados pelo comitê de ética veterinária local (Veterinäramt Kanton Zürich, Suíça, Estudo número 45/2014). Da mesma forma, os leitores devem obter permissão das instituições competentes antes de realizar qualquer procedimento em animais de laboratório.

1. Aquisição de amostras

  1. Realizar experimentos com animais de acordo com as necessidades individuais e respectiva aprovação ética. Um único microcirurgião realiza todas as cirurgias sem nenhum tempo adicional de isquemia prolongada.
    NOTA: Para uma reprodução de nossos resultados representativos, obtenha camundongos machos adultos C57BL / 6J, C57BL / 10J e BALB / c pesando 27-30 g da Charles River Laboratories. Para isoenxertos, use animais C57BL/6J como doadores e receptores. No modelo menor incompatível, transplante os pulmões do doador C57BL / 10J para receptores C57BL / 6J. No modelo principal incompatível, transplantar pulmões de doadores BALB/c para receptores C57BL/6J e injetar no pós-operatório ciclosporina (10 mg/kg/dia) e metilprednisolona (1,6 mg/kg/dia) por via subcutânea diariamente5. Use solução salina para perfusão e recupere os pulmões após 8 semanas (56 dias).
  2. Para a eutanásia, intubar o animal com um cateter 20G e ventilá-lo com O2 suplementado com 2%-3% de isoflurano. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela ausência de resposta a um beliscão da pata.
  3. Realize uma laparosternotomia mediana incisando a parede abdominal com uma tesoura cirúrgica e cortando o comprimento do esterno para expor o coração. Identifique a veia cava inferior e o apêndice atrial esquerdo por sua localização anatômica.
  4. Em rápida sucessão, cortar a veia cava inferior e o apêndice atrial esquerdo com tesoura cirúrgica e perfundir o animal com 3-5 mL de NaCl a 0,9% através da raiz da artéria pulmonar com uma seringa para remover todo o sangue da circulação pulmonar.
    NOTA: A eutanásia deve ser realizada de acordo com a respectiva aprovação ética. Outros métodos podem ser igualmente aplicados. Recomenda-se que o sangue da circulação pulmonar seja completamente removido, o que também pode ser realizado por perfusão após parada circulatória.
  5. Remova os pulmões perfundidos usando uma tesoura.
  6. Para conservação, incubar as amostras em formol a 4%. Injete a solução de formalina diretamente no brônquio e na vasculatura pulmonar. Mergulhe as amostras em formalina e deixe-as incubar por pelo menos 6 h.
    NOTA: Para a insuflação do pulmão com formalina, um procedimento padronizado deve ser aplicado para obter resultados comparáveis. Exemplos de protocolos para tais procedimentos são publicados em outro artigo10,11.
  7. Apare o órgão de acordo com as necessidades experimentais. Corte transversalmente os pulmões ao meio para capturar todas as partes da árvore brônquica em uma seção.
  8. Transfira as amostras para um processador automático de tecidos para desidratação em sequência alcoólica, limpando em xilol e revestimento de parafina da seguinte forma: etanol 70%, etanol 70%, etanol 80%, etanol 96%, etanol 100% (1 h cada), etanol 100%, etanol 100%, xilol (2 h cada), xilol (1 h) e parafina 3x por 2 h.
  9. Derreta a parafina e incorpore as amostras na orientação correta em de incorporação de polioximetileno. Tome cuidado para incorporar as amostras com a superfície de corte voltada para baixo. Use um micrótomo rotativo para cortar seções de 5 μm consecutivamente. Deixe as lâminas secarem por 24 h a 37 °C antes de continuar o processamento.

2. Desparafinização e hidratação de lâminas de parafina

  1. Remova a parafina incubando as amostras 2x em xilol 100% por 5 min cada.
    CUIDADO: O xilol é inflamável e perigoso para a saúde. Utilizar apenas por baixo do exaustor.
  2. Hidrate as amostras em 100% de etanol, 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e 50% de etanol por 2 min cada. Em seguida, lave por 2 min em água destilada.

3. Coloração com Picrosirius Red

  1. A coloração desliza por 8 min na solução de hemalum de Meyer. Lave as lâminas por 10 min em água corrente da torneira.
  2. Incubar as lâminas durante 1 h em solução de Picrosirius Red. Para a solução de Picrosirius Red, utilize uma solução de coloração pré-misturada ou utilize 0,1% de Direct Red 80 ou Sirius Red F 3B (CI 35780) diluído em ácido pícrico saturado.
    CUIDADO: O ácido pícrico é inflamável e altamente explosivo e deve ser tratado com cuidado.
    NOTA: Existem muitos fornecedores diferentes para kits de coloração Picrosirius Red disponíveis, conforme listado na Tabela de Materiais. Esteja ciente das diferenças de preço e métodos de coloração e sempre siga as instruções dos fornecedores. Recomenda-se usar apenas kits de coloração com o índice de cores específico para Sirius Red F 3B (CI 35780).
  3. Mergulhe as lâminas 5x-10x em uma solução de ácido acético (0,5%). Agite suavemente as lâminas para remover fisicamente a solução.
  4. Desidrate as lâminas em etanol 95%, etanol 100%, etanol 100%, xilol 100% e xilol 100% por 5 min cada.
  5. Incorpore adicionando uma gota de meio de montagem em cada amostra e cubra com uma lamínula. Deixe as corrediças secarem sob um exaustor.

4. Digitalização e processamento de imagem

  1. Focalizar as amostras sob um microscópio óptico com software de imagem apropriado até que a imagem se torne clara e nítida. Adicione um filtro polarizador e ajuste o grau de polarização até que o fundo fique completamente escuro ou preto. Quando o fundo é o mais escuro possível, a polarização correta é alcançada.
    NOTA: Também é possível visualizar a coloração Picrosirius Red com luz transmitida convencional e sem filtro polarizador. Para isso, recomenda-se o uso do Sirius Red com Fast Green, pois ele tem se mostrado mais sensível do que o Sirius Red sozinho 12,13. No entanto, a microscopia polarizada é necessária para distinguir entre fibras colágenas grossas e finas.
  2. Digitalize todas as amostras completamente com ampliação de 20x e exporte conforme .tiff. Transferir para o software Fiji14. Certifique-se de limpar os slides adequadamente com antecedência e use configurações padronizadas em relação ao tempo de exposição e à intensidade da fonte de luz.
  3. Coloque a amostra manualmente e recorte-a no software usando Editar > Limpar Fora. Meça a área total da superfície clicando em Analisar > Medir.
    NOTA: A seleção do compartimento a ser medido é uma etapa crítica na criação de resultados confiáveis e comparáveis. Ao digitalizar e selecionar toda a amostra, uma boa seção transversal é exibida e os tecidos heterogêneos são considerados como um todo. No entanto, também é possível limitar-se a áreas específicas dentro das amostras, como pleura ou brônquios individuais. Lembre-se de sempre selecionar compartimentos para comparar de forma padronizada. Caso as amostras apresentem grande variabilidade na ventilação, é aconselhável excluir a área do espaço aéreo do compartimento analisado15.
  4. Meça o conteúdo total de colágeno por amostra usando o limite de cor clicando em Imagem > Ajustar > Limite de Cor e ajuste as configurações clicando em Analisar > Analisar Partículas. Tamanho do conjunto = 1 - infinito, claro, resumir. Brilho = 35 - 255. Matiz = 2 - 130
    NOTA: Uma configuração razoável dos limites de cores é fundamental para obter resultados confiáveis.
  5. Repita para fibras de colágeno grossas e finas ajustando Matiz como Fibras de Colágeno Grossas Vermelhas figure-protocol-1 (Matiz 2-30) e Fibras de Colágeno Finas Amarelo-Verde figure-protocol-2 (Matiz 31-130). O resultado será a área de pixels manchados.
  6. Configure a macro para processamento automatizado clicando em Plug-ins > Macros > Gravar e repita com todas as amostras.
  7. Para receber valores finais padronizados para a área de superfície da seção transversal, divida a área de pixels manchados para todos os parâmetros pela área de superfície total, conforme medido nas etapas 4.3 e 4.5 para cada amostra, respectivamente.

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Resultados

O protocolo descrito acima permite uma avaliação semiquantitativa objetiva da deposição de colágeno no tecido pulmonar murino. O remodelamento fibrótico é a marca fisiopatológica da rejeição crônica após o transplante pulmonar. Portanto, a coloração Picrosirius Red foi aplicada em modelos de rejeição crônica de aloenxerto pulmonar usando transplante pulmonar ortotópico murino do lado esquerdo. O principal transplante pulmonar incompatível com MHC de um doador BALB/c para um receptor C57BL/6 sob imunossupressão leve resul...

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Discussão

Métodos histológicos padrão, como hematoxilina e eosina e coloração tricrômica de Masson, são amplamente utilizados para detectar alterações fibróticas em pulmões murinos de maneira espacialmente resolvida16,19. No entanto, métodos adicionais são frequentemente necessários para quantificar essas alterações e avaliar a composição do colágeno do tecido.

A coloração Picrosirius Red foi descrita pela prime...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Birte Ohm é apoiada pelo Programa Berta-Ottenstein para Cientistas Clínicos, Faculdade de Medicina da Universidade de Freiburg. Steffen U Eisenhardt é professor Heisenberg da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) e apoiou este trabalho com bolsas pessoais. Além disso, gostaríamos de agradecer a Sheena Kreuzaler por sua assistência técnica. A Figura 1 foi criada com a ajuda de Biorender.com. A imagem foi realizada no Lighthouse Core Facility, que é financiado em parte pela Faculdade de Medicina da Universidade de Freiburg (Números do Projeto 2023/A2-Fol; 2021/B3-Fol), o DKTK e o DFG (Número do Projeto 450392965).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoHoneywell, Charlotte, EUA33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Alemanha4633000956 (número de série)
Coverslip 1.5Roth, Karlsruhe, AlemanhaKCY5.1
Formaldeído 37%Fisher Scientific, Leicestershire, Reino UnidoF/1501/PB15
Solução de hemalum de MeyerMerck, Darmstadt, Alemanha109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Offenbach am Main, Alemanha13422alternativas que podem ser usadas: ab150681, abcam, Cambridge, Reino Unido; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
Filtro polarizadorZeiss, Oberkochen, Alemanha000000-1121-813
Micrótomo rotativo, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Alemanha149AUTO00C1, 14051956472
Meio de montagem ROTI HistokittRoth, Karlsruhe, Alemanha6638.1
ROTI Plast ParafinaRoth, Karlsruhe, Alemanha6642.5
de incorporação Rotilabo, POMRoth, Karlsruhe, AlemanhaK113.1
Superfrost Plus Adhesion Microscópio slideepredia, Portsmouth, Reino UnidoJ1800AMNZ
Processador de Tecidos Leica, Wetzlar, AlemanhaTP 1020
Software
Fiji software versão 2.14.0/1.54fde imagem de código
ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Alemanha
Software aberto

Referências

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