Artigo de método

Análises baseadas em bioinformática e predição de epítopos de células B / th da proteína Art v 1 do alérgeno de pólen de artemísia

DOI:

10.3791/66517

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22 de dezembro de 2023

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University, 4Institute of Neurological Diseases, Shizuishan First People's Hospital, 5Department of Pharmacy, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para realizar análises de correlação de bioinformática para prever as propriedades físico-químicas, estrutura secundária e epítopos de células auxiliares B e T da proteína Art v 1 do pólen de artemísia para fornecer uma base teórica para o desenvolvimento subsequente da vacina contra doenças alérgicas ao pólen de artemísia e tratamento de doenças.

Resumo

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Para analisar as características da sequência do alérgeno de pólen de artemísia proteína Art v 1 e predizer seus epítopos de células B e Th (células T auxiliares), a sequência gênica e a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 foram obtidas por referência ao Genebank. ExPASy's Prot Param, TMHMM, DNAstar Protean, Swiss-Model, UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 e IEDB foram usados para analisar e prever propriedades físico-químicas, região transmembrana, estrutura secundária, estrutura terciária e epítopos de células B e Th da proteína.

A proteína Art v 1 é composta por 132 resíduos de aminoácidos, o peso molecular relativo é 13404,26, a fórmula molecular é C584H903N157O181S12, o valor de pI é 7,49, o índice de solubilidade lipídica é 41,59 e o índice hidrofílico é -0,454, que é considerado como proteína hidrofílica. O índice de instabilidade (ii) é 78,11, que é classificado como uma proteína instável. O terminal N da proteína possui uma região transmembrana α-helicoidal, localizada na sequência de resíduos de aminoácidos 5-27, e a posição 1-24 é a sequência de peptídeos sinalizadores. Existem bobinas aleatórias, β voltas, α-hélice e β folhas, e também contém estruturas de região hidrofílica, região flexível e região de acessibilidade de superfície.

Os resultados da previsão da estrutura terciária são consistentes com os resultados da análise da estrutura secundária. Cinco epítopos de células B dominantes foram previstos, que foram Art v 1 71-87, Art v 1 33-49, Art v 1 104-120, Art v 1 95-111 e Art v 1 86-102. Havia cinco epítopos dominantes de células Th, que eram Art v 1 2-16, Art v 1 3-17, Art v 1 4-18, Art v 1 5-19 e Art v 1 6-20. Prevê-se que a proteína Art v 1 tenha boa antigenicidade devido à presença de epítopos de células B e células Th.

Introdução

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A artemísia, um gênero de Artemisia in Compositae, é amplamente distribuída na Mongólia Interior, Gansu e outras regiões da China1. Várias doenças alérgicas induzidas pelo pólen da artemísia são geralmente alergias do tipo I causadas pela exposição repetida de indivíduos atópicos a alérgenos de pólen e pela geração de mediadores bioativos, resultando em inflamação catarral da mucosa nasal, conjuntiva e brônquios e até ataques de asma2. O Subcomitê de Observação de Alérgenos3 da OMS / IUIS reconheceu oficialmente sete alérgenos de artemísia atualmente, a saber, Art v 1-Art v 6 e Art AN 7. A proteína Art v 1 é um dos principais contribuintes para as alergias ao pólen da artemísia. Tem um peso molecular de 24-28 kDa e pode ser reconhecido por 95% dos indivíduos alérgicos ao pólen de artemísia4. Consiste em um domínio semelhante a beta-defensina N-terminal que está conectado a uma cauda rica em prolina C-terminal. As defensinas representam polipeptídeos antimicrobianos endógenos que são expressos em vários eucariotos5.

Atualmente, a imunoterapia com alérgenos (AIT) é o único tratamento etiológico que pode alterar o curso natural das doenças alérgicas, além de evitar a exposição a alérgenos6. A crescente prevalência de doenças alérgicas nas últimas décadas ressalta a importância da pesquisa básica e clínica sobre moléculas de alérgenos e suas potenciais aplicações no diagnóstico e tratamento de alergias. Muitos dos alérgenos usados para AIT pertencem a proteínas recombinantes, cujas propriedades físicas, químicas e imunológicas são adequadas para a produção de vacinas alergênicas com alergenicidade reduzida. Portanto, a AIT é considerada o principal meio de prevenção e tratamento eficaz de doenças alérgicas, pois as vacinas contra alergias são relativamente fáceis de produzir a baixo custo7. No entanto, o desenvolvimento de vacinas no passado dependia exclusivamente de biologia molecular e experimentos imunológicos. Além disso, a identificação do epítome é essencial para o desenvolvimento de vacinas, e os métodos mais confiáveis para a identificação de um epítopo são a cristalografia de raios-X e as técnicas de RMN atualmente; no entanto, eles são demorados e caros8. Assim, métodos e ferramentas computacionais, com as vantagens de baixo custo e alta velocidade, foram empregados para prever epítopos.

Este artigo descreve um método de análise de correlação de bioinformática para a predição das propriedades físico-químicas, estrutura secundária, estrutura terciária e epítopos de células B/Th da proteína Art v 1 do principal alérgeno de pólen de artemísia. Isso fornecerá uma base teórica para o desenvolvimento subsequente da vacina contra doenças alérgicas ao pólen de artemísia e tratamento de doenças.

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Protocolo

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1. Propriedades físicas e químicas da proteína Art v 1

  1. Insira AF493943.1 no Banco de Genes (Tabela de Materiais) para obter a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1).
    NOTA: A proteína Art v 1 contém 132 aminoácidos, que são codificados por 624 pb de sequências genéticas. Sua sequência de aminoácidos (AAO24900.1) é MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPP
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH.
  2. Inicie a ferramenta Expasy ProtParam (Tabela de Materiais), inserindo a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada na etapa 1.1. Clique no botão Calcular parâmetros para exibir a composição de aminoácidos, número atômico, fórmula molecular, peso molecular relativo, carga positiva e negativa, ponto isoelétrico e índice de instabilidade (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S2).
    NOTA: O índice de instabilidade é de <40, indicando que a proteína é estável; Um valor > 40 significa que a proteína é instável9.

2. Predição da região transmembrana e peptídeo sinal da proteína Art v 1

  1. Insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima no software online TMHMM Server v.2.0 (Table of Materials). Escolha Extensivo, com gráficos como formato de saída, clique em Enviar para exibir a estrutura da membrana e obter as características físicas e químicas da proteína transmembrana (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S3).
  2. Insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima na ferramenta online SignaIP5.0 Server (Tabela de Materiais). Escolha Eukarya como o grupo Organismo e Saída longa como o formato de saída, em seguida, clique em Enviar e preencha o endereço de e-mail para receber o resultado do peptídeo sinal de proteína previsto (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S4).

3. Predição da estrutura secundária da proteína Art v 1

  1. Para analisar a hidrofilicidade, acessibilidade à superfície, flexibilidade e índice de antígeno da proteína Art v 1, insira AF493943.1 no GeneBank (Tabela de Materiais) e clique em id de proteína AAO24900.1 | FASTA. Copie a sequência FASTA para o novo arquivo de texto e modifique o tipo de arquivo como FASTA (Supplemental File 1-Supplemental Figure 5). Em seguida, inicie o módulo proteico DNAstar do software e abra o arquivo FASTA para exibir a estrutura secundária da proteína Art v 1 (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S6).

4. Predição da estrutura terciária e avaliação da conformação da proteína Art v 1

  1. Para prever o modelo de estrutura terciária da proteína Art v 1, insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima no software online Swiss-Model (Tabela de Materiais), clique em Pesquisar modelos, selecione a proteína semelhante mais alta 2kpy.1.A como modelo, clique em Construir modelos | Modelo 01 e baixe o arquivo de formato PDB (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S7).
  2. Para avaliar a conformação de modelagem homóloga exibida na etapa 4.1, abra o software on-line UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 (Tabela de Materiais) e clique em Selecionar arquivo para carregar o arquivo de formato PDB na etapa 4.1 | Executar programas | Procheck | Resultado | Gráfico de Ramachandran (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S8).

5. Predição de epítopos de células B da proteína Art v 1

  1. Para prever o epítopo de células B da proteína Art v 1, abra o site da ferramenta online IEDB Analysis Resource (Tabela de Materiais), clique em Propriedades da Sequência de Antígenos, insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima e escolha o método Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 e, finalmente, clique em Enviar (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S9).
  2. Abra o site da ferramenta online ABCpred (Tabela de Materiais), insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima, 0,51 como limite e 16 como o comprimento da janela a ser usada para previsão, selecione ON para o filtro sobreposto e clique em Enviar sequência (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S10).

6. Previsão de epítopos de células Th da proteína Art v 1

  1. Para prever o epítopo da célula Th da proteína Art v 1, abra o site da ferramenta online IEDB Analysis Resource (Tabela de Materiais), clique em MHC II Binding e insira a sequência de aminoácidos da proteína Art v 1 mencionada acima. Escolha NetMHCllpan 4.1 EL (preditor de epítopos recomendado-2023.09) como método de previsão, Humano como espécie /locus, DRB1*01:01 como HLA-DR, alelo, 15 como comprimento, classifique os peptídeos por classificação percentual e clique em Enviar (Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S11).

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Resultados

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O software on-line Prot Param Tool da ExPASy foi utilizado para a caracterização físico-química e funcional da proteína10. O comprimento do quadro de leitura de texto aberto foi de 624 pb, codificando 132 aminoácidos, codificando proteínas com um total de 1.837 átomos e um peso molecular relativo de 13.404,26. A fórmula molecular é C584H903N157O181S12, dos quais os três principais aminoácidos são prolina (Pro, 15,9%), alanina (Ala, 12,1%), gli...

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Discussão

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A artemísia é um dos alérgenos externos mais importantes da China, e suas partículas de pólen são pequenas, com um diâmetro de 19-25 μm, que são facilmente dispersas pelo vento e produzem grandes quantidades de pó. Além disso, a gravidade dos sintomas alérgicos dos pacientes está correlacionada com o conteúdo de pólen no ar5. O Art v 1 é considerado o alérgeno de referência da alergia ao pólen da artemísia, e mais de 95% dos pacientes com alergia à artemísia são s...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Ningxia (2022AAC03601 e 2023AAC02087) e pela Fundação de Pesquisa da Universidade Médica de Ningxia (XM2019052).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ABCpredIndraprastha Institute of Information Technology, Índiahttps://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Software ProteanDNASTAR, Inc.Versão 7.1
Ferramenta Expasy ProtParamSIB Instituto Suíço de Bioinformáticahttps://web.expasy.org/protparam/
GeneBankNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB Analysis Resource InstitutoNacional de Alergia e Doenças Infecciosashttp://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 ServidorDTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model software onlineBIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM ServidorDTU Health TechVersão 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE LAB SALVAO Departamento de Energia Office of ScienceVersion 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

Referências

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