Um registro simultâneo da atividade autonômica e do comportamento materno detalhado de camundongos mães desde a gravidez até a lactação foi obtido usando um sistema de telemetria. Esse método ajuda a compreender a dinâmica das características fisiológicas e comportamentais das mães desde a gestação até o desmame.
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Artigo de método
Análise de Eletrocardiogramas e Comportamento em Camundongos da Gravidez ao Período de Lactação
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mudanças na relação mãe-filho são presumivelmente acompanhadas por mudanças dinâmicas no sistema nervoso autônomo. Embora medições temporais da atividade autonômica tenham sido realizadas em mães e bebês humanos, a análise das mudanças de longo prazo permanece inexplorada. As mães de camundongos podem formar laços sociais com seus filhotes e ter um curto período de gravidez e lactação, o que as torna úteis para o exame de mudanças fisiológicas desde a gravidez até a criação dos filhotes. Portanto, um sistema de telemetria foi usado por várias semanas para medir as mudanças no sistema nervoso autônomo e o comportamento das mães de camundongos. Os resultados atuais mostraram que um eletrocardiograma (ECG) pode ser registrado de forma estável, independentemente dos movimentos das mães e do parto. A análise do ECG mostrou que a frequência cardíaca diminuiu gradualmente da gravidez para a lactação, e a atividade simpática aumentou drasticamente à medida que os filhotes se desenvolviam. Além disso, o registro simultâneo do comportamento e do ECG na gaiola domiciliar nos permitiu entender as influências dependentes do comportamento no ECG, revelando assim as características da atividade nervosa autônoma durante cada comportamento. Assim, o presente método experimental ajuda a entender como as características fisiológicas das mães mudam desde a gravidez até a criação dos filhotes, apoiando o desenvolvimento saudável dos filhotes.
Introdução
A relação mãe-prole é única entre as relações estabelecidas por várias espécies animais devido ao seu grande impacto no futuro da prole1. Em humanos, o desenvolvimento e os comportamentos internos / externos das crianças são influenciados pelo estilo parental, bem como pela extensão do abuso e negligência 2,3. Da mesma forma, em roedores, a qualidade do comportamento materno tem um impacto significativo no desenvolvimento e comportamento dos filhotes 4,5,6. Portanto, o rastreamento e o exame detalhados dos comportamentos de nutrição das mães podem fornecer informações sobre os mecanismos das diferenças individuais no desenvolvimento e no apoio saudável de seus filhos.
Estudos comportamentais e fisiológicos mostraram que as mães mamíferas sofrem mudanças dinâmicas comportamentais e fisiológicas da gravidez à lactação. Quando as fêmeas de mamíferos engravidam, a secreção de estrogênio e outras alterações hormonais influenciam o comportamento materno7. À medida que a prole cresce e a frequência da lactação diminui, a secreção hormonal muda dinamicamente para o estado pré-gestacional, pondo fim à expressão do comportamento materno 8,9,10. Esses achados sugerem que a interação entre o sistema endócrino, o comportamento materno e o desenvolvimento da prole desempenha um papel importante nas mudanças que as mães de mamíferos experimentam durante a gravidez e lactação.
Alterações comportamentais e fisiológicas em mães mamíferas da gravidez à lactação estão intimamente relacionadas não apenas ao sistema endócrino, mas também ao sistema nervoso autônomo11,12. Estudos em humanos sugerem que o contato mãe-bebê induz alterações no sistema nervoso autônomo de mães e bebês13. Vários estudos mediram o eletrocardiograma (ECG) e a variabilidade da frequência cardíaca em mães e bebês humanos, mostrando que cada comportamento altera a frequência cardíaca e o intervalo RR dos outros 14,15,16. No entanto, não está claro como os três fatores - sistema nervoso autônomo, comportamento materno e desenvolvimento da prole - interagem entre si desde a gravidez até a lactação. Além disso, é difícil monitorar essas interações em humanos por um longo período de tempo porque o período de lactação humana é de aproximadamente dois anos.
Roedores são frequentemente usados em vez de humanos em tais estudos. O sistema nervoso autônomo de roedores foi medido sob anestesia ou quando isolado de filhotes para evitar registros instáveis e danos ao dispositivo de medição; portanto, a medida é temporal em situações comportamentais restritas 17,18,19. É essencial observar o sistema nervoso autônomo em um ambiente onde os roedores possam se mover livremente e se comunicar com outras pessoas, pois as interações mãe-filhote podem alterar o comportamento e a fisiologia das mães 8,9,10,15.
Este método experimental foi desenvolvido para permitir a livre circulação da mãe. Nesse método, um telômetro de ECG foi conectado por via subcutânea a uma mãe grávida para evitar danos ao dispositivo e permitir o registro estável do ECG a longo prazo, desde a gravidez até a lactação. As mães de camundongos podem exibir comportamentos gerais (auto-higiene, ingestão de alimentos, etc.) e comportamento materno usual em sua gaiola doméstica; portanto, cada comportamento e ECGs podem ser observados e comparados facilmente no mesmo mouse. Um gravador registrou o comportamento do mouse por 24 horas durante um período de quatro semanas. Este protocolo experimental nos permitiu rastrear as mudanças dinâmicas na atividade autonômica e no comportamento desde a gravidez até o período materno.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Azabu (#210319-30). Camundongos C57B/6J no dia gestacional (GD) 14 com peso superior a 22 g foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os reagentes e equipamentos necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação experimental
- Ligue o aquecedor do painel e cubra-o com papel alumínio. Limpe todas as superfícies com etanol 70%.
- Todos os instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças, pinças finas e pinças) foram previamente autoclavados.
- Prepare as suturas estéreis no comprimento desejado e mantenha-as prontas.
- Cubra as máscaras de anestesia com máscaras de borracha para garantir a esterilidade e o conforto do paciente.
- Inspecione o telémetro de biopotencial do rato (Figura 1A) para verificar se existem anomalias ou danos utilizando as aplicações tBase e LabChart (o software de análise de dados fisiológicos) instaladas num computador capaz de registar.
2. Implantação de telémetro
- Coloque o camundongo em uma caixa de anestesia de indução com isoflurano a 4%.
- Depois de atingir o plano cirúrgico da anestesia, coloque o mouse em decúbito ventral no aquecedor do painel. Posicione a máscara de anestesia no mouse, mantendo um nível de isoflurano de 1% a 2,0% e um fluxo de oxigênio de 0,5 a 2 L / min.
NOTA: Neste protocolo, não foram utilizados analgésicos, levando-se em consideração seus efeitos sobre o feto e observações comportamentais. - Use um aparador para remover o pelo entre as orelhas e desinfete a pele três vezes com desinfetantes alternados à base de iodo e álcool 70%.
- Para confirmar o plano cirúrgico da anestesia, aperte os dedos das patas traseiras do camundongo com uma pinça. Faça uma incisão (2-3 cm) na pele entre as orelhas usando uma tesoura. Insira uma pinça na incisão para separar a pele e o músculo ao redor do pescoço e do lado ventral, criando espaço no lado ventral especificamente para a colocação de telemetria.
- Insira o telémetro através da incisão entre as orelhas e coloque-o no espaço lateral ventral.
- Use uma pinça para rolar e agrupar os eletrodos positivos e negativos. Coloque os eletrodos no espaço do pescoço (Figura 1B).
- Suturar a incisão com agulha de 13 mm e sutura de 20 cm, tomando cuidado para evitar danos aos eletrodos.
- Coloque o mouse em decúbito dorsal e arranque o pelo ao redor da clavícula com um aparador. Desinfete a pele três vezes com desinfetantes alternados à base de iodo e álcool 70%.
- Faça um pequeno corte ao redor da pele da clavícula com uma tesoura e separe os músculos da pele do pescoço. Extraia os eletrodos positivos e negativos da parte de trás do pescoço usando uma pinça.
- Use uma pinça para separar as glândulas salivares e expor a aparência em forma de "V" do músculo esternocleidomastóideo (SCM), que se origina da clavícula e viaja obliquamente por cada lado do pescoço (Figura 1C, D).
- Ajuste o comprimento do fio negativo para alcançar o SCM próximo à clavícula. Remova cuidadosamente o tubo de chumbo do fio negativo, certificando-se de que o eletrodo de aço inoxidável enrolado no interior seja esticado com uma pinça fina.
- Passe a agulha de costura (7 mm) com uma sutura de 10 cm pela curva em forma de V do SCM para criar um laço. Passe o eletrodo de aço inoxidável do fio negativo por este laço e posicione-o sob o SCM próximo à clavícula.
- Amarre levemente o laço para evitar danificar o SCM e repita três vezes para prender o eletrodo de aço inoxidável. Prenda ainda mais o eletrodo negativo posicionando a segunda sutura no lado cranial do ECM e amarrando-a ao redor do tubo do eletrodo negativo (Figura 1E).
- Realize a secção ao redor do processo xifóide e separe cuidadosamente a pele do músculo, do processo xifóide até a clavícula.
- Estenda o chumbo positivo para alcançar o processo xifóide. Semelhante ao fio negativo, remova o tubo de chumbo do fio positivo, garantindo que o eletrodo de aço inoxidável enrolado no interior seja esticado usando uma pinça fina.
- Use uma agulha de 18 G para criar um túnel sob o músculo ao redor do processo xifóide, depois coloque o eletrodo de aço inoxidável em uma agulha e passe-o pelo músculo ao redor do processo xifóide.
- Após a remoção da agulha, suturar levemente o eletrodo de aço inoxidável enrolado ao músculo ao redor do processo xifóide usando uma agulha de costura (7 mm) com uma sutura de 10 cm (Figura 1D). Para proteger ainda mais o eletrodo positivo, posicione a segunda sutura no lado cranial do apêndice xifóide e amarre-a ao redor do tubo do eletrodo positivo.
- Feche todas as incisões com agulha de costura (13 mm) com 20 cm de comprimento de sutura (Figura 1E,F).
- Após a implantação, coloque o mouse em uma gaiola limpa e posicione a gaiola no tBase, que atua como receptor para telemetria do mouse (Figura 1G). Ligue o computador gravável e use o aplicativo de software de análise de dados instalado para coletar dados de ECG. Verifique se os dados de ECG exibem formas de onda normais (Figura 2A,B).
NOTA: Em caso de formas de onda ou ruído anormais (conforme mostrado na Figura 2C), recoloque os fios negativo e positivo sob anestesia. - Durante o período de recuperação de dois dias, certifique-se de que o rato seja tratado adequadamente, colocando gel de água e comida no fundo da gaiola. Registre apenas o comportamento da gaiola doméstica com um gravador de unidade durante esse período de recuperação.
3. Registro de ECGs e comportamento em gaiola domiciliar desde a gravidez até o desmame
- Acenda as luzes vermelhas durante a fase escura porque o gravador não pode funcionar sem luz. Posicione o gravador da unidade perto da gaiola inicial para registrar o comportamento. Grave o ECG usando o aplicativo LabChart no PC gravável. Antes de coletar os dados de ECG, verifique a taxa de amostragem de ECG no LabChart.
NOTA: Neste protocolo, o gravador de unidade foi escolhido porque pode ser colocado em qualquer lugar. Além disso, em comparação com uma câmera de vídeo, os gravadores de unidade podem gravar em grande angular e usar menos capacidade de armazenamento de dados (por exemplo, gravar 24 horas com um gravador de unidade usa cerca de 70 GB). Nesta demonstração, a taxa de amostragem de ECG no software de análise de dados é definida em 1 k/s. - Depois de ligar o gravador da unidade, inicie o LabChart no computador para registrar o comportamento e o ECG.
NOTA: Nesta demonstração, uma macro foi utilizada para registrar continuamente o ECG e salvar automaticamente os arquivos a cada 2 h. Esse processo repetitivo foi executado ao longo do experimento. Além disso, um cartão SD de 256 GB foi selecionado para fins de gravação, permitindo aproximadamente 24 h de coleta de dados por dia. - Verifique se há anormalidades no parto e no corpo do mouse e anote os dados do gravador da unidade e do computador gravável. O dia em que o camundongo deu à luz seus filhotes é considerado como o dia pós-natal (PD) 0. Meça o peso dos filhotes todos os dias após o nascimento.
NOTA: Neste estudo, o vídeo de gravação do gravador de unidade e o arquivo de dados de ECG do PC gravável foram coletados todas as manhãs das 7h30 às 8h30. Além disso, para evitar o ruído de ECG de vibrações causadas por vários filhotes tocando a mãe, a ninhada foi abatida para quatro filhotes (metade deles eram machos e a outra metade eram fêmeas). - Depois de verificar o mouse e coletar os dados, retorne tudo à sua posição original. Ligue o gravador de unidade e o computador gravável. Inicie o aplicativo LabChart.
NOTA: Se uma macro for usada para gravar o ECG, clique no botão macro e inicialize a macro selecionando o botão executar na opção gerenciar . - Uma vez por semana, substitua a gaiola por uma nova. Durante este processo, inclua a roupa de cama, metade da qual é usada anteriormente e a outra metade é nova.
NOTA: Este processo, incluindo amostragem de dados e verificações em camundongos, foi repetido do GD 17 até o dia pós-natal (PD) 21.
4. Analisando os ECGs
- Para analisar os dados de ECG, use o software de análise de dados. Inicie o LabChart e abra o arquivo de dados para o período de gravação. Para analisar a variabilidade da frequência cardíaca (VFC), clique no botão VFC e ajuste as configurações de detecção de batimento.
NOTA: Nesta demonstração, selecione a configuração personalizada e altere a altura mínima do pico para 1.2 para ajuste de detecção. - Depois de ajustar as configurações, revise todas as batidas e exclua todos os dados de ruído (conforme mostrado na Figura 2C).
NOTA: Se uma onda R não for detectada, adicione-a ou modifique-a usando o botão HRV . - Clique no botão HRV e selecione a visualização do classificador de batidas. Escolha todas as batidas na visualização do classificador de batidas e, em seguida, selecione a visualização do relatório no botão VFC . Copie os dados do modo de exibição de relatório e cole-os no Excel.
NOTA: Os resultados da VFC, conforme mostrado na Tabela 1, exibem os domínios de tempo e espectro por meio do software de análise de dados, permitindo a observação.
5. Categorizando o etograma do comportamento da gaiola doméstica
- Revise todos os vídeos gravados para verificar se há anormalidades, como a luz vermelha não acender durante a fase escura e o gravador da unidade não funcionar.
NOTA: O vídeo é gravado da mesma maneira que os ECGs, com videoclipes capturados a cada 2 h. - Categorize o etograma com base em parâmetros como a postura da mãe durante o comportamento, o tempo gasto no comportamento e o local onde o comportamento ocorreu (Tabela 2) e, em seguida, observe o vídeo do gravador da unidade.
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Resultados
Depois de implantar o telémetro na rata grávida, registramos os ECGs da gravidez à lactação em uma gaiola doméstica. A taxa de amostragem foi definida para 1 k/s. Para comparar o ECG de cada estado fisiológico da mãe camundongo, evitando a influência do ritmo circadiano, foram analisados os dados de 10 minutos de 23:32 a 23:42 no GD 17, parto, PD 0 e PD 21 do arquivo de dados de 2 h (Figura 3, Tabela 1). O horário das 23:32 às 23:42 foi escolhido por representar os 10 minuto...
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Discussão
Nesse método, em que o telémetro foi implantado em camundongos prenhes, o ECG pôde ser rastreado continuamente no mesmo camundongo desde a gravidez até a lactação. O camundongo exibiu etogramas que incluíam movimento, indicando vigília durante todos os períodos de análise (23:32-23:42) do GD 17 ao PD 21. Além disso, os resultados mostraram que a frequência cardíaca diminuiu gradualmente da gravidez para a lactação. Considera-se que essa diminuição se deve à normalização da frequência car...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Numbers JP 21H04981 e 30974521) e pelo Centro de Diversidade, Equidade e Inclusão da Universidade de Azabu.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 24-h repetindo a | de Panasonic | ||
| 5-0 | Natsume Seisakusho | Co-23s-N2 | |
| Caixa da anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1010 | W110× D110&vezes; H110mm |
| Máscara de anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1019-1 | |
| Máquina anestésica | Natsume Seisakusho Co | KN-1071-E | |
| C57BL6 / J camundongos | Clea Japan, Inc | Mouse de gravidez em 14 dias | |
| Clip light | Yazawa corporation | CLX60X02WH | |
| Configurator System | Adinstuments | TR190 | |
| gravador de acionamento | Transcend | TS-DP250A-32G | |
| Suporte para alimentos | Clea Japan, Inc | CL-2802 | |
| Isoflurano | FujiFilM | 099-06571 | |
| LabChart Pro V8 | Adinstuments | MLU260/8 | |
| LabChart8 | Adinstuments | MLS060/8 | |
| Mouse Biopotential Telemeter | Adinstuments | MT10B | |
| Agulha 18 G 1 1/2 | Terumo | NN-1838R | |
| Aquecedor de painel | SANKO | 4976285145407 | |
| PowerLab 4/26 | Adinstuments | PL2604 | |
| Mouse de computador gravável | Mouse de computador | K7-H | |
| lâmpada vermelha | ELPA | LDG1R-G-GWP254 | |
| Máscara de borracha | Natsume Seisakusho Co | Cartão SD KN-1019-M | |
| (256GB) | Transcend | TS256GUSD350V | Pode gravar aproximadamente 24 h |
| Agulha de sutura 13 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0 | |
| Agulha de sutura 7 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0000 | |
| tBase | Adinstuments | MT110 |
Referências
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Reimpressões e permissões
