Artigo de método

Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida

DOI:

10.3791/66536

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19 de abril de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agentes fibrinogenolíticos que podem dissolver o fibrinogênio diretamente têm sido amplamente utilizados no tratamento anticoagulante. Geralmente, a identificação de novos agentes fibrinogenolíticos requer a separação de cada componente primeiro e, em seguida, a verificação de suas atividades fibrinogenolíticas. Atualmente, a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a cromatografia são usadas principalmente na etapa de separação. Enquanto isso, o ensaio em placa de fibrinogênio e produtos de reação baseados em PAGE são geralmente adotados para exibir suas atividades fibrinogenolíticas. No entanto, devido à separação espaço-temporal desses dois estágios, é impossível separar e exibir os agentes fibrinogenolíticos ativos com o mesmo gel. Para simplificar os processos de separação e exibição da identificação do agente fibrinogenolítico, construímos um novo método fibrinogênio-PAGE para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de vermes do amendoim (Sipunculus nudus) neste estudo. Este método inclui preparação de fibrinogênio-PAGE, eletroforese, renaturação, incubação, coloração e descoloração. A atividade fibrinogenolítica e o peso molecular da proteína podem ser detectados simultaneamente. De acordo com este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo de sem-fim de amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.

Introdução

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Nos últimos anos, devido ao aumento contínuo das doenças trombóticas, as doenças trombóticas tornaram-se um novo grande problema de saúde global1. Atualmente, os antitrombóticos são classificados em três grupos: antiagregantes plaquetários, anticoagulantes e trombolíticos. Entre eles, drogas trombolíticas, como uroquinase (Reino Unido), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), etc., são as únicas drogas clinicamente usadas que podem hidrolisar o trombo2. Enquanto isso, drogas trombolíticas mais seguras e eficazes estão sendo desenvolvidas pela identificação de novos agentes trombolíticos3.

No entanto, a identificação de novos agentes trombolíticos é demorada e trabalhosa, o que envolve principalmente as etapas de separação/purificação e caracterização/verificação. O primeiro é separar cada componente, e o último é mostrar suas atividades fibrino(geno)líticas 4,5. Em estudos anteriores, apesar do fato de termos isolado com sucesso uma nova enzima fibrino(geno)lítica (sFE) do verme do amendoim (Sipunculus nudus) por cromatografia de afinidade e ensaio de placa de fibrina (ogen) 6,7,8, esses processos são demorados e trabalhosos. Primeiro, é necessário determinar se os homogeneizados do verme do amendoim têm atividade fibrino(geno)lítica pelo método da placa de fibrina(ogênio) e produtos de reação com base na PÁGINA9. Em seguida, uma série de cromatografias, como cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de afinidade e outros métodos, devem ser realizadas para separação e purificação10,11. Posteriormente, o ensaio da placa de fibrina é realizado novamente para verificar a atividade fibrinogenolítica de cada componente separado. Finalmente, PAGE nativo e dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE são realizados para determinar o peso molecular dos agentes fibrinogenolíticos ativos12. Portanto, é fundamental separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos ativos.

Para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos ativos nos homogeneizados do verme do amendoim, um novo método de fibrinogênio-PAGE foi desenvolvido combinando os métodos de PAGE e placa de fibrinogênio, ou seja, os substratos dos agentes fibrinogenolíticos fibrinogênio foram adicionados ao gel nativo-PAGE. Após o PAGE nativo, os componentes foram separados por seu peso molecular. Enquanto isso, cada componente fibrinogenolítico ativo pode ser exibido por coloração. Por este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo do homogenato do verme do amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.

Protocolo

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1. Preparação do homogeneizado do sem-fim do amendoim

  1. Adicione 50 g de vermes de amendoim e 150 mL de solução salina no homogeneizador.
  2. Homogeneizar a 24000 rpm por 60 s.
    NOTA: Repita 3 vezes.
  3. Centrifugar o homogenato a 9710 x g durante 30 min a 4 °C.
  4. Colete o sobrenadante como homogeneizado do verme do amendoim para um estudo mais aprofundado.

2. Preparação do gel Fibrinogen-PAGE

  1. Pesar 0,01 g de fibrinogênio em um copo de vidro de 50 mL.
  2. Adicione 1,9 mL de DDH2O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) e 0,05 mL de SDS (10%, p / v) no béquer; misture bem pipetando.
  3. Colocar o copo a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Esta etapa é para dissolver o fibrinogênio.
  4. Adicione 1,7 mL de acrilamida (30%, p / v), 0,05 mL de persulfato de amônio (APS; 10%, p / v), 0,002 mL de TEMED; misture bem pipetando.
    NOTA: Este é o gel separador.
  5. Despeje o gel de separação em um molde de gel de 10 poços.
  6. Adicione 2 mL de DDH2O no molde de gel; Aguarde 30 min.
  7. Remova bem a água virando o molde de cabeça para baixo.
  8. Adicione 1,4 mL de DDH2O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10%, p / v), 0,33 mL de acrilamida (30%, p / v), 0,02 mL de APS (10%, p / v), 0,002 mL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) no béquer; misture bem pipetando.
    NOTA: Este é o gel de carregamento.
  9. Despeje o gel de carregamento no mesmo molde de gel da etapa 2.5; Insira o pente imediatamente.
    NOTA: O gel de fibrinogênio-PAGE usado aqui era composto pelo fibrinogênio (0,2%) contendo gel separador e gel de carga. A concentração de fibrinogênio pode ser ajustada conforme necessário.

3. Eletroforese

  1. Coloque o gel de fibrinogênio-PAGE preparado junto com o molde de cola no tanque de eletroforese; despeje 1300 mL de solução de eletroforese (1,963 g de Tris, 12,22 g de glicina, 0,65 g de SDS e 1300 mL de DDH2O) no tanque; Retire o pente.
  2. Adicionar 5 μL de tampão de carga não desnaturante 5x aos 20 μL de sFE e 20 μL de homogenato de sem-fim de amendoim; misture bem pipetando; carregue-os no gel de fibrinogênio-PAGE preparado.
    NOTA: Não ferva a mistura. A sFE é uma enzima fibrino(geno)lítica identificada anteriormente 6,7,8 e é utilizada como controle positivo neste estudo. O homogeneizado do sem-fim do amendoim é a amostra a ser detectada. Tampão de carregamento não desnaturante sem azul de bromofenol, β-mercaptoetanol e SDS em comparação com o tampão de carregamento SDS-PAGE. Cada pista de amostra é separada com o buffer de carregamento 1x SDS-PAGE para detectar claramente o movimento da proteína.
  3. Realize eletroforese a 80 V por 30 min ou 120 V por 20 min.
  4. Remova o gel de fibrinogênio-PAGE do molde de cola.

4. Renaturalização

  1. Transfira o gel de fibrinogênio-PAGE para uma caixa de plástico.
  2. Adicione 100 mL de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) e 2 mL de Triton X-100 na caixa. Coloque-o em uma coqueteleira a 60-70 rpm por 10 min.
  3. Remova o tampão de lavagem pipetando.
    NOTA: Repita três vezes.

5. Incubação

  1. Adicione 50 mL de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) na caixa de plástico.
  2. Incubar a 37 °C durante 4 h.
    NOTA: O tempo de incubação pode ser ajustado de acordo com a força da atividade fibrinogenolítica.

6. Coloração

  1. Remova o tampão de incubação por pipetagem.
  2. Adicione 50 mL de solução de coloração azul brilhante Coomassie na caixa e coloque a caixa em uma coqueteleira a 60-70 rpm por 30 min.

7. Descoloração

  1. Remova a solução de coloração pipetando.
  2. Adicione 50 mL de DDH2O na caixa.
  3. Coloque a caixa em um shaker a 60-70 rpm por 30 min.
    NOTA: DD H2O foi usado como solução de descoloração aqui. O tempo de agitação pode ser ajustado de acordo com a força da atividade fibrinogenolítica.

Resultados

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Após a eletroforese, todas as bandas do marcador foram claramente exibidas. As pistas de carregamento 1x SDS-PAGE mostraram apenas bandas de 10 kDa (azul de bromofenol). As amostras de sFE e verme do amendoim não apresentaram bandas observáveis (Figura 1). Embora as bandas das amostras não sejam visíveis, o desempenho do marcador e do azul de bromofenol indicou que a eletroforese foi bem-sucedida, e as amostras foram separadas de acordo com seu peso molecular.

Embora todo o gel tenha ficado azul devido à coloração, a descoloração tornou transparente a área onde o fibrinogênio foi degradado por agentes fibrinogenolíticos. Em comparação com o marcador, a sFE indicou uma banda fibrinogenolítica ativa próxima a 25 kDa. O homogeneizado do sem-fim do amendoim apresentou 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa e uma série de bandas maiores que 70 kDa (Figura 2). Os resultados indicaram que o sFE continha apenas um componente fibrinogenolítico de 25 kDa, mas o homogeneizado do verme do amendoim continha componentes sFE e outros agentes fibrinogenolíticos. A Figura 1 suplementar é um exemplo de uma imagem de gel mostrando o marcador em azul profundo e as amostras alvo como faixas brilhantes.

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Figura 1: Gel após eletroforese. M: Marcador; Pista 1: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 2: sFE; Pista 3: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 4: homogeneizado de sem-fim de amendoim; Pista 5: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Gel após a descoloração. M: Marcador; Pista 1: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 2: sFE; Pista 3: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 4: homogeneizado de sem-fim de amendoim; Pista 5: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Imagem de gel mostrando o marcador em azul profundo e as amostras alvo como faixas brilhantes. M: Marcador; Pista 1: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 2: sFE; Pista 3: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE; Pista 4: homogeneizado de sem-fim de amendoim; Pista 5: 1x buffer de carregamento SDS-PAGE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE é uma nova enzima fibrino(geno)lítica isolada de vermes de amendoim por nossa equipe anteriormente 3,6,8,13. No entanto, os processos de identificação da sFE foram demorados e trabalhosos, envolvendo as etapas de detecção da atividade fibrinogenolítica, separação dos componentes proteicos e confirmação da atividade. Como um método simples, o ensaio em placa de fibrinogênio é usado principalmente na etapa de triagem preliminar para verificar a atividade fibrinogenolítica das amostras. No entanto, o método de ensaio em placa de fibrinogênio não pode separar qual componente está ativo. Portanto, cromatografia e nativo/SDS-PAGE devem ser usados para separar seus componentes após a detecção de atividade. Em seguida, os produtos de reação são resolvidos novamente pelo SDS-PAGE para confirmar a degradação do substrato fibrinogênio. Neste trabalho, o substrato fibrinogênio foi adicionado ao gel PAGE para detectar o agente fibrinogenolítico. Após eletroforese, renaturação, incubação, coloração e descoloração, o peso molecular e a atividade fibrinogenolítica dos agentes fibrinogenolíticos ativos foram claramente exibidos com o mesmo gel. Por este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo do homogeneizado do verme do amendoim em 6 h.

Para obter os melhores resultados, mais atenção deve ser dada à preparação, renaturação e incubação do gel de fibrinogênio-PAGE. De um modo geral, quanto menor a concentração de fibrinogênio, mais incolor é a zona fibrinogenolítica, o que indica atividade fibrinogenolítica dos agentes. No entanto, quanto menor a concentração de fibrinogênio, mais incolor é o fundo e mais difícil é distinguir a zona fibrinogenolítica do fundo. O tempo de renaturalização afetará significativamente a atividade fibrinogenolítica dos componentes. Se esse tempo for muito curto para lavar o SDS no gel PAGE, a atividade fibrinogenolítica dos componentes será inibida pelo SDS remanescente. Da mesma forma, Se o tempo de incubação for muito curto, a reação fibrinogenolítica não é completa. Embora o tempo de incubação seja muito longo, o marcador usado para indicar o peso molecular será lavado. Neste estudo, embora essas condições tenham sido otimizadas, essas condições foram definidas para separar e exibir os agentes fibrinogenolíticos dos vermes do amendoim. Assim, condições personalizadas dessas etapas críticas devem ser definidas de acordo com agentes fibrinogenolíticos específicos.

É importante mencionar que este fibrinogênio-PAGE é adequado apenas para rastrear os agentes fibrinogenolíticos com atividade lítica de fibrinogênio, mas não para os agentes com atividade lítica de fibrinogênio ou atividade de ativação de plasminogênio. Se quisermos exibir essas atividades, o método pode ser otimizado substituindo o fibrinogênio por fibrina ou plasminogênio. Outro ponto que merece destaque é que os agentes fibrinogenolíticos ativos testados neste estudo eram monômeros, que não foram afetados na condição de eletroforese SDS. Portanto, se os agentes testados forem polímeros, este método deve ser ajustado para uma condição de PAGE nativa que não possa exibir o peso molecular. Portanto, o método fibrinogênio-PAGE apresentado aqui foi apenas uma versão básica geral, que pode ser otimizada para rastrear os outros agentes fibrinogenolíticos rapidamente.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da cidade de Xiamen (nº 3502Z20227197), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da província de Fujian (nº 2019J01070; Nº 2022J01311) e Projeto de Inovação e Empreendedorismo de Talentos de Alto Nível do Plano de Ciência e Tecnologia de Quanzhou (Nº 2022C015R). Agradecemos a Fucai Wang (Universidade de Huaqiao) e Lei Tong (Universidade de Huaqiao) por sua assistência técnica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1  M Tris-HCl (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)SolarbioT1010
30% Acrilamida/Bis-acrilamidaBiosharpBL513B
Persulfato de amônioXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
CopoPYREX2-9425-02
Tubo de Centrífuga (1,5 mL)BiosharpBS-15-M
Incubadora de Temperatura ConstanteJINGHONGJHS-400
Coomas Solução de coloração azul brilhanteBeyotimeP0017F
Balança Analítica EletrônicaDENVERTP-213
FibrinogenSolarbio F8051
Pontas de pipeta de carregamento de gel, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogeneizadorAHSATS-1500
Oscilador de rotação horizontalNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferênciaMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetrametiletilenodiaminaSigmaT9281
Ponta de pipeta (1 mL)Ponta de Pipeta AxygeneT-1000XT-C
(10 µ L)AxygeneT-10XT-C
(200 µ L)AxygeneT-200XT-C
Pipetador (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
Pipetador (10µ L)Thermo Fisher ScientificZX98775
Pipetador (200 µ L)Thermo Fisher ScientificZY20280
Pipetador (50 µ L)Thermo Fisher ScientificZY15331
Centrífuga RefrigeradacenceH1650R
Dodecil sulfato de sódioSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200
Ponta de Pipeta

Referências

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