Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Resumo

O presente protocolo descreve ensaios de infecção para interrogar a adesão, invasão e replicação intracelular de Shigella usando linhagens celulares epiteliais in vitro .

Resumo

O patógeno bacteriano entérico adaptado ao ser humano Shigella causa milhões de infecções a cada ano, cria efeitos de crescimento a longo prazo entre pacientes pediátricos e é uma das principais causas de mortes diarreicas em todo o mundo. A infecção induz diarreia aquosa ou sanguinolenta como resultado do patógeno transitar pelo trato gastrointestinal e infectar as células epiteliais que revestem o cólon. Com aumentos impressionantes na resistência aos antibióticos e a atual falta de vacinas aprovadas, protocolos de pesquisa padronizados são críticos para estudar esse formidável patógeno. Aqui, metodologias são apresentadas para examinar a patogênese molecular de Shigella usando análises in vitro de adesão, invasão e replicação intracelular bacteriana em células epiteliais colônicas. Antes das análises da infecção, o fenótipo de virulência das colônias de Shigella foi verificado pela absorção do corante vermelho Congo em placas de ágar. Meios laboratoriais suplementados também podem ser considerados durante a cultura bacteriana para mimetizar condições in vivo . As células bacterianas são então utilizadas em um protocolo padronizado para infectar células epiteliais colônicas em placas de cultura de tecidos em uma multiplicidade estabelecida de infecção com adaptações para analisar cada estágio da infecção. Para os ensaios de aderência, as células de Shigella são incubadas com níveis reduzidos de meios para promover o contato bacteriano com as células epiteliais. Tanto para ensaios de invasão quanto para replicação intracelular, a gentamicina é aplicada por vários intervalos de tempo para eliminar bactérias extracelulares e permitir a avaliação da invasão e/ou a quantificação das taxas de replicação intracelular. Todos os protocolos de infecção enumeram bactérias aderentes, invadidas e/ou intracelulares diluindo em série lisados de células epiteliais infectadas e plaqueando unidades formadoras de colônias bacterianas em relação aos títulos infectantes em placas de ágar vermelho Congo. Em conjunto, esses protocolos permitem caracterizar e comparar de forma independente cada estágio da infecção por Shigella em células epiteliais para estudar este patógeno com sucesso.

Introdução

As doenças diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos são um importante fardo global para a saúde. Em 2016, as doenças diarreicas foram responsáveis por 1,3 milhão de mortes no mundo e foram a quarta causa de morte em crianças menores de cinco anos ^1,2. O patógeno bacteriano entérico Gram-negativo Shigella é o agente causador da shiguelose, uma das principais causas de mortes diarreicas no mundo³. A shigelose causa morbidade e mortalidade significativas a cada ano em crianças de países de baixa e média renda ^4,5, enquanto infecções em países de alta renda estão ligadas a surtos de creches, alimentos e água ^6,7,8,9. O desenvolvimento ineficaz de^vacinas10 e o aumento das taxas de resistência antimicrobiana (RAM)^11,12 têm dificultado o manejo de surtos de Shigella em larga escala. Dados recentes do Centers for Disease Control and Prevention mostram que quase 46% das infecções por Shigella nos Estados Unidos apresentaram resistência aos medicamentos em 2020^13,14, enquanto a Organização Mundial da Saúde declarou a Shigella como um patógeno prioritário para a RAM, para o qual novas terapias são urgentemente necessárias¹⁵.

As infecções por Shigella são facilmente transmitidas pela via fecal-oral após a ingestão de água ou alimentos contaminados, ou através do contato humano direto. Shigella evoluiu para ser um patógeno eficiente, adaptado ao homem, com uma dose infecciosa de 10-100 bactérias suficiente para causar doença¹⁶. Durante o trânsito do intestino delgado, Shigella é exposta a sinais ambientais, como temperatura elevada e bile¹⁷. A detecção desses sinais induz alterações transcricionais para expressar fatores de virulência que aumentam a capacidade da bactéria de infectar o cólon humano 17,18,19. Shigella não invade o epitélio colônico a partir da superfície apical, mas transita através da camada epitelial após captação em células especializadas de microdobras apresentadoras de antígenos (células M) dentro do epitélio associado ao folículo 20,21,22. Após a transcitose, as células de Shigella são fagocitadas por macrófagos residentes. Shigella escapa rapidamente do fagossomo e desencadeia a morte celular de macrófagos, resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias ^5,23,24. Shigella então invade células epiteliais colônicas do lado basolateral, lisa o vacúolo macropinocítico e estabelece um nicho replicativo no citoplasma ^5,25. As citocinas pró-inflamatórias, particularmente a interleucina-8 (IL-8), recrutam leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) para o local da infecção, o que enfraquece as tight junctions epiteliais e permite a infiltração bacteriana do revestimento epitelial para exacerbar a infecção basolateral⁵. Os PMNs destroem o revestimento epitelial infectado para conter a infecção, o que resulta nos sintomas característicos da disenteria bacilar (sangrenta)⁵. Embora os mecanismos de invasão e replicação intracelular tenham sido completamente caracterizados, novas pesquisas estão demonstrando novos conceitos importantes na infecção por Shigella, incluindo regulação da virulência durante o trânsito gastrointestinal (GI)¹⁷, adesão¹⁹, melhor acesso basolateral através da permeabilidade da barreira²⁶ e carreamento assintomático em crianças desnutridas²⁷.

A capacidade de Shigella spp causar doença diarreica é restrita a humanos e primatas não humanos (PNH)²⁸. Modelos de infecção intestinal por Shigella foram desenvolvidos para zebrafish²⁹, camundongos³⁰, cobaias³¹, coelhos 21,32,33 e suínos^34,35. No entanto, nenhum desses sistemas-modelo pode replicar com precisão as características da doença observadas durante a infecção humana³⁶. Embora modelos de shigelose do NHP tenham sido estabelecidos para estudar a patogênese da Shigella, esses sistemas modelo são caros de implementar e requerem doses infecciosas artificialmente altas, até nove ordens de magnitude superiores à dose infecciosa em humanos 37,38,39,40,41,42. Assim, a notável adaptação de Shigella para infecção de hospedeiros humanos requer o uso de culturas de células derivadas de humanos para recriar modelos fisiologicamente relevantes para interrogação precisa da patogênese de Shigella.

Aqui, procedimentos detalhados são descritos para medir as taxas de aderência, invasão e replicação de Shigella dentro de células epiteliais colônicas HT-29. Usando esses protocolos padronizados, os mecanismos moleculares pelos quais os genes de virulência bacteriana e os sinais ambientais impactam cada etapa da infecção por Shigella podem ser interrogados para melhor entender a relação dinâmica de interação patógeno-hospedeiro.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e materiais

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

1. Meio TSB: Adicionar 0,5 L de água deionizada (DI) a 15 g de caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabela de Materiais) meio e autoclave. Conservar à temperatura ambiente.
2. Meio de sais biliares (TSB + BS): Para preparar TSB contendo 0,4% (p/v) de sais biliares, ressuspenda 0,06 g de sais biliares (BS, ver Tabela de Materiais) em 15 mL de TSB autoclavado. Esterilizar o filtro usando um filtro de PES de 0,22 μm.
   NOTA: Os sais biliares consistem numa mistura 1:1 de colato de sódio e desoxicolato de sódio. Preparar meios frescos imediatamente antes da utilização.
3. DMEM + 10% (v/v) de SFB: Adicionar 5 mL de soro fetal bovino (SFB) a 45 mL de meio de águia modificado (DMEM) de Dulbecco. Conservar a 4 °C.
4. DMEM + gentamicina: Para um tubo de 50 mL, adicionar 50 mL de DMEM e 50 μL de 50 mg/mL de gentamicina (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Fazer alíquota fresca e aquecer em banho-maria a 37 °C antes de cada experimento.
5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Adicionar 150 μL de Triton X-100 a 15 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   NOTA: Fazer alíquota fresca e aquecer em banho-maria a 37 °C antes de cada experimento.
6. TSB + placas indicadoras vermelhas Congo: Adicione 15 g de TSB, 7,5 g de ágar selecionado e 0,125 g de corante vermelho Congo (ver Tabela de Materiais) a um frasco de 1 L. Adicione 0,5 L de água DI e autoclave. Despeje 10-20 mL de meio em placas de Petri estéreis individuais (100 mm x 15 mm) e deixe solidificar.
   CUIDADO: O vermelho Congo é cancerígeno e uma toxina reprodutiva. Certifique-se de que o manuseio do vermelho Congo seja realizado usando o equipamento de proteção individual apropriado. Consulte a ficha de dados de segurança do produto para obter informações adicionais.
   NOTA: Aproximadamente 20 placas são feitas de 0,5 L de mídia vermelha Congo. As placas podem ser preparadas com 2-3 dias de antecedência e deixadas invertidas à temperatura ambiente até o uso. Para armazenamento a longo prazo, coloque placas invertidas em mangas plásticas a 4 °C por até 3 meses.
7. DMEM + 10% (v/v) de SFB e 5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO): Adicionar 42,5 mL de DMEM, 5 mL de SFB e 2,5 mL de DMSO a um tubo de 50 mL. Conservar a 4 °C.

2. Preparação de bactérias

NOTA: Todos os protocolos de cultivo e armazenamento em laboratório de Shigella são adaptados de Payne, S. ^M.43.

CUIDADO: Shigella spp são patógenos do Grupo de Risco^{2 44}. Realizar todo o trabalho laboratorial em ambiente BSL-2, com medidas adicionais de segurança tomadas para limitar exposições acidentais devido à baixa dose infecciosa de Shigella spp.

1. Crescimento de Shigella a partir de estoques congelados
   1. Transfira uma pequena quantidade de cultura congelada do frasco criogênico para uma placa de ágar vermelho TSB + Congo usando um aplicador estéril.
   2. Chamas esterilizar um ciclo de inoculação e deixá-lo esfriar. Estria o inóculo para frente e para trás em um quadrante da placa. Chame o laço, deixe esfriar e, em seguida, passe do primeiro quadrante para o segundo quadrante da placa. Repita para colocar o inóculo no terceiro e quarto quadrantes da placa.
      NOTA: Alternativamente, estriar o inóculo usando um aplicador estéril fresco entre cada quadrante.
   3. Inverter a placa e incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: A incubação a temperaturas ≥37 °C é necessária para a expressão dos fatores de virulência de Shigella necessários para a observação do fenótipo vermelho Congo positivo (CR⁺)⁴⁵. As colônias avirulantes terão uma aparência branca e não serão invasivas.
   4. Selar a placa com filme de parafina e conservar refrigerado a 4 °C.
      NOTA: As colônias bacterianas permanecerão viáveis em placas de ágar por 1-2 semanas.
2. Crescimento noturno de Shigella em cultura líquida
   1. Alíquota 3 mL de TSB em tubos de cultura estéreis de 14 mL.
   2. Escolha uma única colônia vermelha (CR+) bem isolada usando um aplicador estéril e ressuspenda em meio líquido.
   3. Incubar culturas durante a noite (16-18 h) a 37 °C com agitação a 250 rotações por minuto (rpm).

3. Preparação de células eucarióticas HT-29

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços. As linhagens celulares HT-29 foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). Os protocolos de manutenção do HT-29 são adaptados das recomendações da ATCC⁴⁶. Todos os meios devem ser pré-aquecidos em banho-maria a 37 °C antes da utilização. Todos os protocolos de manutenção do HT-29 devem ser realizados em gabinete de biossegurança. Abster-se de produzir bolhas ao misturar/trabalhar com células HT-29 em meios para evitar mudanças dramáticas no pH.

1. Descongelamento de células HT-29 de estoque congelado
   1. Descongelar o frasco para injetáveis de células HT-29 num banho-maria a 37 °C.
      NOTA: Certifique-se de que a tampa permaneça totalmente acima da água para evitar contaminação. O descongelamento deve demorar menos de 2 min.
   2. Retire o frasco para injetáveis da água imediatamente após a cultura estar totalmente descongelada e descontamine com etanol a 70%. Certifique-se de que todas as etapas a partir deste ponto sejam executadas usando técnicas assépticas.
   3. Adicionar todo o conteúdo do frasco para injetáveis a um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 9 ml de DMEM + 10% de SFB. Centrifugar a 125 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   4. Decantar o sobrenadante em um recipiente de resíduos e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM quente + 10% FBS. Transferir as células ressuspensas para um frasco de cultura de tecidos (T75) de 75^cm2 contendo 10 mL de DMEM quente + 10% de SFB (volume total de 20 mL).
   5. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células atinjam 90% de confluência (aproximadamente 6-7 dias).
      NOTA: A confluência é estimada através de aproximação visual.
2. Semeadura de células HT-29
   1. Pré-aquecer 20 mL de PBS e 50 mL de DMEM + 10% FBS em banho-maria a 37 °C e pré-aquecer 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (p/v) à temperatura ambiente.
   2. Uma vez que as células HT-29 (a partir do passo 3.1) atinjam 90% de confluência, decantar o meio de cultura de células HT-29 do frasco T75 para um recipiente de resíduos. Despeje ~10 mL de PBS quente no frasco e gire suavemente para lavar. Decantar o PBS em um recipiente de resíduos. Lave com PBS morno novamente e decante.
   3. Adicionar 2-3 mL de 0,25% (p/v) de tripsina-EDTA e girar suavemente por toda a área de superfície. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 4 min.
   4. Retire o balão da incubadora e gire suavemente a tripsina-EDTA, garantindo visualmente que todas as células se desprendem da superfície.
   5. Adicione imediatamente 6 mL de DMEM quente + FBS a 10% para desativar a tripsina. Pipetar para cima e para baixo para misturar completamente.
   6. Transfira todo o conteúdo para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire-o a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   7. Decantar suavemente o sobrenadante em um recipiente de resíduos e ressuspender o pellet em 6 mL de DMEM quente + 10% FBS.
   8. Imediatamente após a ressuspensão, transferir 10 μL de células HT-29 suspensas do meio da cultura para um tubo de PCR de 0,2 mL. Adicionar 10 μL de corante azul de Trypan ao tubo de PCR e misturar.
   9. Adicione 10 μL de mistura de células HT-29/azul de Trypan a uma lâmina descartável da câmara de contador de células da Condessa (ver Tabela de Materiais). Enumere o número de células vivas e calcule a viabilidade celular.
      Observação : ao documentar o número de células no exemplo, leia o número sob a contagem de células "ao vivo", não a contagem total de células. Alternativamente, a enumeração celular pode ser realizada manualmente usando um hemocitômetro.
   10. As células HT-29 ressuspendidas da semente em um frasco T75 fresco ou placa de 6 poços.
       1. Para o balão T75:
          1. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, transferir 2,5 x 10⁶ células para um balão T75 fresco de acordo com a equação abaixo:
             
          2. Adicionar DMEM quente + meio FBS a 10% para um volume final de 20 mL (concentração final de 1,25 x 10⁵ células/mL).
          3. Dispersar as células uniformemente pelo balão, balançando suavemente para frente e para trás.
          4. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células atinjam 80% de confluência.
             NOTA: Para um crescimento ideal, substitua o meio DMEM + 10% FBS no frasco T75 a cada ~3 dias. Decantar o meio para um recipiente de resíduos e adicionar 10 ml de PBS quente ao balão. Gire o PBS suavemente e decante-o no recipiente de resíduos. Em seguida, adicionar 20 mL de DMEM fresco e quente + FBS a 10% ao balão e retornar à incubadora a 37 °C, 5% CO₂ .
       2. Para placa de 6 poços:
          1. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, transferir 5,85 x 10⁶ células para um tubo cônico fresco de 50 mL de acordo com a equação abaixo:
             
          2. Adicionar DMEM quente + meio FBS a 10% para um volume final de 26 mL (concentração final de 2,25 x 10⁵ células/mL).
          3. Pipetar suavemente para misturar e, em seguida, distribuir 2 mL (4,5 x 10⁵ células) em poços individuais de placas de 6 poços.
          4. Disperse as células uniformemente pelo poço, balançando suavemente para cima/para baixo e esquerda/direita 2-3x.
          5. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ até que as células atinjam 80%-95% de confluência (aproximadamente 3-4 dias).
             NOTA: 85% de confluência é recomendada para ensaios de invasão e replicação intracelular, enquanto 90%-95% de confluência é recomendada para ensaios de adesão. As células devem atingir ~85% de confluência após 48 h de incubação com uma concentração final de aproximadamente 1 x 10⁶ células/poço. Podem ser necessários ajustes no número de células semeadas e no comprimento de incubação.
3. Fabricação de estoques HT-29 congelados
   1. Alíquota 1 mL de DMEM + 10% FBS + 5% meio DMSO em frascos criogênicos individuais.
   2. Adicionar 1 x 10⁶ células HT-29 do passo 3.2.7 a cada frasco para injetáveis. Calcule o volume de células de acordo com a fórmula abaixo:
      
   3. Loja HT-29 células a longo prazo abaixo de -130 °C em congelador de armazenamento de vapor de nitrogênio líquido.

4. Ensaio de adesão

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
   1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
   2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam uma densidade óptica (OD₆₀₀) de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
2. Transferir 2 x 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFCs) Shigella subcultivadas para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD₆₀₀ de 0,7. Use leituras OD₆₀₀ para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
3. Lave cada amostra de Shigella 2x com PBS.
   1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
   2. Repita a etapa 4.3.1 1x tempo adicional.
   3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 ml (1 x 10⁸ UFC) de Shigella ressuspendida a cada poço das monocamadas epiteliais colónicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir do passo 3.2.10.2).
   NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM quente até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM aquecido e, em seguida, aplique 1 mL (1 x 10⁷ UFCs) às células HT-29.
5. Incubar as placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 horas.
6. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
   1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 4.3.3) em PBS.
   2. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7, respectivamente.
7. Após a incubação, lavar as monocamadas 4-5x com PBS.
   1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
   2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
   3. Repita as etapas 4.7.1 e 4.7.2 4x vezes adicionais.
8. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
9. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
10. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
11. Determine o número de bactérias associadas às células.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 4.10) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
       NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 e 1 x ^10-5, respectivamente.

5. Ensaio de invasão

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
   1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
   2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam um OD₆₀₀ de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
2. Transfira 2 x 10⁸ UFCs subcultivadas Shigella para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD₆₀₀ de 0,7. Use leituras OD₆₀₀ para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
3. Lave amostras de Shigella 1x com PBS.
   1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
   2. Repita a etapa 5.3.1. 1x tempo adicional.
   3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 mL (1 x 10⁸ UFCs) de Shigella ressuspendida mais 1 mL de DMEM a cada poço das monocamadas epiteliais colônicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir da etapa 3.2.10.2).
   NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM e, em seguida, adicione 1 mL (1 x 10⁷ UFCs) às células HT-29.
5. Para promover o contato bacteriano com as células HT-29, centrifugar as placas de 6 poços a 2.000 x g por 10 min à temperatura ambiente ou 37 °C se o ajuste de temperatura puder ser ajustado.
   NOTA: A centrifugação promove o contato bacteriano com as células HT-29, o que ignora a necessidade de fatores de aderência e permite que as bactérias invadam rapidamente as células.
6. Incubar placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂ durante 45 minutos.
7. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
   1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 5.3.3) em PBS.
   2. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7, respectivamente.
8. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
   1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
   2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
   3. Repita as etapas 5.8.1 e 5.8.2 2x vezes adicionais.
9. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C com 5% de CO₂.
10. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repita o passo de lavagem 5.8.
11. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 60 min a 37 °C com 5% de CO₂.
12. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repita o passo de lavagem 5.8.
13. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
14. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
15. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
16. Determine o número de bactérias intracelulares.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 5.15) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-2 e 1 x ^10-3 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
       NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x ^10-2 e 1 x ^10-3 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4, respectivamente.

6. Ensaio de replicação intracelular

NOTA: Todos os volumes são consistentes com um ensaio usando duas placas de 6 poços.

1. Subcultura durante a noite culturas de Shigella via diluição 1:50 em meios frescos.
   1. Vórtice e, em seguida, adicionar 100 μL de cada cultura noturna a 5 mL de TSB fresco ou TSB + BS em um tubo de cultura de tamanho adequado.
      NOTA: Limitar o volume de cultura a <20% do volume do frasco ou tubo de cultura para garantir a aeração adequada.
   2. Incubar a 37 °C com agitação a 250 rpm até que as células atinjam um OD₆₀₀ de 0,7 (fase logarítmica média de crescimento de Shigella ); cerca de 2-2,5 h.
      NOTA: Durante a subcultura, alíquota 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicina e um volume suficiente de PBS para todas as etapas de lavagem e colocar em banho-maria a 37 °C. Permitir que os meios atinjam 37 °C antes da utilização.
2. Transfira 2 x 10⁸ UFCs subcultivadas Shigella para tubos individuais de microcentrífuga de 2 mL.
   NOTA: 2 x 10⁸ UFC corresponde a aproximadamente 1 mL de células bacterianas em um OD₆₀₀ de 0,7. Use leituras OD₆₀₀ para aproximar UFC/mL de acordo com a calibração de cada espectrofotômetro individual.
3. Lave amostras de Shigella 1x com PBS.
   1. Células de pellet por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, adicionar 1 mL de PBS morno e ressuspender bem o pellet, pipetando suavemente a amostra para cima e para baixo até que a mistura esteja totalmente homogênea (8-10x).
   2. Repita a etapa 6.3.1. 1x tempo adicional.
   3. As células de pellets, por centrifugação a 17.000 x g por 2 min à temperatura ambiente, aspiram o sobrenadante e ressuspendem os pellets em 2 mL de DMEM quente.
      OBS: A concentração final das bactérias ressuspensas será de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vórtice e, em seguida, adicionar 1 mL (1 x 10⁸ UFCs) de Shigella ressuspendida mais 1 mL de DMEM a cada poço de monocamadas epiteliais colônicas HT-29 preparadas em placas de 6 poços (a partir da etapa 3.2.10.2).
   NOTA: As infecções são normalmente realizadas em uma multiplicidade de infecção (MOI; proporção de células bacterianas para epiteliais) de 100. Para testar diferentes MOIs, diluir Shigella ressuspendida em DMEM até a concentração desejada e, em seguida, adicionar 1 mL de bactérias diluídas às monocamadas HT-29. Por exemplo, para testar um MOI de 10, dilua as bactérias 1:10 adicionando 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactérias a 1,35 mL de DMEM e, em seguida, aplique 1 mL (1 x 10⁷ UFCs) às células HT-29.
5. Para promover o contato bacteriano com as células HT-29, centrifugar as placas de 6 poços a 2.000 x g por 10 min à temperatura ambiente ou 37 °C se o ajuste de temperatura puder ser ajustado.
   NOTA: A centrifugação promove o contato bacteriano com as células HT-29, o que ignora a necessidade de fatores de aderência e permite que as bactérias invadam rapidamente as células.
6. Incubar placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂ durante 45 minutos.
7. Durante a incubação, determinar o título de infecção bacteriana.
   1. Preparar diluições seriadas de 10 vezes de células de Shigella ressuspensas (do passo 6.3.3) em PBS.
   2. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 em placas TSB + vermelho Congo e incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: O revestimento de 100 μL das diluições 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-6 e 1 x ^10-7, respectivamente.
8. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
   1. Aspirar o meio de cada poço.
      OBS: Ao aspirar o meio a partir de placas de 6 poços, guie a ponta do aspirador ao longo do lado inferior dos poços, tentando evitar o contato com as células HT-29.
   2. Adicione 1 mL de PBS morno a cada poço e lave delicadamente.
      NOTA: Para lavar suavemente as monocamadas de 6 poços com PBS, mova a placa para cima e para baixo e de um lado para o outro na bancada. Lavar placas em movimento circular e/ou remover a placa da superfície da bancada pode causar a remoção mecânica de células do plástico.
   3. Repita as etapas 6.8.1 e 6.8.2 2x vezes adicionais.
9. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente suplementado com 50 μg/mL de gentamicina em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C com 5% de CO₂.
10. Lave bem as células HT-29 infectadas 3x com 1 mL de PBS.
    1. Repetir o passo de lavagem 6.8.
11. Remover PBS por aspiração, em seguida, adicionar 2 mL de DMEM quente com 50 μg/mL de gentamicina a cada poço das placas de 6 poços e incubar a 37 °C com 5% de CO₂ pelo tempo desejado para permitir a replicação intracelular (até 24 h).
12. Lave bem as células 2x com 1 mL de PBS.
    1. Repetir o passo de lavagem 6.8.
13. Remover PBS por aspiração e lisar células HT-29 adicionando 1 mL de PBS + 1% Triton X-100 a cada poço.
14. Incubar placas de 6 poços a 37 °C durante 5 minutos.
15. Use um raspador de células ou uma ponta de pipeta dobrada para raspar as células lisadas do fundo do poço e transferir o 1 mL completo para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mL.
16. Determine o número de bactérias intracelulares.
    1. Vórtice cada tubo (a partir do passo 6.15) durante pelo menos 30 s para deslocar ainda mais Shigella das células eucarióticas lisadas.
    2. Preparar diluições seriadas de lisados de 10 vezes em PBS.
    3. Placa 100 μL das diluições 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 em placas TSB + Congo Red e incubar durante a noite a 37 °C.
       NOTA: O chapeamento de 100 μL das diluições 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 e 1 x ^10-4 corresponde a um fator de diluição final de 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 e 1 x ^10-5, respectivamente.

Resultados

Ensaios de aderência, invasão e replicação intracelular foram realizados comparando S. flexneri 2457T wild type (WT) com S. flexneri ΔVF (ΔVF), um mutante hipotetizado para regular negativamente a virulência de Shigella. Como Shigella utiliza sais biliares como sinal para regular a virulência 17,18,47, experimentos foram realizados após subcultivo bacteriano em meio TSB e TSB suplementado com sais biliares a 0,4% (p/v) ¹⁸. A exposição dos sais biliares durante a etapa de subcultivo atua como um pré-tratamento para replicar o trânsito do intestino delgado antes da infecção colônica 17,18,47. A Figura 1 analisa o efeito da mutação ΔVF na capacidade de adesão de S. flexneri às células epiteliais colônicas HT-29. A porcentagem de aderência é plotada no eixo y e representa a razão de bactérias recuperadas após lise HT-29 padronizada para o número de bactérias de entrada. Como esperado, ambas as linhagens de S. flexneri WT e ΔVF tiveram um aumento significativo na aderência quando subcultivadas com suplementação de sais biliares em comparação com TSB sem suplementação de sais biliares¹⁸. No entanto, não houve diferença na aderência às células HT-29 entre as cepas mutantes WT e ΔVF dentro de cada condição de subcultura. Esses dados indicam que a mutação ΔVF não tem efeito sobre a capacidade de adesão de S. flexneri às células epiteliais HT-29 com ou sem os sais biliares pré-tratamento.

Na Figura 2, foi analisado o efeito da mutação ΔVF na capacidade de invasão (Figura 2A) e replicação (Figura 2B) do S. flexneri no interior de células epiteliais colônicas HT-29 com ou sem sais biliares pré-tratamento. A porcentagem de recuperação é plotada no eixo y e representa a proporção de células bacterianas recuperadas após a lise celular HT-29 padronizada para o número de bactérias de entrada. Na Figura 2A, houve um aumento significativo esperado na capacidade do WT S. flexneri 2457T de invadir células HT-29 após pré-exposição aos sais biliares⁴⁸, enquanto o mutante S. flexneri ΔVF exibiu um aumento menor na invasão após a pré-exposição aos sais biliares em comparação com a cepa WT. O mutante ΔVF apresentou taxas de invasão aumentadas de células HT-29 em comparação com o WT subcultivado em TSB, mas teve taxas de invasão semelhantes às WT quando subcultivado em TSB suplementado com sais biliares (Figura 2A). Esses resultados sugerem que a mutação ΔVF aumenta a capacidade de S. flexneri invadir células HT-29, o que diminui o efeito dos sais biliares pré-exposição, embora a capacidade de invasão do mutante ΔVF tenha aumentado ainda mais após a subcultura de sais biliares.

No geral, 10 vezes mais bactérias foram recuperadas após incubação noturna (Figura 2B) em comparação com a incubação de 90 min (Figura 2A), o que demonstra as diferenças no monitoramento do crescimento intracelular versus invasão, respectivamente. Quando as células HT-29 infectadas foram incubadas por 18 h para permitir a replicação intracelular da bactéria (Figura 2B), o impacto do pré-tratamento com sais biliares diminuiu tanto para as cepas WT quanto ΔVF . No entanto, o efeito reduzido dos sais biliares pré-tratamento durante a replicação intracelular foi mais dramático para o mutante ΔVF . Como o aumento da replicação intracelular de ambas as cepas quando pré-expostas aos sais biliares foi menor do que o aumento das taxas de invasão nas mesmas condições, hipotetizamos que os sais biliares têm maior impacto nos passos iniciais da patogênese de S. flexneri . O mutante ΔVF exibiu um aumento na porcentagem de recuperação da replicação noturna dentro das células HT-29 em comparação com WT (Figura 2B) após ambas as condições de subcultivo. No entanto, as recuperações percentuais do mutante ΔVF foram semelhantes, independentemente dos sais biliares pré-exposição. Essas tendências de dados sugerem que o mutante ΔVF se replica mais eficientemente dentro das células HT-29 em comparação com o WT, e que a pré-exposição dos sais biliares não afeta a capacidade do mutante ΔVF de se replicar intracelularmente, como observado para WT (Figura 2B). Uma vez que a diferença entre as cepas mutante e WT na condição de pré-exposição aos sais biliares não foi observada durante o ensaio de invasão de 90 min, hipotetizamos que o produto codificado pelo gene VF excluído também pode regular a replicação de S. flexneri dentro das células HT-29. Combinadas, ambas as análises demonstram que o mutante ΔVF é mais virulento em relação ao WT, o que sugere que o produto do gene VF é um regulador negativo da virulência de S. flexneri .

Figura 1: A pré-exposição aos sais biliares induziu a aderência de S. flexneri às células HT-29. Células mutantes de S. flexneri 2457T WT e ΔVF foram subcultivadas em TSB ou TSB suplementadas com 0,4% (p/v) de sais biliares (TSB+BS). As bactérias foram então aplicadas às células HT-29 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 e incubadas por 3 h para examinar a aderência. Após a incubação, as células HT-29 infectadas foram lavadas e lisadas, e diluições seriadas das bactérias recuperadas foram plaqueadas para enumerar unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL). O número de bactérias aderentes é plotado em relação aos títulos de bactérias de entrada para estabelecer o percentual de adesão. Os dados são representativos de uma réplica biológica com três réplicas técnicas (pontos individuais). As barras de erro indicam o erro padrão da média (EPM). A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student (*p < 0,05; ***p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A pré-exposição dos sais biliares aumentou a invasão WT S. flexneri e a replicação intracelular. Células mutantes S. flexneri 2457T WT e ΔVF foram subcultivadas em TSB ou TSB suplementadas com meios de sais biliares (TSB+BS). As bactérias foram então aplicadas às células HT-29 a MOI de 100, centrifugadas sobre as células e incubadas a 37 °C com 5% de CO₂ por 45 min. As células foram lavadas com PBS, e as bactérias extracelulares foram lisadas pela adição de gentamicina ao DMEM para recuperar exclusivamente as bactérias intracelulares. Após 90 min (A, invasão bacteriana) ou 18 h (B, replicação intracelular), as células HT-29 infectadas foram lavadas e lisadas, e diluições seriadas das bactérias recuperadas foram plaqueadas para enumerar unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL). O número de bactérias intracelulares é plotado em relação aos títulos bacterianos de entrada para estabelecer a porcentagem de recuperação. Os dados são representativos de uma réplica biológica, cada uma com três réplicas técnicas (pontos individuais). A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student (*p < 0,05). Observe as diferenças nas escalas do eixo y entre os painéis (A) e (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo descreve um conjunto de três ensaios padronizados para estudar a adesão, invasão e replicação intracelular de células epiteliais intestinais por Shigella. Embora esses métodos sejam apenas versões modificadas dos ensaios clássicos de gentamicina usados para estudar a invasão e replicação intracelular de vários patógenos bacterianos dentro das células hospedeiras 49,50,51, considerações especiais devem ser aplicadas no estudo de Shigella.

Shigella são anaeróbios facultativos, que crescem idealmente a 37 °C em meio rico com aeração⁴³. Ao realizar estes ensaios para interrogar os efeitos de diferentes sinais ambientais ou metabólitos em infecções por Shigella, recomenda-se cultivar Shigella em meios ricos durante a noite, em seguida, subcultura em meios definidos ou suplementados para a fase de log médio antes da infecção. A máxima expressão gênica de virulência ocorre durante a fase logarítmica do crescimento^52,53. Assim, subcultivar culturas noturnas de Shigella e permitir o crescimento bacteriano até a fase exponencial (OD₆₀₀ ~ 0,7) são passos necessários para avaliar adequadamente a virulência de Shigella. Além disso, a expressão gênica de virulência é dependente da temperatura. Para garantir a especificidade para expressão apenas durante a infecção do hospedeiro, genes de virulência são induzidos em temperaturas fisiológicas do hospedeiro (37 °C) e rigorosamente reprimidos em temperaturas mais baixas (por exemplo, 30 °C)⁵⁴. Para garantir a expressão de genes de virulência, o subcultivo bacteriano e as infecções devem ser realizados a 37 °C, com o devido cuidado para garantir que a temperatura não caia abaixo de 37 °C. Um grande plasmídeo de virulência de 220 quilobases, que codifica a maquinaria molecular necessária para invasão e infecção de células epiteliais, é um determinante essencial de virulência para todos os Shigella spp⁵. Repetidos passaging e crescimento prolongado a 37 °C promovem instabilidade plasmidial de virulência, resultando em perda plasmidial e tornando as células de Shigella avirulentas⁵⁵. Para garantir a manutenção do plasmídeo de virulência e a expressão de genes de virulência cruciais, recomenda-se a remoção de bactérias diretamente dos estoques de freezer a cada duas semanas em placas indicadoras frescas TSB + Congo red. O ágar-vermelho Congo pode ser usado para diferenciar entre colônias virulentas do tipo selvagem (vermelhas, CR⁺) e colônias avirulentas (brancas^{, CR-}) que perderam o plasmídeo de virulência⁴⁵. Se a instabilidade plasmidial de virulência for repetidamente observada, culturas noturnas de Shigella podem ser incubadas a 30 °C para evitar a perda plasmidial de virulência, seguidas de subcultivo a 37 °C para promover a expressão gênica de virulência⁴³. Finalmente, se forem realizadas análises com mutantes e/ou cepas complementadas, nas quais marcadores de antibióticos estão presentes nessas cepas bacterianas, recomenda-se o uso da seleção antibiótica apropriada durante as etapas de pernoite e subcultura bacteriana.

O uso de monocamadas epiteliais HT-29 apresenta muitas vantagens para o estudo dos mecanismos moleculares da patogênese de Shigella in vitro. Como Shigella é um patógeno adaptado ao homem, modelos de pequenos animais não refletem com precisão a patogênese característica da shigelose observada em humanos³⁶. Assim, o uso de protocolos padronizados para infecção de linhagens celulares derivadas de humanos permite o interrogatório quantitativo de etapas individuais da patogênese bacteriana para caracterizar a interação molecular entre este patógeno e seu hospedeiro nativo. Historicamente, as células HeLa foram predominantemente utilizadas para estudar interações patógeno-hospedeiro in vitro 25,56,57. No entanto, as células HeLa são uma linhagem celular de câncer cervical imortalizada, que são células hospedeiras não nativas para patógenos bacterianos entéricos. Assim, estudos in vitro da patogênese entérica têm se deslocado para o uso de linhagens celulares de adenocarcinoma colônico (por exemplo, HT-29, Caco-2 e T84), que recapitulam mais fielmente a morfologia epitelial intestinal, podendo ser cultivadas em transwells como monocamadas epiteliais com superfícies apicais e basolaterais diferenciadas58,59,60. Embora cada linhagem celular tenha seus pontos fortes e fracos individuais, as células HT-29 são utilizadas nos ensaios aqui descritos devido às semelhanças fenotípicas com os enterócitos intestinais e à expressão robusta de receptores de superfície celular e citocinas pró-inflamatórias58,59,61. No entanto, cada um desses modelos discutidos são linhagens celulares derivadas do câncer com fenótipos metabólicos e de crescimento aberrantes que não representam com precisão o estado fisiológico natural do epitélio colônico in vivo⁵⁸. Recentes avanços nas técnicas de cultura de tecidos humanos têm possibilitado o cultivo de células-tronco intestinais humanas, obtidas a partir de biópsias teciduais, em organoides ou monocamadas unidimensionais de células bidimensionais que recapitulam os diversos tipos celulares presentes no trato gastrointestinal (GI) humano 62,63,64. Os organoides intestinais podem ser diferenciados para incluir enterócitos, células caliciformes produtoras de muco, células M e outros tipos de células específicas do tecido. Estudos recentes validaram o uso desses modelos organoides para o estudo de patógenos entéricos, incluindo vários patógenos de Shigella spp., Salmonella enterica e Escherichia coli 62,63,64. Embora os organoides sejam modelos mais precisos do epitélio gastrointestinal humano e possam até ser cultivados em condições variadas de nutrientes para representar a população global⁶⁵, sua relativa complexidade requer treinamento e conhecimento técnico significativos, resultando em custos mais elevados e tempos de cultivo mais longos em comparação com linhagens de células cancerosas tradicionais⁵⁸.

Este protocolo descreve métodos de rendimento médio, em que duas placas de 6 poços são usadas para um total de 12 monocamadas disponíveis para teste. No entanto, os experimentos podem ser facilmente dimensionados para aumentar o número de monocamadas semeadas, a fim de acomodar réplicas técnicas adicionais, ou testar mutantes Shigella adicionais e sinais ambientais. Placas de cultura de tecidos com mais poços (por exemplo, placas de 12 ou 24 poços) também podem ser usadas com ajustes apropriados para dar conta de poços com diâmetros menores. Sob as condições de crescimento HT-29 descritas na etapa 3.2, os títulos HT-29 são suficientes para semear cerca de seis placas de 6 poços após o cultivo a partir de um frasco T75, com células remanescentes suficientes para manter a cultura de células HT-29. Além disso, as etapas de semeadura das monocamadas HT-29 e preparação das bactérias inoculantes são idênticas entre os ensaios de aderência, invasão e replicação intracelular bacteriana. Assim, ensaios testando as mesmas cepas de Shigella ou condições de subcultivo podem ser facilmente realizados em paralelo para examinar simultaneamente o papel de cada condição experimental em várias etapas da infecção por Shigella .

Os títulos de recuperação para bactérias aderentes (etapa 4), invadidas (etapa 5) e intracelulares (etapa 6) são determinados por diluições seriadas em plaqueamento de células HT-29 infectadas após lise, o que permite avaliar quantitativamente a eficiência de cada estágio da infecção por Shigella. As etapas de centrifugação nos ensaios de invasão e replicação intracelular, baseados em ensaios clássicos 49,50,51, promovem o contato bacteriano com as células hospedeiras para invasão imediata e aumentam as taxas de invasão. Assim, a centrifugação "pula" a etapa de aderência, que mais tarde foi descoberta como um aspecto importante da infecção por Shigella 17,18,19,66. É essencial notar que a etapa de centrifugação não pode ser realizada com células epiteliais polarizadas semeadas em transwells. Para o ensaio de aderência, entretanto, a adesão não é forçada pela centrifugação, e nenhuma gentamicina é adicionada às células HT-29 infectadas antes da lise, permitindo assim a enumeração das células bacterianas aderentes. O volume do meio de cultura de tecidos é reduzido para 1 mL (em oposição a 2 mL para os ensaios de invasão e replicação intracelular) para permitir um contato mais eficiente da bactéria com as células HT-29. Além disso, dependendo da taxa de adesão, alguma invasão e replicação intracelular podem ocorrer durante as 3 h de incubação, mas a quantidade é tipicamente insignificante (por exemplo, apenas 0,05% da população bacteriana recuperada após lise da célula hospedeira). No entanto, para explicar adequadamente as bactérias aderentes versus intracelulares durante as 3 h de incubação, recomenda-se a realização de ensaios paralelos, onde, além do protocolo indicado, uma segunda placa é incubada com 50 μg/mL de gentamicina em 2 mL de DMEM por poço por 45 min no total (15 min de incubação, lavagem, DMEM fresco + gentamicina por 30 min) para lisar completamente as bactérias extracelulares. Após a lise celular HT-29, como observado no protocolo, as bactérias intracelulares podem ser enumeradas como observado acima, e representarão o número de bactérias que invadiram. Este valor pode então ser subtraído das bactérias enumeradas da placa sem tratamento com gentamicina para determinar adequadamente as bactérias aderentes e invadidas. Análises paralelas também podem ser realizadas para fornecer mais informações sobre a replicação intracelular de Shigella dentro das células HT-29 após a invasão, por exemplo, usando vários pontos de tempo para realizar curvas de crescimento intracelular. Finalmente, juntamente com a enumeração de bactérias intracelulares após uma incubação de gentamicina de 18 h, os sobrenadantes da cultura podem ser coletados e analisados para a secreção de citocinas de células HT-29 infectadas. Por exemplo, a IL-8 é uma quimiocina secretada por células epiteliais que funciona em grande parte para recrutar PMNs para o local da infecção. A quantidade de IL-8 secretada nos meios de cultura de células HT-29 infectadas pode ser analisada com um ensaio de ELISA de IL-8⁶⁷.

Sais biliares provaram ser um importante sinal de virulência para Shigella durante o trânsito através do sistema gastrointestinal humano, e podem ser usados para suplementar meios de crescimento bacterianos nesses protocolos para replicar condições gastrointestinais típicas. Naturalmente, sais biliares são introduzidos no duodeno ou porção superior do intestino delgado para ajudar na digestão; e no íleo terminal ou final do intestino delgado, 95% dos sais biliares são removidos e reciclados de volta à circulação para depósito final na vesícula biliar⁶⁸. Os sais biliares geralmente têm uma concentração entre 0,2%-2,0% (p/v) no intestino delgado e são naturalmente bactericidas. No entanto, Shigella, juntamente com a maioria das bactérias entéricas, resiste aos sais biliares e usa os sinais para aumentar a infecção⁴⁷. Vários estudos documentaram como a exposição aos sais biliares, às vezes em conjunto com outros sinais do intestino delgado, como a glicose, afeta a sobrevivência da Shigella e a regulação da virulência antes da infecção. Foi demonstrado que Shigella resiste aos sais biliares, altera a expressão gênica e forma e dispersa um biofilme em condições que reproduzem o trânsito do intestino delgado^17,69. Os estudos têm demonstrado que essas alterações resultam em um fenótipo hipervirulento, no qual a adesão e a invasão são induzidas na subsequente infecção colônica por Shigella 17,18,19,48,66. Assim, as condições descritas acima documentam como subcultivar Shigella em sais biliares para mimetizar o trânsito do intestino delgado antes de realizar os ensaios de adesão, invasão ou replicação intracelular. A formulação de TSB especificada contém glicose adicionada em relação ao caldo Luria (LB) ^típico17. Assim, se o LB for utilizado, é importante também suplementar o meio com glicose (0,5%-2,0% [p/v]) para considerar adequadamente os sinais glicêmicos no intestino delgado¹⁷. Além disso, como mencionado acima, todas as subculturas de Shigella são lavadas para remover sais biliares e imitar a transição para o cólon para análises de infecção.

Tradicionalmente, e como destacado nos resultados acima (Figura 1 e Figura 2), os ensaios de infecção são valiosos para determinar o papel de um gene particular na infecção por Shigella . O fenótipo de vários mutantes, no entanto, pode não ser verdadeiramente apreciado sem a suplementação adequada dos meios de cultura bacterianos. Como pesquisas anteriores demonstraram, sais biliares alteram significativamente a expressão gênica de S. flexneri , incluindo genes para metabolismo central, fatores de transcrição, transportadores de açúcar, resistência a drogas e genes de virulência codificados no cromossomo ou plasmídeo de virulência¹⁷. Esses genes fornecem informações sobre como Shigella usa sais biliares como um sinal para alterar a expressão gênica e se preparar para uma eventual infecção do cólon, e análises mutacionais subsequentes precisam ser realizadas nos meios de crescimento bacterianos suplementados apropriados antes de examinar os efeitos sobre a virulência nos ensaios de adesão, invasão e replicação intracelular. Como visto acima na Figura 1 e Figura 2, a mutação ΔVF não afetou a aderência, mas afetou a invasão e a replicação intracelular. Uma vez que a mutação aumentou a invasão e a replicação intracelular, experimentos estão atualmente em andamento para determinar como o produto gênico regula a infecção. As análises mutantes servem como um exemplo de como novos entendimentos na patogênese da Shigella podem ser estudados, especialmente em condições que melhor replicam o trato gastrointestinal humano. Análises de complementação adequadas são recomendadas para validar os fenótipos de vários mutantes.

Em combinação, esses procedimentos descrevem experimentos quantitativos que fornecerão informações importantes sobre os mecanismos moleculares de aderência, invasão e replicação de Shigella dentro de células epiteliais colônicas HT-29, imitando melhor o ambiente natural do trato gastrointestinal humano durante a infecção. Estudos futuros podem expandir os mutantes e as condições experimentais para obter uma melhor compreensão de como Shigella se prepara e efetivamente infecta hospedeiros humanos. Apesar de décadas de pesquisa, ainda há muito mais a descobrir sobre a infecção por Shigella.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 μ m Filtro PES	Millipore-Sigma	SCGP00525	Filtro estéril de polietersulfona para esterilização de até 50 mL de mídia
Tubos de cultura de 14 mL Tubos	de ensaio de polipropileno Corning	352059	17 mm x 100 mm com tampa
Tubos cônicos de 50 mL	Corning	430829	50 mL de polipropileno transparente com tampa à prova de vazamentos
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Corning	3516	As placas são tratadas para uma fixação celular ideal
Sais biliares	Sigma-Aldrich	B8756	Proporção de 1:1 de colato para desoxicolato
Corante vermelho Congo	Sigma-Aldrich	C6277	Um corante diazo aniônico à base de benzidina, >85% de pureza
Corrediça de câmara de contagem de células Countess	Invitrogen	C10283	Para ser usado com o Contador de Células Automatizado Countess
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A um reagente orgânico altamente polar
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM é suplementado com alta glicose, piruvato de sódio, GlutaMAX e Fenol Vermelho
Fetal Soro Bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Gentamicina estéril inativada por calor
	Sigma-Aldrich	G3632	A concentração de estoque é de 50 mg/mL
Linha celular HT-29 Linha celular	ATCC	HTB-38	Linha celular de adenocarcinoma; colorretal em origem
Filme de parafina	Bemis	PM999	Filme de vedação de laboratório
Placas de Petri	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Placas de Petri para meios sólidos
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	concentração de 1x; pH 7,4
Selecione o ágar	Invitrogen	30391023	Uma mistura de polissacarídeos extraídos das paredes celulares de algas vermelhas para fazer meio de plaqueamento bacteriano
Frascos T75	Corning	430641U	Frascos de cultura de tecidos
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Um surfactante e emulsificante não iônico comum
Corante azul de tripano	Invitrogen	T10282	Um corante para detectar células mortas de cultura de tecidos; apenas células vivas podem excluir o corante
Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056	Reagente para dissociação celular para manutenção e passagem
linha celular Caldo de soja tríptico (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Meio de crescimento bacteriano