Descrevemos um protocolo para extrair núcleos de alta qualidade de tipos de células estromais/endoteliais e sanguíneas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por criopreservas, para apoiar análises de sequenciamento de próxima geração de núcleo único. A produção de núcleos intactos e de alta qualidade é imperativa para experimentos multiômicos, mas pode ser uma barreira à entrada no campo para alguns laboratórios.
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Artigo de método
Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Modelos baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são excelentes plataformas para entender o desenvolvimento do sangue, e as células sanguíneas derivadas de iPSC têm utilidade translacional como reagentes de testes clínicos e terapias de células transfusíveis. O advento e a expansão da análise multiômica, incluindo, entre outros, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq) e o sequenciamento de cromatina acessível por transposase (snATACseq), oferece o potencial de revolucionar nossa compreensão do desenvolvimento celular. Isso inclui biologia do desenvolvimento usando modelos hematopoiéticos in vitro . No entanto, pode ser tecnicamente desafiador isolar núcleos intactos de células cultivadas ou primárias. Diferentes tipos de células geralmente requerem preparações nucleares personalizadas, dependendo da rigidez e do conteúdo celular. Essas dificuldades técnicas podem limitar a qualidade dos dados e atuar como uma barreira para os investigadores interessados em realizar estudos multiômicos. A criopreservação de amostras é frequentemente necessária devido a limitações na coleta e/ou processamento de células, e amostras congeladas podem apresentar desafios técnicos adicionais para o isolamento nuclear intacto. Neste manuscrito, fornecemos um método detalhado para isolar núcleos de alta qualidade de células derivadas de iPSC em diferentes estágios de desenvolvimento hematopoiético in vitro para uso em fluxos de trabalho multiômicos de núcleo único. Focamos o desenvolvimento do método no isolamento de núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à identidade estrutural e celular. As etapas de solução de problemas descritas limitaram a aglomeração e os detritos nucleares, permitindo a recuperação de núcleos em quantidade e qualidade suficientes para análises a jusante. Métodos semelhantes podem ser adaptados para isolar núcleos de outros tipos de células criopreservadas.
Introdução
A hematopoiese é um sistema de desenvolvimento relativamente bem caracterizado, mas a incapacidade de recapitular a formação de células sanguíneas in vitro demonstra uma compreensão incompleta dos fatores relacionados. Modelos de hematopoiese baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ajudar a elucidar os principais fatores de desenvolvimento e a biologia relacionada. O sistema iPSC também oferece um excelente modelo para estudar distúrbios sanguíneos, e células sanguíneas baseadas em iPSC foram desenvolvidas para produzir reagentes traducionais e terapeuticamente relevantes 1,2,3,4.
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Protocolo
1. Criopreservação de células
- Congele >1 x 106 células derivadas de iPSC isoladas por mL em 1 mL de 90% de FBS e 10% de DMSO. Coloque os criogenianos em um recipiente de congelamento a -80 ° C para reduzir a velocidade de congelamento e otimizar a recuperação de células viáveis (Tabela de Materiais). Antecipe uma perda celular considerável, que pode variar de acordo com as condições de cultura e a identidade celular.
- Passar de -80 °C para armazenamento de nitrogênio líquido em 24 h.
2. Descongelamento de células
- Recupere o criovial do armazenam....
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Resultados
Empregamos o protocolo acima mencionado para extrair núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC criopreservadas e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes (flutuantes). Uma representação esquemática detalhada do procedimento de isolamento nuclear pode ser encontrada na Figura 1.
Para o exame morfológico, os núcleos isolados foram corados com azul de tripano e visualizados ao microscópio. O exame morfológico nuclear é crítico ime.......
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Discussão
Etapas críticas dentro do protocolo
Isolar núcleos de alta qualidade é essencial para a implementação bem-sucedida das atuais modalidades de sequenciamento de próxima geração baseadas em núcleo único, que estão evoluindo rapidamente. Em reconhecimento às barreiras existentes para laboratórios interessados nessas abordagens, particularmente para espécimes criopreservados, nossa intenção era criar uma técnica de isolamento nuclear adaptada para células previamente congeladas. O isolamento de núcleos de .......
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Jason Hatakeyama (10x Genomics) e Diana Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) por orientação e sugestões. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (HL156052 ao CST).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes de cultura de células dimetilsulfóxido > | |||
| (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| fortes | |||
| tronco pluripotentes induzidas | N/A | N/A As | iPSCs usadas neste estudo foram obtidas através do CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents Solução | |||
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| strong>Reagentes de Remoção de Células Mortas | |||
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Kit de Remoção de Células Mortas (Anexina V) | StemCell Technologies | 17899 | Este kit foi projetado para o esgotamento de tipos de células indesejadas marcadas com biotina. O kit inclui coquetel de remoção de células mortas (anexina V), coquetel de seleção de biotina e contas de dextrano. Este kit tem como alvo a fosfatidilserina no folheto externo da membrana celular das células apoptóticas usando a Anexina V. As células indesejadas são marcadas com Anexina V, anticorpos biotinilados e partículas magnéticas e separadas sem colunas usando um ímã EasySep. As células desejadas são simplesmente despejadas em um novo tubo. |
| Materiais | |||
| 10 µ l Micropipeta | Wards ciência | 470231606 | |
| 100 µ l Micropipeta | Wards science | 470231598 | |
| 1000 µ l Ponta Universal Estendida | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 µ l Micropipeta | Wards science | 470231602 | |
| frascos criogênicos de 2,0 ml | Corning | 431386 | |
| 20 µ l Micropipeta | Wards ciência | 470231608 | |
| 200 µ l Micropipeta | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Tubo de fundo redondo de poliestireno | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µ l Estação de Ponta de Pipeta | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l Estação de Ponteira de Pipeta | Corning | 4144 | |
| Câmara de Contagem | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Recipiente de Congelamento | Nalgene | 51000001 | |
| Reagentes de Isolamento de Núcleos | Os reagentes de isolamento de núcleos incluem Tampão de Lise, Tampão de lavagem e tampão de núcleos diluídos e tampão de diluição de lise. A constituição desses buffers está na Tabela 1, 2 e 3. Nosso método de isolamento de núcleos melhorou o isolamento dos protocolos do kit padrão (por exemplo, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Guia do Usuário de Expressão Gênica [CG000338]). Este protocolo pode ser usado com vários kits comerciais, incluindo o Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Kit de Remoção de Células Mortas | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| Solução DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS solução de estoque de albumina de soro bovino (BSA) | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Solução de cloreto de magnésio, 1 | M Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substituto | Sigma | 74385 | |
| Livre de nuclease Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Tampão de Núcleos (20X) | 10X Genômica | 2000153 | |
| Protetor Inibidor de RNase | Sigma | 3335399001 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Solução de cloreto de sódio, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4 | Sigma | Trizma T2194 | |
| (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Outros equipamentos | |||
| Contador de células automatizado | Microscópio | 699910591 | |
| CytoSMART Zeiss | Primostar 3 |
Referências
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.....
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Reimpressões e permissões
