Modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva incorporando janela de crânio afinado e percussão fluida

Resumo

Este protocolo apresenta um modelo de camundongo modificado de lesão cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) induzida por um método de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI). A abordagem apresenta uma janela de crânio afinado e percussão de fluido para reduzir a inflamação comumente causada pela exposição às meninges, juntamente com melhor reprodutibilidade e precisão na modelagem de rmTBI em roedores.

Resumo

O traumatismo cranioencefálico leve é um distúrbio neurológico clinicamente altamente heterogêneo. Modelos animais de traumatismo cranioencefálico (TCE) altamente reprodutíveis com patologias bem definidas são urgentemente necessários para estudar os mecanismos da neuropatologia após TCE leve e testar terapêuticas. Replicar todas as sequelas do TCE em modelos animais provou ser um desafio. Portanto, a disponibilidade de vários modelos animais de TCE é necessária para levar em conta os diversos aspectos e gravidades observados em pacientes com TCE. CHI é um dos métodos mais comuns para fabricar modelos de roedores de rmTBI. No entanto, este método é suscetível a muitos fatores, incluindo o método de impacto usado, a espessura e a forma do osso do crânio, a apneia animal e o tipo de apoio de cabeça e imobilização utilizados. O objetivo deste protocolo é demonstrar uma combinação dos métodos de janela de crânio afinado e lesão por percussão de fluido (FPI) para produzir um modelo preciso de camundongo de rmTBI associado a CHI. O objetivo principal deste protocolo é minimizar os fatores que podem afetar a precisão e a consistência da modelagem CHI e FPI, incluindo espessura, forma e suporte de cabeça do osso do crânio. Ao utilizar um método de janela de crânio afinado, a inflamação potencial devido à craniotomia e FPI é minimizada, resultando em um modelo de camundongo aprimorado que replica as características clínicas observadas em pacientes com TCE leve. Os resultados do comportamento e da análise histológica usando coloração de hematoxilina e eosina (HE) sugerem que o rmTBI pode levar a uma lesão cumulativa que produz alterações no comportamento e na morfologia macroscópica do cérebro. No geral, o rmTBI associado ao CHI modificado apresenta uma ferramenta útil para os pesquisadores explorarem os mecanismos subjacentes que contribuem para alterações fisiopatológicas focais e difusas no rmTBI.

Introdução

O TCE leve, incluindo concussão e subconcussão, é responsável pela maioria de todos os casos de TCE (>80% de todos os TCE)¹. O TCE leve geralmente resulta de quedas, acidentes de trânsito, atos de violência, esportes de contato (por exemplo, futebol, boxe, hóquei) e combate militar ^2,3. O TCE leve pode levar a eventos neurobiológicos que afetam as funções neurocomportamentais ao longo da vida do paciente e aumentam o risco de doenças neurodegenerativas ^4,5,6. Os modelos animais fornecem um meio eficiente e controlado para estudar o TCE leve, com a esperança de melhorar ainda mais o diagnóstico e o tratamento do TCE leve. Vários modelos para TCE leve foram desenvolvidos, como os modelos de impacto cortical controlado (ICC), queda de peso (WD), lesão por percussão de fluidos (FPI) e TCE explosiva ^7,8. Nenhum modelo experimental único pode mimetizar toda a complexidade da patologia induzida por TCE ^9,10. A heterogeneidade desses modelos é vantajosa para abordar as diversas características associadas a pacientes com TCE leve e investigar os mecanismos celulares e moleculares correspondentes. No entanto, cada modelo animal de TCE tem suas limitações³, limitando nosso conhecimento atual sobre o TCE leve em animais e sua relevância clínica.

Os modelos WD e CCI são utilizados para replicar condições clínicas como perda de tecido cerebral, hematoma subdural agudo, lesão axonal, concussão cerebral, disfunção da barreira hematoencefálica e até coma após TCE ^3,11,12. O modelo WD envolve a indução de danos cerebrais ao atingir a dura-máter ou o crânio com pesos em queda livre. O impacto de um objeto pesado sobre um crânio intacto pode replicar lesões focais/difusas mistas; no entanto, esse método está associado a baixa precisão e repetibilidade do local da lesão, lesão por rebote e maior taxa de mortalidade por fraturas cranianas ^3,11,12. O modelo CCI envolve a aplicação de metal movido a ar para impactar diretamente a dura-máter exposta. Comparado ao modelo WD, o modelo CCI é mais preciso e reprodutível, mas não produz lesão difusa devido ao pequeno diâmetro da ponta impactante¹¹. Durante a modelagem FPI, o tecido cerebral é brevemente deslocado e deformado por percussão. A FPI pode induzir lesão focal/difusa mista e replicar hemorragia intracraniana, edema cerebral e danos progressivos à substância cinzenta após LCT. No entanto, o FPI tem uma alta taxa de mortalidade devido a danos no tronco encefálico e apneia prolongada ^3,12. A craniotomia envolvida nos modelos convencionais WD, CCI e FPI pode levar a contusão cortical, lesões hemorrágicas, danos à barreira hematoencefálica, infiltração de células imunes, ativação de células gliais, tempo de modelagem prolongado e possíveis desfechos fatais ^3,12.

O TCE leve é caracterizado por uma pontuação na escala de coma de Glasgow (escala de coma de Glasgow, na sigla em inglês) na faixa de 13 a 15². O TCE leve pode ser focal ou difuso e está associado a lesões agudas, como quebra da homeostase celular, excitotoxicidade, depleção de glicose, disfunção mitocondrial, distúrbio do fluxo sanguíneo e dano axonal, bem como lesões subagudas, incluindo dano axonal, neuroinflamação e gliose ^2,3. Apesar do progresso significativo no delineamento da intrincada fisiopatologia do TCE, os mecanismos subjacentes do TCE / rmTBI leve permanecem indescritíveis e requerem mais investigações⁹. Dado que o CHI é o tipo mais comum de TCE¹², este protocolo apresenta uma nova abordagem para criar um modelo de camundongo controlado com mais precisão de rmTBI usando um dispositivo FPI modificado para realizar o impacto em uma janela de crânio afinado¹³. Ao evitar lesões induzidas por craniotomia, espessura variável do crânio e imprecisões induzidas pela forma e lesão de rebote, essa abordagem visa superar as principais desvantagens associadas aos modelos WD, CCI e FPI. A aplicação do impacto do FPI na janela do crânio afinado é conveniente para avaliar o dano dos vasos cerebrais após o rmTBI e ajuda a minimizar as altas taxas de mortalidade em alguns modelos, resultando em uma maior semelhança com as características clínicas dos pacientes com TCE.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvidos neste protocolo foram realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Universidade Normal de Zhejiang, Número da Licença, dw2019005) e em conformidade com o ARRIVE e o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As especificações técnicas podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Procedimento de manipulação dos animais

1. Abrigar ratos em um ambiente controlado com temperatura de 22-24 °C, umidade variando de 40% a 60%, um ciclo claro/escuro de 12 h e fornecer acesso ad libitum à água e ração padrão para ratos. Para o propósito deste experimento, 25 camundongos machos ICR (25-30 g, 8 semanas de idade) foram usados.
2. Aloque aleatoriamente os camundongos no grupo controle (n = 12) ou no grupo rmTBI (n = 13). Para evitar a agressão potencial de camundongos simulados contra camundongos submetidos a rmTBI, separe-os em gaiolas distintas.
3. Dê aos ratos pelo menos 1 semana para se aclimatarem ao ambiente da gaiola antes de iniciar o experimento. Esse período de aclimatação garante que os camundongos se familiarizem com o ambiente e minimiza os impactos potenciais do estresse ou ansiedade nas respostas fisiológicas ou comportamentais durante o estudo.

2. Preparação do dispositivo TBI

1. Fabricar o modelo rmTBI em camundongos usando um dispositivo FPI modificado (ver Tabela de Materiais; Figura 1A) ¹³. Antes de usar o dispositivo FPI, inspecione cuidadosamente todas as conexões quanto a sinais de vazamento ou rachaduras, prestando atenção especial às junções entre o cilindro e a tubulação e entre o conector de três vias e a tubulação. Para determinar as pressões de impacto com precisão, um transdutor de pressão foi instalado até o ponto de impacto no dispositivo de lesão por percussão de fluido¹³.
2. Realize uma inspeção cuidadosa do dispositivo FPI para garantir que o pistão se mova suavemente dentro do cilindro e que os impactos possam ser conduzidos de forma eficaz (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar presentes no sistema. Se forem detectadas bolhas de ar, adicione cuidadosamente água destilada ao sistema usando uma seringa de 50 mL e expulse as bolhas de ar empurrando rapidamente a haste do cilindro através de um conector de 3 vias próximo e/ou através da seringa.
   NOTA: O sistema FPI consiste em água destilada dentro do cilindro e tubulação conectada. É crucial calibrar o dispositivo antes da operação para garantir a precisão e a confiabilidade dos resultados.

3. Preparação de crânio afinado

NOTA: A cirurgia animal e a preparação do crânio afinado não devem ser realizadas em vista de outros camundongos. A janela do crânio afinado é útil para avaliar danos aos vasos cerebrais após um procedimento de FPI.

1. Cumpra os requisitos do centro de animais instruindo o operador experimental a usar um avental estéril e máscara durante todos os procedimentos de manuseio de animais.
2. Higienize a bancada do laboratório, o dispositivo FPI, a tubulação anestésica e o contraespaço adjacente antes de iniciar o experimento usando um spray de etanol a 70%.
3. Pese os camundongos nos grupos simulado e rmTBI antes da cirurgia e compare seus pesos com os registrados 1 semana antes do experimento. Exclua do estudo qualquer camundongo que apresente problemas de saúde, como casaco de pele áspero, diarréia, perda de peso ou letargia. Além disso, exclua camundongos que pesam menos de 20 g para garantir sua capacidade de tolerar impactos repetidos. Essas medidas são cruciais para manter o bem-estar animal e garantir resultados experimentais confiáveis.
4. Anestesiar camundongos com 4%-5% de isoflurano (em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1 L/min) por 3-4 min em uma câmara de indução. Administre um lubrificante oftálmico (consulte a Tabela de Materiais) nos olhos do animal para manter a lubrificação durante toda a cirurgia. Para atenuar a dor, administre buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg) no ponto médio entre as orelhas 20 min antes da anestesia e, posteriormente, a cada 6 h por um período de 24 h. Além disso, no final da anestesia, administrar uma dose subcutânea única de 5 mg/kg de carprofeno a cada animal.
5. Desinfete a cabeça depois que o mouse perder os reflexos de endireitamento e retirada do pedal. Apare o pelo da cabeça do rato usando uma tesoura cirúrgica e use um barbeador para remover o pelo restante. Desinfete o couro cabeludo com três aplicações sequenciais de clorexidina a 2%, intercaladas com esfoliantes com etanol a 75%.
6. Coloque uma almofada cirúrgica estéril descartável sob o animal e a área circundante para garantir a higiene adequada. Faça uma incisão de 1,5 cm usando uma pequena tesoura cirúrgica fina ao longo da linha média do couro cabeludo do camundongo para expor totalmente o local da cirurgia (Figura 2A).
7. Prenda o mouse usando barras de ouvido não terminais em uma estrutura estereotáxica convencional (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a posição da cabeça do mouse em um quadro estereotáxico em um nível plano ou em um ângulo ligeiramente inclinado de acordo com a área de destino específica que será investigada. Limpe o pelo da área cirúrgica para evitar inflamação mais tarde.
8. Mantenha a temperatura corporal do mouse a 37 °C usando uma almofada de aquecimento isotérmica convencional (consulte a Tabela de Materiais).
9. Durante o processo de instalação do hub cirúrgico e de impacto (Luer Lock feminino), mantenha a anestesia do camundongo (sem resposta ao beliscão do dedo do pé ou da cauda) com um cone nasal que forneça uma concentração contínua de isoflurano de 2%, regulada por um vaporizador calibrado.
10. Limpe cuidadosamente a área cirúrgica ao redor da janela do crânio afinado usando um cotonete estéril embebido em solução salina.
11. Crie uma janela de crânio afinado, com aproximadamente 2,5 mm de diâmetro e 20 μm de espessura, no córtex motor frontal direito usando uma microbroca de ponta chata (ver Tabela de Materiais, Figura 2B) e uma lâmina microcirúrgica. Localize o local cirúrgico a 1,5 mm anterior ao bregma e 1,3-2,0 mm lateral à linha média (Figura 2C).
    1. Para evitar que a micro-broca penetre no crânio durante a criação da janela do crânio afinado, umedeça intermitentemente o crânio com solução salina enquanto tritura com a micro-broca.
    2. Confirme a espessura do crânio sondando suavemente o crânio afinado com a ponta achatada de uma agulha de seringa fina e avaliando sua maciez. Estime a clareza dos microvasos corticais expostos visualmente para determinar a espessura do crânio.
    3. Para verificar a espessura do crânio, aplique solução salina estéril na área diluída e inspecione visualmente usando um microscópio de dissecação convencional (consulte a Tabela de Materiais). Essa técnica pode ajudar a garantir que o crânio tenha sido adequadamente afinado.
       NOTA: Lubrifique o olho do rato durante toda a preparação do crânio afinado e o procedimento de modelagem rmTBI para evitar o ressecamento. O afinamento do crânio para menos de 15 μm acarreta o risco de trauma cortical leve, que pode resultar em inflamação cortical leve¹⁴.
12. Anexe uma Luer Lock fêmea ajustada (diâmetro interno de 2.2 mm, criada a partir de um cubo de agulha 19G, conforme mostrado na Figura 2D) ao local do crânio afinado. Prenda o Luer Lock com cola e cimento dentário (Figura 2E).
    NOTA: Ao usar cola para prender a trava Luer fêmea na área ao redor da janela do crânio afinado, é crucial secar completamente a área do crânio e evitar que o adesivo entre na própria janela. O adesivo dentro da janela pode reduzir significativamente a força de impacto do FPI.

4. Procedimento de modelagem rmTBI associado ao CHI

1. Introduzir rmTBI usando o método de percussão de fluido lateral com um dispositivo FPI modificado, conforme descrito anteriormente^13,15.
2. Depois de concluir os procedimentos da janela do crânio afinado e do cubo de impacto, transfira o mouse do aparelho estereotáxico para a plataforma do impactor.
3. Diante dos potenciais efeitos da anestesia sobre o tempo de reflexão de endireitamento do animal e a gravidade da lesão após percussão ^9,16, monitore a profundidade da anestesia avaliando os reflexos palpebral e de retirada da pata (Figura 2F).
4. Conecte o Luer Lock fêmea, que foi colado na janela do crânio afinado, ao Luer Lock macho na extremidade da tubulação do dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: Na modelagem rmTBI, a anestesia induzida por isoflurano em camundongos foi prolongada devido à indução de apneia e inconsciência por percussão.
5. Introduza dois TCE leve (intervalo de 48 h) com o dispositivo modificado. Aplique o primeiro impacto FPI imediatamente após concluir a cirurgia da janela do crânio afinado e instalar o Luer Lock. Administre o impacto do FPI apenas quando o camundongo mostrar o retorno de um reflexo de retirada a um beliscão da pata em cada ocasião (Figura 2H). A aplicação de um impacto FPI em camundongos profundamente anestesiados pode causar apneia prolongada e morte.
   1. Para aplicar o impacto FPI, levante o pêndulo até o grau designado ao longo do transferidor no dispositivo e solte o pêndulo usando o controle de software^13,15. O impacto deve atingir uma intensidade de percussão de 2,0 ± 0,1 atm, seguindo protocolos estabelecidos e utilizados em estudos com roedores 10,17,18. Exclua os animais de testes adicionais se o impacto não for registrado entre 1,9-2,1 atm ou se a fratura do crânio ocorreu durante o FPI.
   2. Para os ratos falsos, fixe-os no aparelho, mas não cause o impacto.
6. Após o impacto, desconecte imediatamente a conexão Luer Lock e transfira os mouses para uma almofada de aquecimento isotérmica para recuperação. Depois que o camundongo recuperar o estado de alerta e a consciência, devolva-o à sua gaiola de origem sem remover a trava Luer fêmea. Administre o segundo impacto FPI, da mesma maneira, 48 h depois.
7. Após o rmTBI, remova cuidadosamente a trava Luer fêmea e o cimento dentário. Suturar o couro cabeludo usando adesivo tecidual e usar uma pinça plana para beliscar o couro cabeludo para facilitar o processo adesivo (ver Tabela de Materiais; Figura 2I).
8. Para prevenir inflamação, infecção e aliviar a dor e o desconforto pós-cirúrgicos, aplique uma mistura de eritromicina e pomada de diclofenaco sódico na proporção de 1:1 (consulte a Tabela de Materiais) na ferida. Transfira os ratos para uma almofada de aquecimento isotérmica para recuperação.
9. Registre a duração do reflexo de endireitamento, que começa quando o mouse é removido do aparelho estereotáxico e colocado lateralmente na plataforma do impactor para FPI e continua até que o mouse possa ficar em pé independentemente.
10. Depois que o camundongo recuperar o estado de alerta e a consciência, devolva-o à sua gaiola de origem. Os camundongos geralmente estão totalmente conscientes e são capazes de andar dentro de 1,5 h após a lesão.
11. Nos dias seguintes à modelagem do TCE, observe os camundongos em busca de vários sinais, incluindo padrões respiratórios, presença de muco ao redor do nariz e da boca e vermelhidão, inchaço, exsudatos ou reabertura da área da ferida. Excluir animais do estudo com um ou mais dos sintomas anormais acima referidos.
    NOTA: A pré-microinjeção de AAV-GCaMP6s permite a observação da homeostase neuronal subjacente de Ca2+ e excitabilidade no córtex lesionado através da janela do crânio afinado usando microscopia de varredura a laser de dois fótons¹⁵.

5. Teste do labirinto aquático de Morris (MWM)

NOTA: O MWM (ver Tabela de Materiais) é um método amplamente reconhecido para avaliar o aprendizado espacial e os déficits de memória em camundongos após TCE.

1. Realize o teste MWM a partir de 7 dias após a lesão (DPI). A piscina circular do MWM tinha um diâmetro de 120 cm e uma altura de 50 cm, com a temperatura da água mantida em 25 °C. Separe a piscina circular em quatro quadrantes, com a plataforma de fuga, uma plataforma redonda com diâmetro de 6 cm e altura de 30 cm, submersa 1 cm abaixo da superfície da água no quadrante nordeste.
2. Posicione uma câmera diretamente acima da piscina circular para registrar a trajetória de movimento dos ratos. Marque os mouses com fita preta nas costas para facilitar o reconhecimento pelo software de aquisição de imagem e para gravação de dados, incluindo latência, distância de natação e trajetória de movimento.
3. Coloque os ratos na água, de frente para a parede interna de cada um dos quatro quadrantes, uma vez para cada quadrante. Assim que os ratos encontrarem a plataforma, deixe-os descansar lá por 10 s. Se um mouse não conseguir encontrar a plataforma dentro de 60 s, peça ao operador para guiar o mouse até a plataforma, deixe-o descansar na plataforma por 10 s e, em seguida, devolva o mouse à sua gaiola inicial para descansar.
4. Repita para cada camundongo o teste de aquisição 4x ao dia. Após os testes de aquisição, em 12 DPI, conduza um experimento de sonda espacial de 60 s e registre o número de vezes que os camundongos cruzaram a área da plataforma original e a duração da permanência do camundongo no quadrante onde a plataforma estava localizada.
5. Após cada tentativa, seque rapidamente os camundongos com uma toalha ou coloque sob uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal e evitar a hipotermia durante a tentativa de aquisição de 60 s de DPI 7 a DPI 11.
6. Após a conclusão dos procedimentos experimentais descritos acima, anestesiar os camundongos com pentobarbital (45 mg / kg, i.p.) a 13 DPI. Perfundir solução salina isotônica por via transcárdica, seguida de perfusão com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2). Recupere os cérebros para coloração HE convencional para avaliar alterações macroscópicas da morfologia cortical e do hipocampo. Uma descrição detalhada do protocolo de coloração HE pode ser encontrada em publicações anteriores^13,15.
7. Após a conclusão de todos os experimentos, eutanasiar camundongo por injeção de overdose de pentobarbital (≥100 mg / kg, ip) se não houver amostras de camundongo necessárias. Antes de colher tecidos ou descartar a carcaça, monitore o camundongo até que não haja batimentos cardíacos por pelo menos 60 s.

Resultados

O protocolo descrito neste estudo descreve um método para induzir rmTBI através de uma janela de crânio afinada, que oferece uma solução para a lesão cerebral causada pela preparação da craniotomia durante a modelagem convencional de TCE de percussão. Ao utilizar este procedimento de percussão de fluido modificado com o dispositivo modificado, foi alcançada maior precisão e reprodutibilidade do impacto do FPI¹³. O impactor modificado tem a versatilidade de ser usado para modelagem CHI e FPI, com ou sem craniotomia craniana. Além disso, a gravidade da lesão é modulada pelo ajuste dos parâmetros da lesão, como o ângulo de queda do pêndulo de impacto, ou pela adição de almofadas de espuma de etileno-acetato de vinila de célula fechada adicionais de dureza variável à placa final do poste do pistão.

O modelo rmTBI modificado oferece vantagens significativas, como a produção de patologia focal e difusa sem expor a cortical dural, o que minimiza a inflamação da exposição meníngea e/ou FPI direto no parênquima. Além disso, este modelo reduz as variações na espessura e forma do osso do crânio para produzir resultados confiáveis de lesões. Portanto, o modelo rmTBI modificado é eficaz e confiável na simulação de déficits neuropatológicos e comportamentais relacionados a sintomas pós-concussivos (PCS) clinicamente relevantes em diferentes graus de lesão. Particularmente, este modelo é útil para investigar mecanismos patológicos de TCE que dependem da precisão e reprodutibilidade dos modelos de TCE em animais, especialmente para investigar mecanismos relacionados ao TCE leve.

O ramo lateral frontal da artéria cerebral média do camundongo e a veia rinal caudal¹⁹, situada abaixo do crânio afinado, permitiram uma visualização clara sob a câmera. Após duas percussões rmTBI, cada uma a uma pressão de aproximadamente 2,0 atm, todos os camundongos exibiram hematomas subdurais a 0 DPI. Embora a integridade do crânio afinado não parecesse estar comprometida; no entanto, uma redução no número de microvasos foi observada juntamente com mudanças na morfologia da microvasculatura (Figura 2H), conforme relatado anteriormente¹⁵. Em 2 DPI, os hematomas desapareceram em grande parte. A mortalidade resulta principalmente do impacto enquanto o camundongo está sob anestesia profunda, o que pode prolongar significativamente a apneia. A avaliação regular da profundidade da anestesia antes do impacto através dos reflexos palpebral e de retirada da pata pode reduzir substancialmente a mortalidade. Fatores adicionais que podem afetar as taxas de mortalidade após a percussão de fluidos incluem tensão do camundongo, dureza do crânio, sexo e idade. Em um estudo anterior usando o mesmo protocolo rmTBI, um camundongo C57BL / 6J morreu¹⁵. Neste protocolo, apenas camundongos ICR machos foram utilizados para introduzir todos os procedimentos.

Estudos em humanos e animais mostraram que mesmo impactos subconcussivos repetitivos na cabeça podem causar lesões microestruturais generalizadas na substância branca 20,21,22, que estão associadas a um pior desempenho cognitivo^21,22. Em 7-12 DPI, o rmTBI pode produzir deficiências no aprendizado espacial e na memória, que foram examinadas usando o paradigma MWM. A Figura 4 ilustra os resultados obtidos nessa avaliação.

A análise do último ensaio de aquisição no MWM demonstrou um aumento significativo (p< 0,05) na latência dos camundongos rmTBI para atingir a plataforma submersa, em comparação com o grupo controle. No estudo da sonda, a análise da porcentagem de tempo gasto no quadrante da plataforma original demonstrou uma redução significativa (p<0,01) no grupo rmTBI em relação ao grupo controle, indicando um declínio no aprendizado de referência espacial e nas capacidades de memória em camundongos com rmTBI.

O método descrito aqui foi utilizado em uma publicação anterior¹⁵ usando os camundongos C57BL / 6J. Além do MWM, três análises adicionais foram conduzidas conforme descrito abaixo.

O OFT foi utilizado para avaliar as capacidades de locomoção e exploração, medindo a velocidade média de deslocamento, a distância total percorrida e a porcentagem de distância percorrida nas zonas centrais. Realize um teste de campo aberto (OFT) a 6 DPI para avaliar locomoção, exploração e ansiedade em camundongos. O dispositivo de teste medindo 40 x 40 x 40 cm, que foi dividido em 16 zonas (cada uma medindo 18 x 18 cm). O mouse foi colocado no centro do dispositivo e autorizado a explorar livremente por 5 min. Foi feito o registro da distância percorrida nas 4 zonas centrais, a distância total percorrida, a velocidade média de movimento e o tempo gasto nas zonas de fronteira. Os níveis de ansiedade foram avaliados com base na porcentagem de distância percorrida nas zonas centrais e no tempo gasto pelos roedores nas zonas limítrofes durante um período de observação de 5 min. A 6 DPI, o rmTBI pode não ter um impacto significativo nas habilidades locomotoras gerais dos camundongos, pode induzir ansiedade significativa e alterar o comportamento exploratório, conforme mostrado na Figura 4¹⁵. Além disso, o modelo rmTBI modificado induz lesões axonais difusas, que podem ser avaliadas por meio de testes comportamentais adicionais, como o teste de capacidade cognitiva descrito neste protocolo.

Foi demonstrado que o RmTBI prejudica o trabalho espacial e a memória de referência em camundongos, conforme ilustrado na Figura 5¹⁵. Essas funções cognitivas foram avaliadas usando o teste do labirinto em Y. O teste foi realizado a 8 DPI para medir déficits de memória de trabalho de curto prazo em camundongos. Para o comportamento de alternância espontânea: foi utilizado um dispositivo de labirinto em Y de acrílico (20 cm de altura, 50 cm de comprimento e 10 cm de largura na parte inferior). Depois de colocar o mouse no centro do dispositivo e permitir que ele explorasse por 8 min, as entradas de braço foram gravadas. O comportamento de alternância espontânea é definido como a entrada sucessiva do camundongo nos três braços em conjuntos de trigêmeos. Calcule a taxa de alternância espontânea (%) como (séries trigêmeas sucessivas / número total de entradas de braço menos 2) x 100. Para memória de referência espacial, durante o treinamento de 8 minutos, feche aleatoriamente um braço do dispositivo Y-maze. Após 1 h após a exposição inicial, o rato é reintroduzido no labirinto com os três braços abertos e permite que ele explore livremente por 3 min. O tempo gasto explorando o novo braço versus os outros dois braços é registrado. Calcule o índice de preferência como o tempo gasto no novo braço versus o tempo gasto nos três braços.

Além disso, sugerimos avaliar lesões estruturais macroscópicas no cérebro usando coloração HE simples (Figura 6)¹⁵ ao completar todos os testes comportamentais. Use a região cortical cortical seccionada coronalmente de 1 mm anterior ao local da lesão até a margem posterior da lesão, e a região hipocampal cortejada coronalmente na zona típica em forma de crescente (Bregma: -1,7 a -2,2 mm). A contagem de neurônios em cada lâmina de seis campos aleatórios usando uma grade ocular (ampliação de 400x) e a média do número neuronal forneceram a densidade numérica por campo visual (densidade numérica). Descobriu-se que as regiões cerebrais afetadas pelo rmTBI exibem graus variados de lesões neuronais¹⁵. Especificamente, o córtex motor demonstrou uma extensão mais potente e variada de tais lesões do que o hipocampo. A coloração HE mostrou uma mudança considerável em direção à morfologia picnótica de neurônios normais (Figura 6A, B, E, F). Além disso, observou-se que a matriz extracelular se soltou especificamente na região da lesão (Figura 6F). Além das áreas de matrizes afrouxadas observadas, os camundongos rmTBI também mostraram um aumento significativo na coloração hipercrômica, vista como uma cor vermelha mais escura, em um número significativo de neurônios subgranulares no giro dentado e em alguns neurônios corticais e CA1. Curiosamente, esses padrões de coloração não apresentaram nenhum sinal de encolhimento citoplasmático ou núcleo picnótico (Figura 6C, D, G, H, K) ¹⁵. Os métodos de coloração comportamental (exceto para o teste WMM) e HE mencionados acima foram detalhados em uma publicação recente, que introduziu o modelo rmTBI modificado¹⁵.

Figura 1: O dispositivo FPI modificado e a captura de tela do software. (A) O dispositivo FPI modificado. (B) A captura de tela exibe a forma de onda de pressão FPI e a medição e exportação automáticas de parâmetros de pressão de impacto em tempo real, como tempo de subida, tempo de queda e duração da meia largura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O modelo de camundongo modificado de rmTBI em camundongos ICR. (A) Uma incisão na linha média é feita para expor a área cirúrgica. (B) Uma janela de crânio afinado foi fabricada no córtex motor. A clareza dos microvasos corticais expostos é usada para determinar a espessura do crânio. (C) A espessura do crânio também pode ser verificada sondando suavemente o crânio afinado com a ponta achatada de uma agulha de seringa fina e avaliando sua maciez. (D) A Luer Lock feminina estava colada à janela do crânio afinado. (E) O Luer Lock fêmea anexado foi fixado aplicando o cimento dentário. (F) A profundidade da anestesia foi monitorada pela verificação dos reflexos palpebral e de retirada da pata. (G) O impacto do FPI foi entregue após o retorno de um reflexo de retirada a um beliscão da pata. (H) Imagem pós-rmTBI da janela do crânio afinado a 0 DPI. (I) O couro cabeludo foi suturado com adesivo tecidual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os efeitos do rmTBI no aprendizado de referência espacial e na memória em camundongos ICR. (A) O traço de navegação para camundongos durante o último teste de aquisição registrado em 11 DPI, (B) a rota da sonda espacial no teste de sonda registrada em 12 DPI e (C) o tempo de fuga que os camundongos levaram para localizar a plataforma durante o último teste de aquisição. Os resultados revelaram que o grupo rmTBI demorou significativamente mais tempo para chegar à plataforma oculta do que o grupo controle (p<0,05). (D) A porcentagem de tempo que os camundongos passaram no quadrante da plataforma original em relação ao tempo total de navegação durante o teste de sonda foi significativamente menor no grupo rmTBI do que no grupo controle (p<0,01). n = 8. * p<0,05, ** p < 0,01 vs. controle por teste t não pareado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os efeitos do rmTBI na locomoção, exploração e ansiedade em camundongos C57BL / 6J. (A) Traços representativos do movimento de camundongos controle e rmTBI durante 5 min OFT. (BE) Os dados resumidos mostram a distância percorrida nas zonas centrais, a distância total percorrida, a velocidade média de viagem e o tempo gasto nas zonas periféricas, respectivamente. Controle, n=13; rmTBI, n = 12. pág<. 01 vs. controle pelo teste t não pareado. Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Os efeitos do rmTBI no trabalho espacial e na memória de referência em camundongos C57BL / 6J. (A, B) Traços representativos do movimento de camundongos controle e rmTBI durante o trabalho espacial e avaliações de memória de referência no labirinto Y. O teste de alternância espontânea do labirinto em Y é um método comumente usado para avaliar a memória de curto prazo em modelos de roedores¹⁵. (C) Resumo das taxas de alternância espontânea de camundongos controle e rmTBI durante a avaliação do trabalho espacial. Os roedores geralmente preferem explorar um novo braço do labirinto em vez de revisitar um que já exploraram. Um índice de preferência é calculado com base no tempo que os roedores passam no novo braço em comparação com o tempo gasto nos três braços, e esse índice é então analisado. (D) Resumo do índice de preferência de camundongos controle e rmTBI durante a avaliação espacial do trabalho. Controle, n=13; rmTBI, n=12. pág<. 01 vs. controle pelo teste t não pareado. Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Comparação da coloração HE do córtex motor lesionado ipsilateral e da sub-região do giro dentado do hipocampo entre controle e rmTBI em camundongos C57BL / 6J. (A, B) Córtex motor normal; e (C, D) a região hipocampal de camundongos controle em diferentes ampliações. (E, F) Córtex motor lesionado e regiões hipocampais (G, H) de camundongos rmTBI. Os neurônios hipercrômicos no córtex e CA1 podem ter sido ligeiramente afetados pela preparação da cirurgia ou rmTBI sustentado; no entanto, neurônios hipocrômicos (possivelmente lesionados intermediários) e picnóticos (neurônios apoptóticos) foram observados no córtex motor de camundongos rmTBI quando comparados aos neurônios normais nos camundongos controle. Essas características da apoptose neuronal incluíram encolhimento citoplasmático neuronal e do núcleo, acompanhado de aparente vacuolização. Notavelmente, a linha branca de demarcação em (E) representa o limite entre o tecido lesionado e o tecido circundante. Além disso, os neurônios hipercrômicos na sub-região DG (H) possivelmente se referiam a neurônios granulares imaturos e maduros recém-gerados. Os gráficos de barras abaixo mostram a distribuição de neurônios normais e afetados por rmTBI nas sub-regiões (I) do córtex motor e (J) CA1 e (K) DG do hipocampo. Controle, n=13; rmTBI, n = 12, *** p<. 001 vs. controle pelo teste t não pareado. Este número foi modificado de¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O TCE refere-se a dois tipos primários, fechado e penetrante, sendo o último caracterizado por uma ruptura do crânio e da dura-máter. Dados clínicos sugerem que as CHIs são mais prevalentes do que as lesões penetrantes ^1,2. Após um único TCE leve, a maioria dos pacientes apresenta sintomas de SCP que geralmente se resolvem em um curto período de tempo, e há controvérsia quanto à proporção de pacientes cujos PCS evoluem para sequelas de longo prazo^23,24. Consequentemente, os pesquisadores mudaram seu foco para modelos repetitivos de CHI para entender melhor os efeitos cumulativos de múltiplas concussões²⁵, que comumente ocorrem em quedas, acidentes de trânsito e esportes de contato. Esses impactos repetidos podem levar a efeitos mais graves e de longo prazo^26,27. Ao usar modelos CHI repetitivos, os pesquisadores podem explorar os potenciais efeitos aditivos ou sinérgicos de múltiplas concussões e obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes que contribuem para o PCS. Tais modelos podem facilitar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas direcionadas para mitigar as consequências a longo prazo de impactos repetidos na cabeça.

Embora alguns modelos de CHI tentem simular tanto o single focal quanto o rmTBI incorporando forças lineares e rotacionais, esses modelos podem resultar em lesão de rebote e imprecisões na gravidade da lesão devido a fatores como fratura do crânio, morfologia e espessura do crânio, apneia animal estendida¹⁰ e variabilidade nos parâmetros de entrada mecânica, particularmente quando o movimento rotacional da cabeça é incorporado⁹. Métodos de impacto e queda de peso controlados por pistão são comumente usados para induzir rmTBI em modelos animais de CHI²⁵. O impacto controlado por pistão permite o ajuste preciso e ajustável dos parâmetros de impacto através do uso de dispositivos de impacto acionados eletromagnéticos ou pneumáticos, permitindo assim alta reprodutibilidade de impacto. No entanto, o uso de impacto controlado por pistão, seja no córtex exposto como no CCI ou no crânio fechado, ainda requer imobilização rigorosa da cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica durante o impacto. Por outro lado, os métodos de queda de peso requerem materiais simples e econômicos que são fáceis de configurar, mas a compensação é uma variabilidade um tanto alta na gravidade da lesão²⁵.

O modelo FPI normalmente induz lesões focais e difusas mistas, permitindo a fabricação de TCE de gravidade variável. Apesar de suas vantagens, o modelo FPI também tem limitações potenciais. Assim como o modelo CCI, o FPI ainda requer craniotomia, um procedimento cirúrgico que pode induzir inflamação no tecido cerebral¹⁷. Além disso, mesmo o FPI leve freqüentemente penetra na dura-máter em profundidades variadas, o que pode introduzir confusão na interpretação dos dados. Assim, os modelos CCI e FPI têm limitações em replicar as características clínicas observadas em pacientes com TCE leve⁹. Portanto, apresentamos um protocolo que combina a janela de crânio afinado e os métodos FPI, que podem ser utilizados para produzir um modelo de camundongo mais preciso de rmTBI associado a CHI. O objetivo deste protocolo é espelhar de perto as características clínicas de pacientes com TCE leve. Um modelo altamente reprodutível seria uma ferramenta inestimável para investigar os mecanismos subjacentes à fisiopatologia do TCE leve e avaliar possíveis intervenções terapêuticas.

Os resultados de nossa pesquisa sobre rmTBI se alinham com publicações anteriores que utilizaram janelas de crânio afinado para investigações leves de TCE^28,29. Por exemplo, Ren et al. criaram uma janela de crânio afinado com espessura de aproximadamente 30 μm no córtex de associação parietal esquerdo, induzindo TCE leve pressionando suavemente a janela usando uma extremidade romba com diâmetro de 1 mm de um instrumento estereotáxico cirúrgico²⁹. Seu estudo mostrou uma notável expansão da morte celular e expressão de espécies oxidativas reativas (ROS) no córtex lesionado²⁹. Para investigar rmTBI, Nguyen et al. aplicaram três CCIs com uma ponta de impactor modificada (ponta de silicone redonda de 3 mm de diâmetro de 1,5 mm de espessura) em uma janela de crânio afinado de camundongo (20-40 μm de espessura) no córtex de associação parietal²⁸. Para proteger e manter a transparência da área do crânio afinado para imagens de longo prazo, eles cobriram a janela do crânio afinado com uma fina camada de cola de cianoacrilato. Os três CCIs foram realizados uma vez por semana durante 3 semanas, com parâmetros de impacto de 4 m/s de velocidade e 2 mm de profundidade. Como resultado dos três CCIs, os camundongos mostraram astrogliose evidente e ativação microglial²⁸. Dado que o uso da janela de crânio afinado como modelo para TCE/rmTBI leve é relativamente recente, mais pesquisas são necessárias para examinar a relação entre a gravidade/progressão da lesão e diferentes técnicas de impacto. Por exemplo, em um estudo anterior, pudemos observar mudanças óbvias na morfologia celular após dois FPIs que foram administrados com um intervalo de 2 dias¹⁵. Enquanto isso, em outros estudos, uma única compressão suave na janela do crânio afinado induziu TCE leve com morte celular evidente e expressão de espécies oxidativas^{reativas 29}, e três CCIs semanais resultaram em astrogliose robusta e ativação microglial²⁸.

Várias etapas devem ser seguidas com cautela para fabricar um modelo de lesão consistente usando o método descrito. Durante a operação da janela do crânio afinado, com base em diferentes áreas-alvo (por exemplo, focamos no córtex motor), a cabeça do camundongo deve ser fixada em um quadro estereotáxico no nível horizontal ou em um ligeiro ângulo lateral em direção ao lado oposto da janela do crânio afinado neste protocolo. Esse posicionamento específico pode facilitar a criação da janela do crânio afinado na área correspondente ao córtex motor. Colocar com precisão as barras auriculares é um dos aspectos mais desafiadores desse procedimento e pode levar tempo e prática para dominar. Antes de tentar a operação de janela de crânio afinado ou induzir CHI, é essencial garantir que o crânio esteja nivelado. Se o crânio não estiver posicionado corretamente, a cabeça deve ser ajustada de acordo. Devido à forma e espessura irregulares do osso do crânio, o crescimento do crânio é variável mesmo dentro de um osso específico³⁰, é fundamental ajustar o posicionamento da cabeça antes de realizar o procedimento de janela do crânio afinado ou CHI. Não fazer isso aumenta o risco de fraturas cranianas, o que pode afetar significativamente a precisão e a confiabilidade do CHI. Para orientações mais abrangentes sobre o procedimento de janela de crânio afinado, consulte o protocolo descrito por Guang et ^al.14.

A escolha da área de modelagem do TCE varia entre os pesquisadores com base em seu foco de pesquisa. Dada a variabilidade significativa na localização real da lesão no CHI, apesar da maioria dos estudos relatarem que o local do impacto está localizado centralmente entre bregma e lambda, recomenda-se variar o local do impacto em estudos experimentais futuros, conforme observado em uma revisão de modelos animais de CHI²⁵. Para validar o modelo modificado de lesão craniana afinada do CHI, recomendamos começar com o córtex motor, conforme descrito neste protocolo. O rmTBI pode causar lesões focais do córtex motor, que podem ser facilmente avaliadas usando abordagens de avaliação locomotora, como o OFT neste protocolo. A incisão feita durante este procedimento requer tempo para cicatrizar, e isso pode potencialmente desencadear uma resposta imune periférica, introduzindo variabilidade no experimento. Para minimizar o risco de inflamação, infecção e dor e desconforto pós-cirúrgico, recomendamos a aplicação de uma pomada tópica contendo uma combinação de eritromicina e diclofenaco de sódio na ferida. Essa abordagem demonstrou ser eficaz na redução da inflamação e da dor associadas a procedimentos cirúrgicos em animais.

O protocolo de percussão de fluido baseado em crânio afinado é um método promissor para modelar rmTBI em roedores, pois reduz a inflamação comumente causada pela exposição das meninges ao FPI. Essa técnica, apresentada na janela de crânio afinado, pode efetivamente gerar PCS clinicamente relevante em vários graus, fornecendo uma alternativa potencial para pesquisadores que estudam rmTBI. Além disso, a janela do crânio afinado facilita a observação da homeostase do Ca²⁺ e da hiperexcitabilidade neuronal no córtex in vivo¹⁵. O uso dessa técnica pode melhorar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à progressão da PCS a curto/moderado/longo prazo, aumentando assim a capacidade de prever seu desenvolvimento e desenvolver tratamentos terapêuticos mais eficazes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
75% de etanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.
cloridrato de buprenorfina	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	Solução H12020272	, Carprofeno analgésico
	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Pó,
Digluconato de clorexidina	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	solução aquosa de 19%-21%, cimento dental antimicrobiano
e kit de solvente	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3 #	Pó reconstituído em solvente correspondente
Microscópio de dissecação	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Pomada de eritromicina	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	220412
Fonte luminosa fria da fibra ótica	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm, software de dispositivo
FPI	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Impactador de Cérebro Animal Biocom V1.0
Camundongos ICR	Jinhua Centro de Animais de Laboratório	Estoque#2023091	25 camundongos machos, 25-30g, 8 semanas de idade
Isoflurano	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Almofada de aquecimento isotérmica	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Feito sob medida usando um cubo de agulha 19G
Micro broca de crânio portátil	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38.000 rpm
Dispositivo FPI modificado	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Labirinto aquático Morris	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Avalie as habilidades de aprendizagem espacial e memória do mouse
Campo aberto	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Avaliar a locomoção e a ansiedade do rato
Lubrificante oftálmico	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Pomada de diclofenaco sódico	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	221207	anti-inflamatório não esteróide
Sistema de anestesia para pequenos animais - Aprimorado	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Sistema inteligente de rastreamento de vídeo	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Rastreamento e análise de animais
Quadro estereotáxico	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Adesivo de Tecido Vetbond	3M, St Paul, MN, EUA	202402AX	Sutura a ferida animal
Labirinto Y	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Avalie a memória de trabalho espacial do mouse