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O Estabelecimento de Defeitos Compostos Calvariais de Sutura-Osso em Ratos: Um Modelo Padronizado para Investigação de Terapia Regenerativa de Sutura

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DOI:

10.3791/66417

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10 de maio de 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos os procedimentos cirúrgicos detalhados de defeitos compostos ósseo-sutura da calvária em ratos, juntamente com as investigações sobre os prognósticos de curto e longo prazo do modelo. Nosso objetivo é construir um modelo padronizado para o desenvolvimento de terapias regenerativas de sutura.

Resumo

Defeitos da calvária em grande escala geralmente coincidem com a ruptura da sutura craniana, levando a prejuízos na restauração do defeito da calvária e no desenvolvimento do crânio (este último ocorre no crânio em desenvolvimento). No entanto, a falta de um modelo padronizado dificulta o progresso na investigação de terapias regenerativas de sutura e apresenta desafios para a realização de análises comparativas em estudos distintos. Para resolver esse problema, o protocolo atual descreve o processo de modelagem detalhada de defeitos compostos ósseos de sutura calvarial em ratos.

O modelo foi gerado por meio da perfuração de furos retangulares de espessura total medindo 4,5 mm × 2 mm nas suturas coronais. Os ratos foram sacrificados e as amostras de crânio foram colhidas no pós-operatório no dia 0, semana 2, semana 6 e semana 12. Os resultados da TC de amostras coletadas imediatamente após a cirurgia confirmaram o estabelecimento bem-sucedido do defeito composto sutura-osso, envolvendo a remoção da sutura coronal e dos tecidos ósseos adjacentes.

Os dados da6ª e12ª semanas de pós-operatório demonstraram uma tendência natural de cicatrização para o fechamento do defeito. A coloração histológica validou ainda mais essa tendência, mostrando aumento de fibras mineralizadas e osso novo no centro do defeito. Esses achados indicam fusão progressiva da sutura ao longo do tempo após defeitos da calvária, ressaltando a importância das intervenções terapêuticas para a regeneração da sutura. Prevemos que este protocolo facilitará o desenvolvimento de terapias regenerativas de sutura, oferecendo novos insights sobre a restauração funcional de defeitos da calvária e reduzindo os resultados adversos associados à perda de sutura.

Introdução

As suturas cranianas são conexões fibrosas densas entre os ossos cranianos, atuando como articulações para facilitar o leve movimento do crânio e fornecendo uma almofada protetora para o cérebro sob pressão1. Nos últimos anos, o aumento da pesquisa destacou o papel fundamental das suturas cranianas no desenvolvimento do crânio, na homeostase craniofacial e no potencial osteo-reparador inerente 2,3,4,5,6,7,8. Durante os períodos de crescimento e desenvolvimento, as suturas cranianas atuam como os principais centros de crescimento do crânio4. A formação de novos ossos ocorre nas frentes osteogênicas em ambos os lados das suturas, enquanto as células dentro das suturas mantêm um estado mesenquimal indiferenciado, garantindo a expansão equilibrada do crânio junto com o crescimento do cérebro1. A perda de suturas cranianas neste momento resulta em uma discrepância entre o crescimento do crânio e do cérebro, levando a problemas graves como lesões cerebrais, hidrocefalia, aumento da pressão intracraniana e disfunção cognitiva 3,9.

Além disso, as suturas cranianas desempenham um papel crucial na determinação do prognóstico dos defeitos da calvária 5,7,10. O potencial regenerativo na superfície da calvária é distribuído de forma desigual, com suturas cranianas mostrando capacidades notavelmente superiores em comparação com regiões sem sutura10,11. Um estudo indica que a velocidade de cicatrização do defeito da calvária se correlaciona inversamente com a distância entre a sutura craniana e o local da lesão10. Especificamente, a remoção de suturas coronais e sagitais leva à não cicatrização de defeitos ósseos parietais7, enfatizando a necessidade de regeneração de sutura em defeitos da calvária. No entanto, o foco dos estudos atuais é predominantemente na restauração da estrutura óssea craniana, negligenciando a regeneração do mesênquima de sutura.

Em relação aos avanços na regeneração de suturas, resultados promissores têm sido observados com o transplante de retalhos ósseos contendo sutura, células-tronco mesenquimais (CTMs) e biomateriais artificiais. Quando os retalhos ósseos com suturas foram transplantados para defeitos da calvária, eles se integraram e cicatrizaram com sucesso, em contraste com aqueles sem suturas que apresentavam não união e incapacidade de formar periósteo, dura-máter ou osteócitos5. Da mesma forma, o implante de CTMs derivadas da medula óssea em defeitos compostos ósseos de sutura sagital facilitou a formação de lacunas semelhantes a suturas12. Digno de nota, um estudo recente destacou a realização da regeneração da sutura com Gli1+ MSCs, permitindo o controle da pressão intracraniana, correção da deformidade craniana e melhora da função neurocognitiva13. À medida que a medicina regenerativa e a engenharia biomédica se desenvolvem, os pesquisadores se concentram cada vez mais em biomateriais de engenharia de tecidos devido às suas características adaptáveis e personalizáveis14. Notavelmente, as membranas de politetrafluoretileno provaram ser eficazes na reconstrução do osso craniano e na sutura do mesênquima simultaneamente15,16.

No entanto, a pesquisa craniofacial carece de modelos estabelecidos para explorar terapias regenerativas mesenquimais de sutura, ao contrário de modelos relativamente maduros na reparação de outros tecidos, como osso, pele, cartilagem e músculos17. A ausência de um modelo padronizado restringe o estudo de terapias regenerativas de sutura e torna desafiador realizar análises comparativas em diferentes estudos. Portanto, nosso estudo estabeleceu um defeito composto ósseo-sutura calvarial de rato praticável e reprodutível. Por meio desse método, pretendemos desenvolver intervenções clínicas apropriadas para a reconstrução da sutura craniana, oferecendo novas perspectivas sobre o reparo funcional dos defeitos da calvária e diminuindo os resultados desfavoráveis resultantes da perda de sutura.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Um total de 12 (3 ratos em cada um dos quatro pontos de tempo) ratos Sprague-Dawley (SD) (macho, 300 g, 8 semanas de idade) foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação pré-cirúrgica

  1. Itens cirúrgicos
    1. Prepare os instrumentos cirúrgicos exibidos na Figura 1A, incluindo pinças curvas, bisturi estéril descartável, elevador de periósteo, agulha de irrigação, bolas de algodão, peça de mão de baixa rotação, motor cirúrgico, brocas redondas odontológicas de baixa velocidade (Figura 1B, 1,2 mm e 0,8 mm de diâmetro, respectivamente), porta-agulhas, suturas de monofilamento 3-0 e tesoura reta.
  2. Esterilização e desinfecção
    1. Esterilize os instrumentos por esterilização a vapor (125-135 °C, 20-25 min) com antecedência.
    2. Use etanol para esterilizar equipamentos médicos sensíveis ao calor, como barbeadores elétricos.
    3. Use tecidos não tecidos médicos estéreis para cobrir a plataforma de operação e desinfetar o ambiente circundante com etanol a 75%.
  3. Anestesia
    1. Prepare os animais para a cirurgia com um período de aclimatação de 1 semana.
    2. Injete os ratos por via intraperitoneal com xilazina (10 mg / kg) e cetamina (100 mg / kg) 20 minutos antes da cirurgia para anestesia ou utilize qualquer protocolo anestésico adequado para obter anestesia geral.
      NOTA: O coquetel anestésico cetamina-xilazina administrado por via intraperitoneal em ratos normalmente faz efeito dentro de 10-15 minutos, atingindo o pico da anestesia cerca de 35-40 minutos após a injeção. Para evitar a hipotermia durante a anestesia, os ratos devem ser colocados em uma almofada de aquecimento.
    3. Administre uma injeção subcutânea pré-operatória de carprofeno a 5 mg / kg para fornecer analgesia.
    4. Use o "método de beliscar o dedo do pé" para determinar se os ratos estão ou não conscientes e responsivos.

2. Processo cirúrgico

  1. Preparação do site
    1. Coloque o rato em decúbito ventral com a cabeça naturalmente estendida verticalmente, sem a necessidade de dispositivos especiais ou restrições para manter essa postura (Figura 2A).
    2. Aplique pomada veterinária, ou seja, vaselina, nos olhos do rato para evitar o ressecamento da córnea.
    3. Remova o cabelo do couro cabeludo entre a ponte nasal e a articulação da coluna cervical com um barbeador elétrico (Figura 2B). Desinfetar a área cirúrgica em movimentos circulares irradiando do centro com solução de iodóforo a 2% seguida de etanol a 75%. Empregue uma cortina cirúrgica para cobrir o dorso do animal e o pelo ao redor da incisão.
  2. Abertura do sítio cirúrgico
    1. Partindo do ponto médio do osso nasal, fazer uma incisão longitudinal na pele de 2 cm com bisturi descartável seguindo a linha média do crânio (Figura 2C).
    2. Faça uma incisão periosteal na linha média espelhando o ponto inicial e a extensão da camada de pele com um bisturi (Figura 2D). Em seguida, levante suavemente o periósteo em ambos os lados da incisão com um elevador periosteal (Figura 2E1) para expor os ossos parietais, ossos frontais e suturas coronais (Figura 2E2).
      NOTA: Ao incisar o periósteo, tome cuidado para não danificar as suturas cranianas para evitar sangramento excessivo durante o corte. A exposição adequada da sutura coronal é de extrema importância para os procedimentos a seguir.
    3. Enxágue a ferida com soro fisiológico e seque a área cirúrgica com bolas de algodão.
  3. Estabelecimento do modelo de defeito composto ósseo-sutura
    1. Ajuste o motor cirúrgico para 35,000 rpm girando o botão (Figura 1A, seta amarela) e, em seguida, ligue o interruptor (Figura 1A, seta branca).
    2. Começando de qualquer ponto da sutura coronal, aplique força vertical usando uma broca redonda de 1,2 mm de diâmetro até sentir uma sensação de ruptura.
      NOTA: Recomende o ponto médio da sutura coronal (indicado por setas amarelas na Figura 2E2) como ponto de partida para a penetração. Ao afiar, as brocas dentárias devem ser mantidas perpendiculares à superfície craniana. Tenha cuidado para não continuar perfurando depois de penetrar em toda a espessura do crânio para evitar mais danos aos ratos, incluindo danos cerebrais ou hemorragia cerebral.
    3. A partir do ponto de penetração, mova a broca lateralmente ao longo da sutura coronal para criar um sulco de posicionamento de aproximadamente 4 mm de comprimento (Figura 2F1). Remova o tecido ósseo com a broca em ambos os lados da ranhura de posicionamento para formar inicialmente um defeito retangular de espessura total (Figura 2F2).
    4. Empregue uma broca redonda de 0,8 mm de diâmetro para refinar os detalhes (Figura 2G1), envolvendo a retificação de ângulos retos e a suavização das margens do defeito, alcançando um defeito retangular padrão medindo 2 mm de largura e 4,5 mm de comprimento (Figura 2G2).
      NOTA: Para obter a remoção completa da sutura coronal, preservando as suturas sagital e frontal em ratos SD de 300 g, o comprimento máximo viável do defeito é de aproximadamente 4,5 mm. Considerando a largura da sutura coronal no sentido ântero-posterior (Figura Suplementar S1), a largura do defeito foi fixada em 2 mm.
    5. Crie dois defeitos nas metades esquerda e direita da sutura coronal para autocomparação.
    6. Mantenha a irrigação contínua da solução salina durante o procedimento de perfuração para proteger contra lesões térmicas no crânio e no cérebro. Enquanto isso, use bolas de algodão para secar a área de operação.
  4. Verificação da dimensão da amostra
    1. Verifique regularmente o comprimento e a largura dos defeitos usando um paquímetro (Figura 2H1, H2) para garantir a consistência em todas as amostras.
  5. Fechamento do sítio cirúrgico
    1. Fechar a pele com pontos de monofilamento 3-0 (Figura 2I).
  6. Microtomografia computadorizada in vivo (μCT) pós-operatória imediata
    1. Se possível, realize exames de μCT in vivo em todos os ratos imediatamente após a cirurgia para confirmar o sucesso do procedimento cirúrgico e monitorar as tendências de recuperação de defeitos para cada indivíduo.

3. Cuidados pós-cirúrgicos

  1. De acordo com os protocolos de cuidados com os animais, administre analgésicos estabelecidos conforme necessário após a cirurgia, por exemplo, carprofeno (5 mg/kg, uso subcutâneo).
  2. Transfira os ratos para uma almofada de aquecimento constante (37 ° C) para recuperação pós-operatória.
  3. Uma vez totalmente consciente, reposicione os ratos para sua gaiola contendo roupas de cama limpas.
    NOTA: Monitore continuamente os ratos após a cirurgia. Não os deixe sem vigilância até que possam manter a decúbito esternal. Mantenha os ratos operados isolados dos outros até que estejam totalmente recuperados.
  4. Realizar o manejo da analgesia e monitoramento pós-operatório por 24 horas, seguido de avaliações diárias durante a primeira semana após a cirurgia. Monitore os ratos pelo menos 1-2x por semana a partir de então.

4. Coleta de amostras e análise de dados

  1. Preparação da amostra
    1. Colete amostras de crânio no dia 0 pós-operatório, semana 2, semana 6 e semana 12. Eutanasiar os ratos usando inalação de CO2 .
    2. Fixe as amostras em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 h antes de uma análise posterior.
  2. Avaliação por TC de μ
    1. Realizar varreduras μCT em ossos cranianos do dia 0 pós-operatório, semana 6, semana 12 com os seguintes parâmetros de varredura: potencial do tubo de raios-X, 70 kVp; intensidade de raios-X, 0,2 mA; filtro, AL 0,5 mm; tempo de integração, 1 x 300 ms; e tamanho do voxel, 10 μm.
    2. Obtenha reconstrução 3D e imagens transversais com software de processamento de imagem (consulte Tabela de Materiais).
    3. Meça o volume de defeitos residuais e realize análises estatísticas com o software correspondente (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Coloração histológica
    1. Descalcifique os ossos cranianos em solução de ácido etilenodiamina tetracético a 12% (p / v) (pH = 7,2) a 4 ° C por 6 semanas.
      NOTA: Descalcifique as amostras com trocas de solução a cada 3 dias. Utilize um shaker para agilizar o processo. A conclusão é indicada quando uma agulha de 25 G penetra facilmente na amostra.
    2. Prossiga com a desidratação, inclusão de parafina e preparação de cortes de 6 μm usando protocolos padrão18.
    3. Realize a análise histológica usando hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrômica de Masson seguindo o protocolo do kit18.

Resultados

Neste estudo, o defeito composto ósseo de sutura calvarial de rato foi estabelecido perfurando um orifício retangular de 4,5 mm x 2 mm na sutura coronal. A ilustração esquemática cirúrgica e o fluxograma da pesquisa estão representados na Figura 3. A imagem 3D e a visão transversal das amostras de 0 dias de pós-operatório, ou seja, amostras coletadas imediatamente após a cirurgia, confirmaram a criação bem-sucedida de um defeito de calvária de espessura total, envolvendo a remoção completa da sutura coronal, bem como das estruturas ósseas adjacentes em ambas as extremidades (Figura 4A). As imagens de μTC e os resultados da análise estatística correspondente com 6 semanas de pós-operatório revelaram uma inclinação natural para o fechamento do defeito acompanhada de nódulos calcificados irregulares formados dentro do defeito (Figura 4). Essa tendência tornou-se mais acentuada 12 semanas após a cirurgia (Figura 4), indicando o potencial de fusão da sutura com o passar do tempo. Outras análises histológicas foram realizadas usando H&E e coloração tricrômica de Masson. Duas semanas após a cirurgia, observamos uma notável extensão e continuidade do periósteo e da dura-máter, que formaram tecido fibroso denso e espesso e selaram efetivamente a área do defeito (Figura 5). Notavelmente, neste momento inicial, foi detectado o surgimento de fibras mineralizadas coradas de azul, cuja presença sofreu um aumento substancial no tempo de 6 semanas após a cirurgia (Figura 5). Com 12 semanas de pós-operatório, grandes pedaços de osso novo foram observados no centro do defeito (Figura 5), reconfirmando o prognóstico adverso de calcificação estromal e fechamento da sutura. Os resultados desfavoráveis da cicatrização natural dos defeitos compostos sutura-ósseos enfatizam a necessidade de regeneração da sutura craniana por meio de intervenções terapêuticas, como o implante de biomateriais 13,15,16.

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Figura 1: Instrumentos cirúrgicos. (A) Os itens cirúrgicos foram numerados em ordem de uso, incluindo (1) pinça curva, (2) bisturi estéril descartável, (3) elevador periosteal, (4) agulha de irrigação, (5) bolas de algodão, (6) peça de mão de baixa velocidade, (7) motor cirúrgico (a seta amarela representa o botão RPM e a seta branca representa o interruptor), (8) brocas redondas odontológicas de baixa velocidade, (9) porta-agulha, (10) suturas monofilamentares 3-0 e (11) tesoura reta. (B) Brocas redondas de baixa velocidade de 1,2 mm e 0,8 mm de diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Procedimento cirúrgico. (A) Posicione o rato em decúbito ventral. (B) Raspe o cabelo do couro cabeludo com um barbeador elétrico. (C) Incisar a pele com um bisturi descartável. (D) Incisar o periósteo com um bisturi. (E1, E2) Eleve o periósteo para expor as suturas coronais com um elevador periosteal. As setas amarelas indicam suturas coronais. (F1) Fure uma ranhura de posicionamento. (F2) Preliminarmente, crie um defeito retangular com uma broca redonda de 1,2 mm. (G1, G2) Apare o defeito com uma broca redonda de 0,8 mm para obter uma forma retangular padrão de 4,5 x 2 mm. (H1, H2) Calibre a largura e o comprimento do defeito com um paquímetro. (I) Feche a pele com pontos de monofilamento 3-0. Esta representação utiliza um cadáver, que é deliberadamente deixado sem drapeado para facilitar a visualização anatômica aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Ilustração esquemática do defeito composto ósseo-sutura da calvária e estratégia de pesquisa deste estudo. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; μCT = microtomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Tendência de fechamento do defeito composto ósseo-sutura da calvária. (A) Imagens representativas de μCT e vistas transversais de defeitos compostos ósseo-sutura no dia 0, semana 6 e semana 12 de pós-operatório. As seções transversais representam os locais indicados pelas linhas tracejadas amarelas em imagens 3D. Barras de escala = 2 mm. (B) Análise quantitativa do volume residual do defeito pós-operatório por meio de avaliações de μCT. n = 6 repetições/grupo. Os dados são expressos como média ± DP. ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett. p<0,001. Abreviaturas: PO = pós-operatório; μCT = microtomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Variações histológicas nos defeitos compostos ósseos de sutura. (A) H&E e (B) Coloração tricrômica de Masson de defeitos compostos ósseos de sutura na semana 2, semana 6 e semana 12 do PO. Os contornos tracejados vermelhos indicam o tecido fibroso encapsulando a área do defeito. Os pentagramas pretos representam as fibras mineralizadas manchadas de azul. Os pentagramas amarelos destacam o novo osso formado no centro do defeito. Barras de escala = 500 μm; 200 μm (inserções). Abreviaturas: PO = pós-operatório; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Largura da sutura coronal no sentido ântero-posterior (imagem da calvária do plano sagital). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Os modelos convencionais de defeitos da calvária, envolvendo ou não suturas cranianas, concentram-se principalmente no reparo de tecidos duros, muitas vezes negligenciando a regeneração vital do mesênquima de sutura19,20. Na pesquisa de regeneração de sutura, modelos anteriores, como os de Mardas et al.15,16, utilizando uma broca trefina para criar um defeito circular de 5 mm na sutura sagital de ratos, resultaram em perda substancial de tecido duro, desviando-se assim do objetivo principal da regeneração da sutura. Da mesma forma, a metodologia de Wilk et al.7, abrangendo a remoção das suturas sagital e coronal direita e criando um defeito ósseo crítico no osso parietal direito, embora informativa, introduziu complexidades e potenciais variáveis de confusão devido à presença de múltiplos locais de defeito. Em contraste, nosso protocolo cria defeitos retangulares bilaterais ao longo da sutura coronal, visando um modelo de pesquisa mais simplificado e direcionado. As principais suturas cranianas incluem as suturas coronal, sagital, metópica e lambdoide21. Diferentemente das suturas metópicas e sagitais, que são dispostas longitudinalmente no crânio, as suturas coronal e lambdoide estão situadas transversalmente e podem ser divididas em duas metades, facilitando a criação de dois defeitos com condições idênticas. Em contraste com a sutura lambdoide, o campo cirúrgico exposto pela incisão do couro cabeludo é mais acessível para uma série de procedimentos na sutura coronal. A criação de defeitos nas metades esquerda e direita da sutura coronal e a aplicação de diferentes intervenções em cada local facilitam uma comparação mais direta de terapias distintas por meio do autocontrole. Além disso, essa abordagem permite uma comparação entre os lados tratados e não tratados, fornecendo informações sobre as disparidades entre o processo de cicatrização intervencionado e o processo de cicatrização natural. Portanto, nosso estudo sugere que a criação de defeitos compostos ósseo-sutura em ambos os lados das suturas coronais em ratos é um modelo cirúrgico adequado para o estudo de terapias regenerativas de sutura.

A seleção das dimensões do defeito é meticulosamente guiada por considerações práticas e anatômicas. Para este modelo animal específico, o principal desafio está em remover completamente a sutura coronal, preservando as suturas sagital e frontal, com remoção mínima de tecido ósseo. A estratégia ideal, portanto, envolve a criação de um defeito retangular preciso ao longo da sutura coronal. Essa decisão estratégica é indispensável, pois qualquer mesênquima remanescente na sutura coronal ou suturas adjacentes pode introduzir imprecisões na avaliação do verdadeiro impacto regenerativo do tratamento. Consequentemente, estabelecemos o maior comprimento de defeito viável para ratos SD machos de 300 g em aproximadamente 4,5 mm. Além disso, levando em consideração a largura da sutura coronal no sentido ântero-posterior (aproximadamente 1,5 mm no plano sagital, conforme mostrado na Figura Suplementar S1), ajustamos a largura do defeito em 2 mm para garantir a remoção completa da sutura da superfície craniana até sua profundidade. Vale ressaltar que as dimensões específicas do defeito, tanto em comprimento quanto em largura, podem exigir ajustes com base em fatores como o tipo e a idade do animal, bem como os objetivos experimentais. Outro estudo criou um defeito retangular delgado de 0,3 a 0,4 mm de largura ao longo da sutura coronal, acomodando o tamanho menor dos camundongos13.

Notavelmente, a dificuldade em gerar esse modelo cirúrgico está na construção de defeitos retangulares padrão e uniformes. É imperativo manter a consistência na forma do defeito para garantir uma dosagem uniforme de fatores bioativos entre as amostras, minimizando assim as variações intergrupo e intragrupo. Nesse sentido, durante o processo de remoção do complexo sutura-osso, inicialmente empregamos uma broca redonda de 1,2 mm de diâmetro para localizar a sutura coronal e criar um contorno aproximado do defeito retangular de espessura total (Figura 1B). Posteriormente, mudamos para a menor broca redonda (0,8 mm de diâmetro) para refinar as curvas em ângulo reto e suavizar as bordas do defeito (Figura 1B). Para garantir a consistência do comprimento e largura de cada defeito, um paquímetro foi utilizado para evitar excesso ou falta de moagem durante o processo de perfuração. Apesar dessa abordagem, a varredura μCT revelou que o defeito retangular que geramos ainda é um pouco em forma de arco (Figura 4), sugerindo a necessidade de otimização adicional do método de modelagem para obter formas de retificação precisas.

Para avaliar o prognóstico, a μTC fornece o meio mais direto, incluindo a avaliação da cicatrização do tecido ósseo e o estado das suturas cranianas, estejam elas fechadas ou desobstruídas. Além disso, a investigação em nível histopatológico é essencial para o estudo da regeneração da sutura craniana. A coloração histopatológica ajuda a diferenciar o não fechamento de defeitos devido à formação de tecido mesenquimal, inibição restauradora óssea ou ocupação de espaço material. Somente abordagens que facilitam a regeneração do tecido mesenquimal provavelmente possuem potencial para regeneração de sutura craniana. Além disso, apesar da falta de experimentos relevantes durante a construção do modelo, é altamente recomendável detectar a expressão em nível proteico de marcadores MSC de sutura no tecido regenerado após intervenções terapêuticas. Essa análise, empregando técnicas como imunofluorescência, imuno-histoquímica ou citometria de fluxo, contribui para confirmar o sucesso da regeneração da sutura. Marcadores específicos de MSC de sutura incluem Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk e mais 1,22.

Em resumo, este estudo relatou o processo de modelagem detalhada de defeitos compostos ósseos de sutura calvarial em ratos para estudar o prognóstico de defeitos de sutura cruzada e desenvolver terapias apropriadas para regenerar suturas cranianas. É pertinente notar que o campo da regeneração de suturas cranianas é de fato de nicho, sem modelos ou métodos padrão predominantes na literatura para regenerar suturas cranianas. Assim, acreditamos que nosso protocolo fornece uma base metodológica sólida para investigar abordagens regenerativas de sutura e introduz perspectivas inovadoras sobre a restauração funcional de defeitos da calvária, com o objetivo final de melhorar a qualidade de vida dos pacientes.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 82100982 (FL), 82101000 (HW), 82001019 (BY), Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan 2022NSFSC0598 (BY), 2023NSFSC1499 (HW) e Financiamento de Pesquisa da Escola da China Ocidental/Hospital de Estomatologia da Universidade de Sichuan (RCDWJS2021-5). A Figura 3 foi criada com Biorender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeídoBiosharpBL539A
2% Iodóforo soluçãoChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Nenhum
reagente químico Co. de Chengdu Jinshanálcool etílico de 75%,Nenhuma
Bolas de algodãoHaishi Hainuo Group Co., Ltd. Nenhum
CotoneteLakong Medical Devices Co., Nenhum
fórceps curvoChengdu Shifeng Co., Ltd.Nenhum
Software Dataviewer e Ctan para avaliações de volume de defeitos residuaisBrukerNenhum
Brocas redondas odontológicas de baixa velocidadeDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Bisturi estéril descartávelHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Nenhuma
Seringas descartáveis (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
Barbeador elétricoJASEBM320210
Ácido Etileno Diamina Tetracético (EDTA)BioFroxx1340GR500
Kit de Hematoxilina e Mancha de EosinaAgulha de irrigação BiosharpBL700B
(23 G)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Nenhuma
Handpiece de baixa velocidadeGuangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Nenhum
Masson' s Kit de Mancha TricrômicaSolarbioG1340
Tecidos não tecidos médicosHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Nenhum
Microtomografia computadorizada (µ CT) Scanco Medical AG&micro; CT45
Imita 20.0 para imagens transversaisMaterializarNenhum
Porta-agulhasChengdu Shifeng Co., Ltd.Nenhum
elevador periostealChengdu Shifeng Co., Ltd.Nenhuma
solução salinaSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Nenhum
Software de visualização médica Scanco para reconstrução de imagens 3DScanco Medical AGNenhum
SPSS Statistics 20.0 para análise estatísticaIBMNenhum
Ratos Sprague-Dawley Byrness Weil Biotech LtdNenhuma
tesoura retaChengdu Shifeng Co., Ltd.Nenhum
Motor CirúrgicoMARATHONN3-140232
Suturas cirúrgicas (monofilamento 3-0)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.nenhum
do Ltd.

Referências

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

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