Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.
Artigo de método
Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra adulto (Danio rerio), que é geneticamente acessível, está sendo empregado como um valioso modelo de vertebrado para estudar doenças humanas, como a cardiomiopatia. A injeção intraperitoneal (IP) é um método importante que fornece compostos ao corpo para testar efeitos terapêuticos ou gerar modelos de doenças, como a cardiomiopatia induzida por doxorrubicina (CIVD). Atualmente, existem dois métodos de injeção de IP. Ambos os métodos têm limitações ao lidar com compostos tóxicos como a doxorrubicina, que resultam em efeitos colaterais que se manifestam como danos graves à forma do corpo e morte de peixes. Embora essas deficiências possam ser superadas por um extenso treinamento do investigador, é desejável um novo método de injeção de IP que tenha efeitos colaterais mínimos. Aqui, é relatado um método exclusivo de injeção de IP capaz de lidar com compostos tóxicos. A função cardíaca consistentemente reduzida pode resultar sem incorrer em morte significativa de peixes. A técnica pode ser facilmente dominada por pesquisadores que têm experiência mínima com peixes-zebra adultos.
Introdução
O peixe-zebra (Danio rerio) tem ganhado atenção como modelo experimental para o estudo de doenças humanas, pois esse animal engloba alta homologia gênica e orgânica em relação aos humanos, fertilização externa, facilidade de manipulação genética e transparência corporal até a maturidade precoce, o que facilita uma infinidade de aplicações de imagem1. Ao contrário do processo direto de entrega de medicamentos diretamente na água para embriões e larvas de peixe-zebra, a administração de medicamentos a peixes-zebra adultos apresenta um esforço mais intrincado e desafiador2.
Em peixes adultos, os compostos podem ser entregues por meio de técnicas passivas de administração de medicamentos, como administração direta na água, ou por meio de métodos orais de administração de medicamentos, como gavagem2. Outras abordagens incluem revestir alimentos para peixes com os compostos e, posteriormente, alimentar os peixes3, e administração direta de medicamentos insolúveis em água em uma concentração predeterminada, incluindo injeções retroorbitais ou intraperitoneais 4,5. A administração intraperitoneal é preferida para estudos in vivo de modelos de doenças devido às suas vantagens farmacocinéticas distintas6. Esse método proporciona uma alta concentração do fármaco e uma meia-vida prolongada dentro da cavidade peritoneal, oferecendo uma via eficaz para a administração do fármaco 7,8. A abordagem é comumente utilizada em ambientes de pesquisa para garantir a absorção e distribuição ideais de medicamentos 9. Embora os métodos baseados em injeção se mostrem eficientes para administração única, injeções prolongadas e repetidas geralmente levam a danos corporais e infecção crônica2.
Atualmente, existem dois métodos de injeção de IP em zerbafish adultos 4,10. No entanto, ambos os métodos têm limitações ao fornecer compostos tóxicos como a doxorrubicina, levando a graves danos à forma do corpo e à mortalidade dos peixes. Os efeitos colaterais podem complicar significativamente a interpretação dos dados. Embora esses desafios possam ser resolvidos com treinamento extensivo10, há uma clara necessidade de um novo método de injeção de IP que minimize os efeitos colaterais.
Aqui, nosso objetivo é desenvolver um novo método de injeção de IP otimizado para a entrega eficaz de doxorrubicina em peixes-zebra adultos, facilitando a geração de modelos confiáveis de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina (CIVD) com danos corporais minimizados e mortalidade associada.
Protocolo
Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic, aderindo aos padrões descritos no 'Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório' (National Academies Press, 2011). Todos os peixes-zebra do estudo pertencem à cepa Wild Indian Karyotype (WIK). Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação e armazenamento da solução-mãe de doxorrubicina
- Obtenha o estoque de doxorrubicina de uma fonte comercial.
NOTA: A doxorrubicina é sensível à luz, portanto, adquira-a em pó e armazene-a em recipientes opacos para protegê-la da exposição à luz. Execute todas as etapas para a preparação do pó Dox dentro de uma capa química. - Dissolva completamente o pó de Dox em água destilada e prepare uma solução de estoque com uma concentração final de 5 mg / mL.
- Alicote o estoque dividindo-o em tubos de 1,5 mL.
- Enrole os tubos em papel alumínio para protegê-los da exposição à luz.
- Armazenar a alíquota da solução Dox a 4 °C para armazenamento a curto prazo (<1 mês) ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo10.
2. Agrupar os peixes de acordo com seu peso corporal
- Agrupe os peixes com uma diferença de peso corporal inferior a 10% para injeção subsequente.
NOTA: Para economizar esforço nesta fase, os peixes com menos de 10% de variação do peso corporal são categorizados como do mesmo tamanho. - Deixe o peixe jejuar por 24 horas antes da injeção.
- Anestesiar os peixes com água embrionária contendo 0,16 mg/mL de tricaína por 1 min.
- Retire o peixe da água com tricaína e enxugue os dois lados do corpo do peixe com papel de filtro limpo para remover o excesso de água.
- Meça e registre o BW de cada peixe e, em seguida, devolva imediatamente o peixe a um tanque de recuperação cheio de água doce do sistema.
NOTA: A injeção de Dox foi realizada em peixes após atingirem 3 meses de idade. Neste estudo, os pesquisadores utilizaram peixes de 3 meses a 10 meses de idade. Os BWs do peixe-zebra maduro da linhagem WIK podem variar de 0,2 g a 0,5 g. A anestesia prolongada com duração superior a 5 min, seguida de uma injeção de Dox, levou a uma alta mortalidade de peixes.
3. Preparação da agulha e da estação de injecção
- Determine o volume de injeção da solução-mãe Dox (por exemplo, 5 mg / mL) necessário para cada peixe com base no peso corporal médio para atingir a dose desejada de 20 μg / g.
- Use a seguinte fórmula para calcular o volume de injeção:
- Adicione 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) para diluir a solução Dox calculada na etapa 1 para injeção, atingindo um volume total de 5 μL.
NOTA: Utilize a solução a granel para cada grupo de peixes com base em seu peso corporal e inclua 3 peixes adicionais em cada grupo para garantir que não haja falta de solução injetável durante o curso do experimento. - Bata suavemente no tubo e, em seguida, microcentrifugue brevemente em velocidade máxima para coletar a solução em temperatura ambiente por 10 s.
- Coloque a solução preparada no gelo e proteja-a da exposição à luz.
- Coloque uma placa de Petri limpa de 100 mm com uma esponja embaixo de um microscópio de dissecação e ajuste o foco.
NOTA: A esponja contém uma ranhura de 4 cm de comprimento. A retração elástica da esponja fornecerá suporte ao peixe e manterá o corpo do peixe na posição. A esponja pode ser reutilizada. - Equipar uma microseringa de 10 μL com uma agulha biselada de 34 G.
- Lave a agulha com 1x tampão HBSS para eliminar quaisquer bolhas e eliminar possíveis bloqueios da seringa.
- Meça 5 μL da solução preparada na etapa 4 para a injeção.
4. Procedimento de injeção IP Dox
- Coloque o peixe adulto na água com 0,16 mg/mL de tricaína por 1 min para induzir um estado de inconsciência.
- Posicione o peixe na ranhura da esponja embutida com o abdômen voltado para cima (Figura 1A).
- Insira a agulha com um ângulo próximo a 0°, começando do ponto médio da nadadeira peitoral em direção ao lado posterior da cavidade cardíaca (Figura 1B).
NOTA: Evite qualquer contato com o coração durante o procedimento. - Direcione a agulha para a cauda e passe por baixo da pele prateada.
NOTA: Posicione a agulha próxima à pele prateada, tomando cuidado para evitar arranhões ou piercings. - Monitore a ponta da agulha dentro da cavidade abdominal durante toda a operação (Figura 1C).
NOTA: Evite danificar o fígado, intestinos, bexiga natatória e outros órgãos. Certifique-se de que a agulha atinja o final do intestino, próximo ao forame cloacal. - Dispense gradual e uniformemente a solução Dox de 5 μL e, em seguida, retire lentamente a agulha ao longo do caminho original para evitar qualquer vazamento (Figura 1D).
- Monitore a cavidade abdominal quanto à presença de Dox, observando uma coloração vermelha da solução de Dox (Figura 1E).
- Mova rapidamente o peixe injetado para um tanque de travessia limpo cheio de água fresca do sistema para ajudar o peixe a se recuperar.
NOTA: Entre as injeções, lave a agulha uma vez com 1x tampão HBSS.
5. Gestão pós-injecção dos peixes
- Retorne o peixe ao sistema com circulação após a injeção.
- Jejue todos os peixes injetados por mais 24 horas para facilitar sua recuperação.
- Durante a primeira semana, fique de olho nos peixes. Remova o peixe morto o mais rápido possível para evitar infectar os outros peixes.
NOTA: As mortes de peixes nas primeiras 24 horas são provavelmente devidas a lesões físicas causadas pela injeção ou anestesia prolongada. Registre o número de peixes para gerar uma curva de sobrevivência. - Realizar ecocardiografia para fenotipar os peixes injetados com Dox 56 dias após a injeção11.
NOTA: Garantir a uniformidade nas condições e procedimentos para o grupo de controle correspondente injetado com solução HBSS.
Resultados
Anteriormente, dois métodos intraperitoneais (IP) foram empregados para a administração de doxorrubicina em peixes-zebra adultos 4,10. No método I, também conhecido como método clássico de injeção IP, conforme descrito por Kinkel et al.4, a agulha foi inserida em um ângulo de 45° em relação à linha média entre as nadadeiras pélvicas com o abdome voltado para cima. No método II, ou no método de injeção IP alternativo descrito por Ma et al.10, a agulha foi inserida pelo lado dorsal do peixe (Figura 2A(i,ii)). Em contraste, nosso método III tem duas mudanças principais. Primeiro, a posição da injeção é alterada, com o abdômen voltado para cima e a agulha direcionada do ponto médio da nadadeira peitoral em direção ao abdômen. O local de penetração é guiado por um orifício natural nesta área. Em segundo lugar, o ângulo da agulha é reduzido, que deve estar próximo de 0° (Figura 2A(iii), Figura 1).
Comparação entre três métodos de injeção intraperitoneal
Para comparar os três métodos de injeção de IP, são apresentados dados obtidos do Pesquisador I, que não tinha experiência prévia com peixe-zebra. Quando os métodos I e II foram usados para injeção de IP, observou-se mortalidade significativa de peixes nas duas semanas iniciais após a injeção de IP. No método I, o óbito foi observado três dias após a injeção, enquanto no método II, ocorreu após dois dias após a injeção. 70% dos peixes injetados exibiram danos corporais visíveis, especialmente ao redor do local da injeção, manifestando-se como tamanho corporal drasticamente reduzido e formato corporal curvo um a dois meses após a injeção IP (Figura 2A (iv, v)). Raciocinou-se que a mortalidade e os danos observados poderiam ser atribuídos à toxicidade da doxorrubicina12, que pode vazar da extremidade de abertura da agulha de injeção durante o processo de injeção, danificando o órgão interno ao longo da via de injeção. No método I, a ponta da agulha de injeção pode tocar o intestino (Figura 2A(i)), enquanto no método II, pode tocar a bexiga natatória (Figura 2A(ii)). Postulou-se que se poderia evitar que a ponta da agulha tocasse qualquer órgão interno usando o método III (Figura 2A(iii)). De fato, foi observada uma taxa de sobrevivência significativamente melhorada, com 80% dos peixes sobrevivendo 1 mês após a injeção (Figura 2B). Isso significa uma melhora notável em comparação com as taxas de sobrevivência para os métodos I e II, que foram de 53,33% e 33,33%, respectivamente. É importante ressaltar que 80% dos peixes sobreviventes exibiram uma forma corporal normal, em contraste com os gerados pelos métodos I e II (Figura 2A (vi)). Para validar a geração bem-sucedida do modelo DIC, a função cardíaca foi avaliada medindo a porcentagem da fração de ejeção (FE%). De fato, uma redução significativa na FE% foi observada 56 dias após a injeção no grupo que usou o método III (Figura 2C).
Reprodutibilidade do método III por diferentes pesquisadores
Para provar que o método III pode ser facilmente dominado por diferentes pesquisadores, foram recrutados para o estudo 3 pesquisadores que nunca haviam trabalhado com peixe-zebra antes. Após suas primeiras tentativas com o método III, todos os pesquisadores foram capazes de atingir taxas de sobrevivência de 85,71%, 95% e 83,33% 56 dias após a injeção e uma FE acentuadamente diminuída (Figura 3A, B). É importante notar que três pesquisadores repetiram seu experimento 3 vezes, 3 vezes e 2 vezes, respectivamente, e obtiveram resultados bem-sucedidos de forma consistente. Esses dados confirmaram a repetibilidade do método III, permitindo que pesquisadores sem experiência anterior em trabalhar com peixes gerassem modelos DIC confiáveis.
Em uma das tentativas iniciais com o método III, o pesquisador II testou um desvio do método III: em vez de 0°, foi utilizado um ângulo de 45° ao penetrar a agulha através da pele (Figura 2A(iii), seta tracejada). Apenas 15% dos peixes sobreviveram dois meses após a injeção (Figura 3A), com 80% dos peixes sobreviventes apresentando danos corporais consideráveis. Os dados indicaram que o ângulo de penetração é uma etapa crítica para o sucesso do método III.
O método III permite o estabelecimento de um modelo de CID crônico
Foi postulado que danos corporais significativamente reduzidos podem permitir múltiplas injeções de IP no mesmo peixe, imitando o modelo DIC crônico em camundongos13,14. Assim, o método III foi usado para fazer uma série de injeções por 4 semanas consecutivas, com 5 μg / g Dox por semana ( Figura 4A ). Neste experimento, 100% dos peixes injetados sobreviveram e 80% deles não exibiram sinais de danos corporais. É importante ressaltar que uma fração de ejeção significativamente reduzida foi observada em 56 dpi, indicando a geração bem-sucedida de um modelo DIC crônico em peixes-zebra adultos (Figura 4B).
Figura 1: Localização e ângulo de inserção da agulha para o novo método de injeção IP. (A) A localização da inserção da agulha. O peixe está de cabeça para baixo, expondo o lado abdominal. A cabeça está à direita. Um orifício natural está localizado entre as barbatanas peitorais que torna a penetração da pele mais simples. (B) O ângulo de inserção da agulha. Está perto de zero grau da superfície do peixe. (C) O rastro da agulha sob a pele. A ponta da agulha é monitorada continuamente uma vez dentro da cavidade abdominal. O ponto de entrada parece diferente da Figura 1A devido à distorção da pele durante o processo de penetração. (D) Um peixe após Dox ser liberado. A cavidade abdominal fica vermelha após a liberação do Dox. (E) Um peixe após injeção de IP. Não há sinal de vazamento após a retirada da agulha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação de três métodos de injeção de IP em peixes-zebra adultos. (A) Esquemas de três métodos de injeção de IP. (i-iii) São mostrados esquemas da injeção de IP clássica (método I), injeção de IP alternativa (método II) e o novo método (método III). As setas indicam os locais de penetração e o ângulo da agulha para três métodos de injeção. Seta tracejada, um ângulo malsucedido de penetração da agulha. Barra de escala: 5 mm. (iv-vi) Tamanho do corpo reduzido e forma do corpo curvo nos modelos DIC. São mostrados peixes representativos de peixes DIC a 56 dpi. (B) Comparação das curvas de sobrevivência entre três métodos de injeção de IP. O número de peixes sobreviventes foi registrado semanalmente. (O experimento começou com um total de n = 15). (C) Avaliação da função cardíaca de peixes a 56 dpi após estresse Dox. n = 6 peixes no grupo controle 1x HBSS, e o experimento começou com um total de n = 15 peixes em cada 3 lotes injetados com Dox. Os valores são mostrados como a média ± erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O Método III permite que o modelo DIC do peixe-zebra seja estabelecido de forma consistente nas mãos de 3 investigadores diferentes. (A) Curvas de sobrevivência de peixes DIC usando o Método III por três pesquisadores diferentes. Uma alta taxa de sobrevivência foi observada em todos os três investigadores. O número de peixes vivos é registrado semanalmente. Uma baixa taxa de sobrevivência foi observada para o pesquisador II quando um método III malsucedido foi usado (ângulo de penetração da agulha de 45°, conforme mostrado por uma seta tracejada na Figura 2A). (B) Avaliação da função cardíaca de peixes DIC usando o Método III por três pesquisadores diferentes. No total, o Pesquisador II, para um ângulo de penetração da agulha de 45°, usou 3 lotes (9, 12, 14) de peixes para injeção de Dox. Para o ângulo de penetração da agulha de 0° n = 6, peixes foram empregados no 1x HBSS como grupo controle compartilhado. O experimento começou com um total de n = 85 peixes com RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) e RIV (12, 18) empregados em cada um dos 8 lotes injetados com Dox por três pesquisadores (II, III, IV), respectivamente. Os valores são mostrados como a média ± erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O Método III permite múltiplas injeções de Dox em um peixe-zebra adulto, recapitulando modelos DIC crônicos em roedores. (A) Esquemas do modelo de injeção múltipla. 5 μg/g Dox (5 μL) foram injetados em quatro semanas consecutivas. (B) O modelo DIC crônico manifesta FE% reduzido a 56 dpi. Os valores são mostrados como a média ± erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Diferente dos dois métodos de injeção de IP existentes 4,10, o novo método de injeção de IP é caracterizado pelas seguintes características distintas. Em primeiro lugar, é usado um ângulo de penetração da agulha exclusivo (próximo a zero); em segundo lugar, a agulha penetra no peixe através de um local único, ou seja, um orifício natural na superfície ventral de um peixe, o que facilitaria a injeção; e, finalmente, o movimento da agulha é de anterior para posterior. Esses ajustes reduzem efetivamente a lesão de órgãos, que resulta do vazamento minimizado de Dox durante o processo de penetração. O caminho da agulha está logo abaixo da pele prateada, que pode ser monitorada continuamente pelo investigador. Consequentemente, o contato direto entre a ponta da agulha e os órgãos internos pode ser efetivamente evitado. Após a injeção, todo o Dox injetado permanece na cavidade abdominal, e a única saída (ponto de punção) pode ser fechada quando o peixe está acordado e começa a nadar para frente.
Comparado com os dois métodos de injeção IP existentes 4,10, o novo método de injeção IP resulta consistentemente em danos corporais minimizados e taxas de sobrevivência aprimoradas. Esta afirmação foi ainda mais ressaltada pela viabilidade de múltiplas injeções no mesmo peixe para gerar um modelo DIC de peixe-zebra crônico. É importante ressaltar que, em comparação com os dois métodos anteriores de injeção de IP 4,10, o novo método pode ser rapidamente dominado por pesquisadores que não têm experiência anterior no manuseio de peixes-zebra adultos. Modelos DIC confiáveis parecem obtidos com sucesso em sua primeira ou segunda tentativa nas mãos de pelo menos 4 investigadores diferentes. O sucesso da injeção pode ser facilmente concluído na primeira semana após a injeção: >80%, de preferência 100%, os peixes devem ser capazes de sobreviver após a injeção. Todos os peixes sobreviverão até 56 dpi, quando a maioria dos peixes (>80%) deve estar livre de danos corporais óbvios. Esta é uma melhoria significativa, porque o modelo DIC confiável usando os dois primeiros métodos de IP só pode ser estabilizado na mão de um pesquisador após mais de 3 rodadas de prática com pelo menos 10 peixes em cada rodada. Esse processo pode ser demorado, porque cada prática exigiu cerca de 2 meses para concluir sobre o sucesso de sua injeção. A redução do trauma tecidual não apenas melhora o bem-estar dos peixes, mas também minimiza os fatores de confusão que podem afetar os resultados do estudo.
Um passo crítico para garantir o sucesso do novo método é o ângulo de penetração. Conforme mostrado na Figura 2, quando o ângulo de penetração mudou de 0° para 45°, observou-se morte significativa de peixes, presumivelmente devido ao aumento do risco de contato entre a ponta da agulha e os órgãos internos.
A principal limitação do método é que o método não pode ser usado para administrar medicamentos a peixes com menos de 3 meses. Devido ao seu pequeno tamanho corporal, os peixes jovens não podem sobreviver após o dano físico associado à penetração de uma agulha. No entanto, o método pode ser usado em peixes adultos quando seu PC é maior que 0,15 g, incluindo aqueles com idade entre 3 meses e 4 anos.
Este novo método seria amplamente utilizado para a entrega de medicamentos em peixes-zebra adultos, especialmente quando se trata de compostos potencialmente tóxicos, como Dox15,16. Quando se trata de compostos não tóxicos, todos os três métodos devem ser aplicáveis.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo NIH (HL107304 e HL081753) e pela Fundação Mayo (Centro de Descoberta Biomédica e Centro de Pesquisa Cardiovascular) para X.X. J.L. é financiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da Universidade Central do Sul, nº 56021702. Agradecimentos especiais a Beninio Gore e Quentin Stevens por gerenciar a instalação de peixe-zebra.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-seringa | World Precision Instruments, Inc | Ferramenta de injeção | NANOFIL |
| 34 G agulha | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | ferramenta de injeção |
| 60 mm Placa de Petri | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | colocando a esponja |
| Microscópio de dissecação | Nikon | SMZ800 | Injetando o medicamento Dox Doxorubicina |
| cloridrato | Sigma | D1515-10MG | para criar o modelo DIC |
| Ecocardiografia | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | medindo a função cardíaca |
| Esponja de Espuma | Jaece Industries | L800-D | colocando o peixe |
| Solução salina balanceada de Hank (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Veículo para |
| Microcentrífuga Dox | southernlabware | MyFuge/C1012 | coleta a solução Dox |
| Balança de Precisão | Torbal | AD60 | Balanças Digitais |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Tubo de anestesia para peixes |
| Eppendorf | 1,5 mL | de armazenamento | |
| software vevo LAB | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Quantificação do coração |
Referências
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Reimpressões e permissões
