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Identificação de biomarcadores para especificidade de gênero da doença de Alzheimer com base nos perfis de transcriptoma glial

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DOI:

10.3791/66552

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20 de maio de 2024

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1Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Shuangliu Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Automation, Tsinghua University, 4Affiliated Reproductive & Women-Children Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Central Hospital of Dalian University of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo analisou transcriptomas de núcleo único de trinta e três indivíduos com doença de Alzheimer (DA), revelando DEGs específicos do sexo em células gliais. A análise de enriquecimento funcional destacou as vias sinápticas, neurais e relacionadas a hormônios. Genes-chave, ou seja, NLGN4Y e seus reguladores, foram identificados, e potenciais candidatos terapêuticos para DA específica de gênero foram propostos.

Resumo

Muitos biomarcadores específicos do sexo foram recentemente revelados na doença de Alzheimer (DA); no entanto, células gliais cerebrais raramente foram relatadas. Este estudo analisou 220.095 transcriptomas de núcleo único do córtex frontal de trinta e três indivíduos com DA no banco de dados GEO. Genes diferencialmente expressos específicos do sexo (DEGs) foram identificados em células gliais, incluindo 243 em astrócitos, 1.154 em microglia e 572 em oligodendrócitos. As análises de anotação funcional da Gene Ontology (GO) e as análises de enriquecimento da via da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaram concentração funcional nas vias sinápticas, neurais e relacionadas a hormônios. A rede de interação proteína-proteína (PPI) identificou MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D e NLGN4Y em astrócitos, TREM2, FOS, APOE, APP e NLGN4Y na microglia e GRIN2A, ITPR2, GNAS e NLGN4Y em oligodendrócitos como genes-chave. NLGN4Y foi o único gene compartilhado pelas três glias e foi identificado como o biomarcador para a especificidade de gênero da DA. A rede correguladora do fator de transcrição gênica (TF)-miRNA identificou os principais reguladores para NLGN4Y e seus TCMs alvo. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) e Herba Ephedrae (Mahuang) foram identificados, e os efeitos dos ingredientes ativos na DA foram exibidos. Finalmente, a análise de enriquecimento de Kunbu e Mahuang sugeriu que eles podem atuar como candidatos terapêuticos para a especificidade de gênero da DA.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença global com alta incidência, sendo responsável por 60%-80% das demências1. Apesar de sua alta incidência, a patogênese mecanicista da DA não está claramente delineada e não houve terapêutica eficaz até o momento2. As principais patologias na DA foram identificadas como atrofia neuronal e acúmulo de detritos patológicos, principalmente a proteína Tau associada a microtúbulos e β-amilóide (Aβ)3,4. A patogênese da DA está associada a autofagia anormal, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, inflamação e distúrbio do metabolismo energético5. Inquéritos de prevalência comprovaram que dois terços dos pacientes com DA eram mulheres6. Existem diferenças específicas do sexo na DA na etiologia, manifestações clínicas, prevenção e tratamento. Assim, revelar o mecanismo biológico que causa diferenças específicas de sexo na DA e direcionar a medicina tradicional chinesa (MTC) pode potencialmente fornecer uma estrutura teórica mais abrangente para entender a patogênese da DA e orientar ainda mais a estratégia de tratamento precisa.

As células neurogliais, especialmente a microglia, os astrócitos e os oligodendrócitos, contribuem potencialmente para a patogênese da DA. Na DA, as microglias são ativadas e geneticamente alteradas, o que contribui para a resposta inflamatória, fagocitose e depuração de Aβ 7,8; o astrócito é geneticamente alterado, o que afeta a atividade sináptica, a homeostase iônica e o metabolismo energético e lipídico9; O oligodendrócito é geneticamente alterado com especificidade sexual, o que contribui para a perda neuronal, emaranhados neurofibrilares e lesões na substância branca10,11.

Neste estudo, empregamos o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) como técnica superior. Comparado ao sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), o snRNA-seq oferece vantagens em termos de riqueza de amostras, integridade do tipo de célula e confiabilidade dos dados12,13. O SnRNA-seq tem sido amplamente utilizado em estudos com foco na DA e explorando o papel das células gliais 14,15,16. Sua ampla adoção nessas áreas de pesquisa destaca sua eficácia em fornecer informações valiosas sobre as características transcricionais das células gliais na DA. Ao aproveitar as vantagens do snRNA-seq, os pesquisadores conseguiram descobrir informações cruciais sobre o envolvimento das células gliais na patologia da DA e identificar potenciais alvos terapêuticos. A fim de explorar as características transcricionais neurogliais específicas do sexo na DA e potenciais TCMs para a especificidade sexual da DA, este estudo analisou dados de snRNA-seq do córtex frontal de pacientes com DA do banco de dados público NCBI GEO. Genes diferencialmente expressos (DEGs) específicos do sexo, Ontologia Gênica (GO), Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), rede de interação proteína-proteína (PPI) e rede gene-TF-miRNA são analisados posteriormente para revelar biomarcadores chave e patogênese potencial. Finalmente, potenciais TCMs foram sugeridos e seus ingredientes ativos foram exibidos com tabelas pesquisando os bancos de dados Coremine Medical, TCMIP e TCMSP.

Protocolo

As etapas 2 a 9 da análise foram implementadas usando o software R (ver Figura Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 1), enquanto as etapas restantes foram executadas nas plataformas online. Os detalhes dos bancos de dados usados neste protocolo (juntamente com os links da web) são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Aquisição de dados

  1. Acesse o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) disponível publicamente no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia.
  2. Pesquise os dados GEO chamados Doença de Alzheimer na caixa de pesquisa.
  3. Selecione os principais organismos como Homo sapiens no lado direito.
    NOTA: Os resultados da pesquisa foram dados sobre a doença de Alzheimer em Homo sapiens.
  4. Depois de filtrar as informações pesquisadas, baixe os arquivos de dados GSE167490 e GSE183068 , que abrangem features.tsv, barcode.tsv e matrix.mtx para cada amostra de núcleo único individual. Os conjuntos de dados compreenderam 34 amostras de DA originárias do córtex frontal, com uma distribuição igual de 17 amostras masculinas e 17 amostras femininas (Tabela Suplementar 1).

2. Fusão de amostras

  1. Configure os caminhos de dados e os nomes de exemplo de acordo com o computador. Importe os 34 exemplos baixados e atribua nomes específicos de gênero aos exemplos usando os nomes de função.
  2. Gere objetos Seurat para todas as amostras de maneira processada em lote usando a lista de funções e Read10X, especificando os parâmetros como min.cells = 3 e min.features = 200.
  3. Use a função RenameCells para adicionar IDs de exemplo como prefixos aos códigos de barras da célula para preservar os códigos de barras da célula durante o processo de mesclagem. Isso garantiu que cada célula mantivesse sua identidade única e pudesse ser rastreada até sua fonte de amostra original após a fusão.

3. Controle de qualidade (QC)

  1. Empregue a função PercentageFeatureSet para calcular as proporções de genes mitocondriais, proporções de genes eritrocitários e proporções de genes de ribossomos para cada célula.
  2. Armazene essas proporções calculadas nos metadados usando o operador [[ ]] para anexar essas informações diretamente aos metadados de cada célula.
  3. Utilize a função de subconjunto para conduzir a filtragem da célula, especificando os parâmetros como nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 e percent. HB < 75.
  4. Exclua GSM5106107 da análise.

4. Verificação do efeito do lote

  1. Execute o processamento de dados.
    1. Normalize os dados usando a função NormalizeData .
    2. Identifique os 2000 principais recursos de variáveis no conjunto de dados usando a função FindVariableFeatures .
    3. Realize a análise de componentes principais (PCA)17 nos dados usando RunPCA, retendo 50 componentes principais.
    4. Gere uma plotagem de cotovelo usando a função ElbowPlot para determinar o número ideal de dimensões para análise subsequente. Considere as primeiras 50 dimensões.
    5. Dimensione os dados usando ScaleData para garantir que todos os recursos estejam em uma escala comparável.
    6. Identifique os vizinhos mais próximos usando FindNeighbors com base em 30 dimensões.
    7. Aplique o algoritmo UMAP usando RunUMAP para reduzir a dimensionalidade dos dados para 30 dimensões.
  2. Visualize os dados processados usando a função DimPlot com o parâmetro de redução definido como umap e o parâmetro group.by definido como orig.ident.
    NOTA: Esta etapa pode gerar um gráfico visualizando os dados no espaço UMAP reduzido, agrupados pelas identidades de célula originais. Ao examinar os gráficos do UMAP, tornou-se evidente que havia uma presença de efeito de lote. O agrupamento ou separação distinta de células com base em seu lote ou origem experimental sugeriu que os lotes experimentais influenciaram os perfis de expressão gênica.

5. Integração de dados

  1. Normalize e padronize os dados usando a função SCTransform .
  2. Aplique o algoritmode harmonia 18 para integrar os 33 dados de núcleo único restantes. Use o ensaio SCT para integração e defina o número máximo de iterações de harmonia para 20.
  3. Use a função FindClusters com um parâmetro de resolução definido como 0,07 para identificar clusters distintos nos dados.
  4. Empregue a função RunUMAP com um número especificado de dimensões (dims = 30) para reduzir ainda mais a dimensionalidade dos dados e visualizar os clusters em um espaço de dimensão inferior.

6. Anotação de tipo de célula

  1. Coletar os genes marcadores (Tabela Suplementar 2) das células por meio de uma extensa revisão da literatura existente.
  2. Após a identificação da heterogeneidade do cluster celular, classifique o tipo de cada célula do cluster pelos genes marcadores expressos especificamente.
  3. Apresentar vários tipos celulares com visualização UMAP usando o pacote ggplot2, onde oligodendrócito foi destacado com o código de cores #DB7093, neurônio excitatório com #FF69B4, astrócitos com #1874CD, micróglia com #63B8FF, célula precursora de oligodendrócitos com #DB7093, neurônio inibitório com #FFC0CB e célula endotelial com #FF69B4.
  4. Calcule as proporções de cada tipo de célula estratificadas por gênero.

7. Extração de dados de células gliais

  1. Extraia dados de astrócitos dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.
  2. Extraia dados de microglia dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.
  3. Extraia dados de oligodendrócitos dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.

8. Captura de genes diferencialmente expressos (DEGs) específicos do sexo glial

  1. Identifique DEGs específicos do sexo de astrócitos usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 30. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
    1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença em porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor PaleVioletRed, os genes regulados negativamente com Pink e os genes estáveis com DodgerBlue3.
  2. Identifique DEGs específicos do sexo da microglia usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 1. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
    1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença de porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor OrangeRed, os genes regulados negativamente com LightSalmon e os genes estáveis com SteelBlue1.
  3. Identifique DEGs específicos do sexo de oligodendrócitos usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 10. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
    1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença em porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor DeepPink, os genes regulados negativamente com HotPink e os genes estáveis com DeepSkyBlue3.

9. Análises de enriquecimento funcional de DEGs específicos do sexo

  1. Realize a análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) em DEGs específicos do sexo para cada tipo de célula glial usando a função enrichGO . Defina os seguintes parâmetros: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.
  2. Converta os símbolos de genes em IDs de genes correspondentes usando a função bitr. Realize a análise de enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) em DEGs específicos do sexo para cada tipo de célula glial usando a função enrichKEGG . Ajuste as configurações da seguinte maneira: organismo = tem, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.

10. Estatísticas de frequência de DEGs gliais nas vias go e kegg, diagramas de Venn de cada DEG glial específico do sexo e construção de rede PPI

  1. Calcule a frequência de DEGs específicos do sexo glial nas vias GO e KEGG usando um histograma de frequência.
  2. Acesse o banco de dados STRING para construir as redes PPI.
  3. Escolha as proteínas múltiplas. Procure a Lista de Nomes na caixa de pesquisa. Defina "Organismos" como Homo sapiens.
  4. Revise a lista de proteínas obtidas na pesquisa. Clique em Continuar para prosseguir.
  5. Exporte as redes PPI selecionando a opção de download , de preferência no formato PNG com maior resolução.
  6. Visualize a distribuição de co-expressão para os principais genes específicos do sexo usando os diagramas de Venn.
  7. Identifique o(s) gene(s) compartilhado(s) como gene(s) chave(s) no estudo com base na análise do diagrama de Venn.

11. Construção de rede regulatória multifatorial

  1. Acesse o NetworkAnalyst.
  2. Clique em Entrada da lista de genes e especifique o organismo como H. sapiens (humano). Defina o tipo de ID como símbolo genético oficial. Digite o nome do gene no campo de pesquisa e clique em Carregar e continuar.
  3. Selecione Interações gene-miRNA e escolha miRTarBase v8.0. Confirme a seleção clicando em OK.
  4. Prossiga para Interações do gene TF e selecione o banco de dados ENCODE . Clique em OK para confirmar a seleção.
  5. Em seguida, navegue até a Rede Co-Reguladora TF-miRNA e clique em OK para prosseguir.
  6. Por fim, escolha Proceed para gerar a rede regulatória multifatorial incorporando interações gene-miRNA e interações TF-gene.

12. Análise de MTC de genes e alvos

  1. Acesse o banco de dados on-line da Coremine Medical.
  2. Digite o nome do gene específico e selecione o gene correspondente com o sufixo gene/proteína, humano na caixa de pesquisa na seção Explorar .
  3. Navegue na seção Medicamentos e identifique os TCMs associados aos medicamentos pesquisados.
    NOTA: Os medicamentos estatisticamente significativos foram marcados em azul.
  4. Determine os cinco principais TCMs com base em seu valor de "significância" como TCMs terapêuticos.

13. Resumo da pesquisa dos ingredientes da MTC no direcionamento do gene-chave

  1. Acesse a Plataforma de Pesquisa Integrativa Baseada em Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMIP) e a Plataforma de Análise e Banco de Dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Digite os nomes das ervas na barra de pesquisa para recuperar seus ingredientes correspondentes.
  2. Recupere os ingredientes no banco de dados PubMed com um limite de tempo até 10 de abrilde 2023. Os termos de busca utilizados incluíram o Nome da Molécula no TCMSP e Componentes Químicos no TCMIP como termos de busca, e foram limitados a artigos publicados em inglês.
  3. Resuma e analise as ervas e seus ingredientes correspondentes que atuam na DA.

14. Confirmação da função de tratamento das MTCs direcionadas na especificidade sexual da DA

  1. Importe ervas para o TCMIP e navegue até a página de descrição correspondente.
  2. Utilize a função Exportar dados e selecione o formato CSV para baixar os termos de enriquecimento de GO - Processo Biológico, GO - Componente Celular, GO - Função Molecular e Caminho do Retomoma.
  3. Visualize os termos de enriquecimento baixados para cada erva usando gráficos de barras.

Resultados

Análise de SnRNA-seq de perfis de transcriptoma glial frontal e anotação de tipos de células
No total, foram obtidos 220.095 núcleos e 32.077 genes no córtex frontal de 17 DA masculinas e 17 femininas (Figura 1A). O gráfico UMAP visualizou o total de transcriptomas frontais de núcleos únicos exibindo tipos distintos de núcleos após a análise de redução de dimensão (Figura 1B). Foram mostrados números totais de núcleos anotados capturados por gênero, o que fez a soma de 58.902 astrócitos, 14.265 micróglias, 77.466 oligodendrócitos, 3.520 endoteliais, 25.252 neurônios excitatórios, 31.268 neurônios inibitórios e 9.422 células progenitoras de oligodendrócitos (Figura 1C). As expressões médias dos marcadores de tipo de célula conhecidos para cada glia foram projetadas nos gráficos UMAP para identificar as populações de células (Figura 1D).

Os DEGs específicos do sexo em astrócitos
Foram analisados 58.902 núcleos astrocíticos (Figura 2A), sendo 27.504 de DA masculina (46,69%) e 31.398 de DA feminina (53,31%). Os DEGs específicos do sexo revelaram regulação positiva de 138 genes, incluindo DST, CACNA2D3 e AC016831.7, regulação negativa de 105 genes, incluindo CNTN5, RORA, RASSF8 e CADM2, e 4995 genes inalterados (Figura 2B). Além disso, as análises GO e KEGG identificaram que esses DEGs se concentraram principalmente nas vias dos neurônios, sinapses e hormônios, com vias neuronais, incluindo regulação do desenvolvimento do projeto neuronal, coluna vertebral dos neurônios, etc., vias sinápticas, incluindo organização sináptica e sinapse glutamatérgica / colinérgica, e vias hormonais, incluindo síntese de hormônio tireoidiano e secreção de insulina (Figura 2C, D). Trinta genes com frequência máxima foram obtidos (Figura 2E), com PLCB1 em primeiro lugar. As redes PPI foram construídas para explorar a relação entre esses genes (Figura 2F) e identificaram DLG2, CAMK2D, CALM2 e PRKACB como genes centrais. Os gráficos UMAP exibiram diferenças de DEGs selecionados: KCND2, CAMK2D, MT3, LINC00278 e XIST foram maiores na DA feminina e menores na DA masculina, enquanto NLGN4Y, DLG2, PRKACB, CALM2, UTY e TTTY14 foram opostos (Figura 2G). MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PRKACB, CAMK2D e NLGN4Y foram finalmente determinados como DEGs específicos do sexo de astrócitos, conforme mostrado na Tabela 1.

Os DEGs específicos do sexo na microglia
14.265 núcleos microgliais (Figura 3A) foram analisados, sendo 5.327 (37,34%) da DA masculina e 8.938 (62,66%) da DA feminina. Os DEGs específicos do sexo revelaram regulação positiva de 224 genes, incluindo KCNIP4 e LRRTM4, e regulação negativa de 930 genes, incluindo APOE, MT-CO3 e FTL, e 13.111 genes inalterados (Figura 3B). Além disso, as análises GO e KEGG identificaram que esses DEGs se concentraram principalmente nas vias dos neurônios, fagossomo, hormônios e outros, com vias neuronais, incluindo sinapse neurônio a neurônio, vias fagocíticas, incluindo fagossomo e regulação da fagocitose, vias hormonais, incluindo via de sinalização de estrogênio, via de sinalização de ocitocina, etc., e outras, incluindo regulação da resposta inflamatória, aprendizado ou memória, depuração de beta-amilóide, etc. (Figura 3C, D). Trinta genes com frequência máxima foram obtidos, com TLR2 e TREM2 empatados em segundo lugar (Figura 3E). Redes PPI foram construídas para explorar a relação entre esses genes (Figura 3F) e identificaram ACTB, APP e FYN como genes centrais. Os gráficos UMAP exibiram diferenças dos DEGs selecionados: APP, FOS, XIST e CTSD foram maiores na DA feminina e menores na DA masculina, enquanto NLGN4Y, TREM2, LINC0028, APOE, UTY e TTTY14 foram opostos (Figura 3G). TREM2, FOS, APOE, APP e NLGN4Y foram finalmente determinados como DEGs específicos do sexo da microglia, conforme mostrado na Tabela 2.

Os DEGs específicos do sexo em oligodendrócitos
Foram analisados 77.466 núcleos oligodendrocíticos (Figura 4A), sendo 42.469 de DA masculina (54,82%) e 34.997 de DA feminina (45,18%). Os DEGs específicos do sexo revelaram regulação positiva de 384 genes, incluindo PCDH9, MT-CO1, NEAT1 e NPAS3, regulação negativa de 188 genes, incluindo FRMD4A, PLP1 e LSAMP, e os 76.894 genes restantes inalterados (Figura 4B). Além disso, as análises GO e KEGG identificaram que esses DEGs se concentraram principalmente nas vias de neurônios, sinapses e hormônios, com vias neuronais, incluindo coluna vertebral, vias sinápticas, incluindo sinapse neurônio a neurônio e sinapse glutamatérgica / dopaminérgica, e vias hormonais, incluindo via de sinalização de neurotrofina, síntese e secreção de aldosterona, via de sinalização de cálcio, etc. (Figura 4C, D). Trinta genes com frequência máxima foram obtidos (Figura 4E), com GRIN2A e PSEN1 empatados em segundo lugar. As redes PPI foram construídas para explorar a relação entre esses genes (Figura 4F) e identificaram GRIN2A e GRIA2 como genes centrais. Os gráficos UMAP exibiram diferenças nos DEGs selecionados: GRIN2A, ITPR2, GNAS e XIST foram maiores na DA feminina e menores na DA masculina, enquanto NLGN4Y, UTY e TTTY14 foram opostos (Figura 4G). GRIN2A, ITPR2, GNAS e NLGN4Y foram finalmente determinados como DEGs específicos do sexo de oligodendrócitos, conforme mostrado na Tabela 3.

Interação entre genes-chave e os 30 principais genes das células gliais e NLGN4Y como o gene comum compartilhado
Os diagramas de Venn e as redes PPI forneceram uma visão geral da estreita interação entre os genes-chave (Figura 5A, B) e os 30 principais genes (Figura 5C, D) de cada célula glial. Os resultados mostraram que ACYB, APP, JUN, PRKACB e DLG2 estavam no centro da rede PPI, e NLGN4Y era um gene comum compartilhado para DEGs específicos do sexo em todas as células gliais.

Construção da rede gene-TF-miRNA
A rede NLGN4Y-TF-miRNA continha 13 nós e 12 arestas (Figura 6A). NLGN4Y foi regulado por 1 TF, ou seja, CTCF, e 11 miRNAs, incluindo has-miR-185, has-miR-137 e has-miR-9.

Exibindo o medicamento alvo e TCMs de NLGN4Y com rede
Um total de 1 droga-alvo NLGN4Y e 64 TCMs alvo indireto foram recuperados na Coremine Medical. As MTCs com significância estatística nos resultados foram marcadas com azul. Foram visualizados o medicamento Antitrombina III e cinco MTCs com a rede, a saber, Heikunbu, Wulingzhi, Xiazhicao, Shuizhi e Mahuang, que foram considerados estatisticamente significativos (Figura 6B).

Efeitos dos MTC alvo e dos ingredientes ativos correspondentes na DA
Para Kunbu, foram recuperados 10 ingredientes em TCMIP e 48 ingredientes em TCMSP. Por meio de busca no banco de dados PubMed, foram recuperados 5 ingredientes relacionados à DA: fucosterol, saringosterol, tiamina, ácido estearidônico e florofucofuroeckol-A, dos quais a biodisponibilidade oral (OB) dos dois primeiros foi de ≥30% e semelhante ao sexo da droga (DL) foi de ≥0,18. Os detalhes são exibidos na Tabela 4. Quanto a Mahuang, 28 ingredientes em TCMIP e 363 ingredientes em TCMSP foram recuperados. Com o mesmo método do Kunbu, foram recuperados 25 ingredientes relacionados à DA. Entre eles, 6 ingredientes com OB ≥30% e DL ≥0,18: quercetina, eriodictyol, naringenina, taxifolina, estigmasterol e luteolina, estão listados no topo da Tabela 5.

Rede Hurb-gene-doença e análise de enriquecimento
A rede Hurb-gene-doença é mostrada na Figura 6C. O gene-alvo compartilhado de Kunbu e Mahuang era ACHE, cujas doenças associadas eram DA e déficits cognitivos. Os genes-alvo de Kunbu sozinhos foram ALKBH3 e ELOVL4, doenças relacionadas ao envelhecimento e atrofia cerebral, respectivamente.

Os resultados dos enriquecimentos de GO (P, MF e CC) para Kunbu (Figura 7A, Figura 8A, Figura 9A) e Mahuang (Figura 7B, Figura 8B, Figura 9B) são exibidos com gráficos de barras. As vias do reatoma para Kunbu (Figura 10A) e Mahuang (Figura 10B) também são mostradas. Os termos enriquecidos marcados com setas estavam relacionados ao eixo "hormônio-sinapse-neurônio", como atividade do receptor de hormônio esteróide, projeção de neurônios e via de sinalização mediada por hormônio esteróide em Kunbu e transmissão sináptica química, expressão gênica dependente de estrogênio e processo do sistema nervoso em Mahuang.

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Figura 1: Aquisição de dados de expressão gênica, perfil de RNA-seq de núcleo único e caracterização do tipo de célula. (A) Amostras obtidas de GEO DataSets para preparação de análise. (B) Gráfico UMAP bidimensional da soma dos núcleos (N = 116.101 para homens; N = 103.994 para o sexo feminino). (C) Proporções para cada tipo de célula divididas por gênero. (D) Expressão média de 5 marcadores de tipo de célula bem estabelecidos projetados no gráfico UMAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Os astrócitos são heterogêneos e apresentam alterações transcriptômicas específicas do sexo na doença de Alzheimer. (A) Gráfico UMAP de núcleos astrocíticos (N = 59.010). (B) DEGs específicos do sexo. (C, D) Os gráficos circulares ilustraram os termos significativamente enriquecidos funcionalmente de DEGs astrocíticos obtidos dos bancos de dados GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Os 30 DEGs sexuais de astrócitos mais frequentes nas vias GO e KEGG. (F) Rede PPI dos 30 DEGs sexuais de astrócitos mais frequentes nas vias GO e KEGG. (G) Expressão média de DEGs específicos do sexo notáveis projetados nos gráficos UMAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: As microglias são heterogêneas e apresentam alterações transcriptômicas específicas do sexo na doença de Alzheimer. (A) Gráfico UMAP de núcleos microgliais (N = 14.265). (B) DEGs específicos do sexo. (C, D) Os gráficos circulares ilustraram os termos significativamente enriquecidos funcionalmente dos DEGs microgliais obtidos dos bancos de dados GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Os 30 DEGs microglia-sexo mais frequentes nas vias GO e KEGG. (F) Rede PPI dos 30 DEGs de sexo da microglia mais frequentes nas vias GO e KEGG. (G) Expressão média de DEGs específicos do sexo notáveis projetados nos gráficos UMAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Os oligodendrócitos são heterogêneos e apresentam alterações transcriptômicas específicas do sexo na doença de Alzheimer. (A) Gráfico UMAP de núcleos oligodendrocíticos (N = 77.466). (B) DEGs específicos do sexo. (C, D) Os gráficos circulares ilustraram os termos significativamente enriquecidos funcionalmente de DEGs oligodendrocíticos obtidos dos bancos de dados GO e KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Os 30 DEGs sexuais de oligodendrócitos mais frequentes nas vias GO e KEGG. (F) Rede PPI dos 30 DEGs sexuais de oligodendrócitos mais frequentes nas vias GO e KEGG. (G) Expressão média de DEGs específicos do sexo notáveis projetados nos gráficos UMAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Sobreposições de DEGs e redes PPI de DEGs de frequência superior. (A, B) Diagrama de Venn ilustrando os genes-chave para cada glia e a rede PPI correspondente. (C, D) Diagrama de Venn ilustrando os 30 principais DEGs específicos do sexo frequentes para cada glia enriquecida nas vias GO e KEGG e a rede PPI correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Diagrama de rede com NLGN4Y e seus TCMs de direcionamento como núcleo. (A) Rede correguladora Gene-TF-miRNA. (B) Rede gene-droga-MTC para NLGN4Y. (C) Rede de doenças do gene da MTC de Kunbu e Mahuang. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Análise de enriquecimento GO (BP) para Kunbu e Mahuang. (A) Os 20 principais processos biológicos enriquecidos de Kunbu. (B) Os 20 principais processos biológicos enriquecidos de Mahuang. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Análise de enriquecimento GO (MF) para Kunbu e Mahuang. (A) As 20 principais funções moleculares enriquecidas de Kunbu. (B) As 20 principais funções moleculares enriquecidas de Mahuang. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Análise de enriquecimento GO (CC) para Kunbu e Mahuang. (A) Os 20 principais componentes celulares enriquecidos de Kunbu. (B) Os 20 principais componentes celulares enriquecidos de Mahuang. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Vias de retoma para Kunbu e Mahuang. (A) Vias de retoma de Kunbu. (B) Vias de reatoma de Mahuang. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Genes-chave dos DEGs específicos do sexo em astrócitos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Genes-chave dos DEGs específicos do sexo na microglia. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Genes-chave dos DEGs específicos do sexo em oligodendrócitos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Ingredientes ativos Kunbu' em AD. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Ingredientes ativos de Mahuang no AD. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura 1 suplementar: captura de tela para o uso do software R. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Informações da amostra. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Genes marcadores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: O R CODE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A especificidade de gênero foi identificada na epidemiologia, patologia e manifestação clínica da DA19. Aqui, confirmamos o potencial mecanismo patológico do "eixo hormônio-sinapse-neurônio" a partir de genes gliais específicos de gênero e vias relacionadas em pacientes com DA. NLGN4Y foi o único gene compartilhado nas três glias e foi escolhido como o biomarcador para a especificidade de gênero da DA. TF e miRNAs que regulam NLGN4Y estavam fortemente ligados a diferenças de gênero e ao desenvolvimento do sistema nervoso. Além disso, os TCMs alvo Kunbu e Mahuang foram considerados potencialmente afetados pelo eixo "hormônio-sinapse-neurônio" e foram identificados como candidatos terapêuticos para DA pela regulação da especificidade de gênero.

O algoritmo Harmony forneceu vantagens distintas sobre outros algoritmos de integração, integrando dados em células raras, otimizando o uso de memória e velocidade computacional para grandes amostras e acomodando projetos experimentais complexos com diversas fontes celulares e plataformas de tecnologia18. As seções de controle de qualidade e integração de dados foram componentes críticos para aumentar a precisão e a confiabilidade da análise, permitindo que os pesquisadores obtivessem insights mais profundos sobre a biologia da DA e outras doenças neurodegenerativas. A execução meticulosa dessas etapas é fundamental para alcançar a qualidade geral e a validade dos resultados derivados de experimentos de sequenciamento de RNA de núcleo único.

Uma das modificações feitas nesse protocolo foi o uso da função SCTransform para normalizar e padronizar os dados20. Essa etapa garantiu que os dados fossem comparáveis e padronizados para análise posterior. Para mitigar o efeito de lote, foi realizada uma etapa adicional de integração de dados, que ajudou a corrigir o efeito de lote e melhorar a precisão dos resultados. A solução de problemas foi realizada quando uma das amostras (GSM5106107) apresentou desempenho incomum em comparação com as outras amostras e foi excluída da análise.

Uma limitação deste estudo foi o tamanho relativamente pequeno da amostra empregada, o que pode restringir a representatividade dos achados para a população em geral. Além disso, a utilização de dados de vários laboratórios e grupos de pesquisa introduziu heterogeneidade inerente, potencialmente limitando a reprodutibilidade e generalização dos resultados. Embora a identificação dos principais fatores regulatórios para NLGN4Y tenha sido alcançada por meio de uma rede correguladora gene-TF-miRNA, uma verificação experimental adicional foi necessária para determinar os papéis funcionais e os mecanismos subjacentes atribuídos a esses fatores regulatórios. Embora a análise de enriquecimento tenha sugerido Mahuang e Kunbu como potenciais candidatos ao tratamento da DA específica por gênero, confiar apenas nas previsões de bioinformática foi insuficiente para estabelecer sua eficácia e segurança. Experimentos adicionais e estudos clínicos foram imperativos para validar os efeitos terapêuticos dessas drogas promissoras.

A abordagem delineada neste estudo exibiu um potencial considerável para diversos domínios de pesquisa, principalmente no discernimento de DEGs específicos do sexo dentro das células gliais na DA. Tais investigações são promissoras para elucidar as disparidades patogênicas diferenciadas entre indivíduos masculinos e femininos, consequentemente facilitando a formulação de intervenções terapêuticas específicas para o sexo. Além disso, a aplicabilidade do método se estendeu a outras condições neurodegenerativas, oferecendo oportunidades para identificar DEGs específicos do sexo e aumentar a compreensão dos mecanismos subjacentes das doenças.

Em conclusão, o estudo apresentou um protocolo abrangente e robusto para analisar dados de sequenciamento de RNA de núcleo único de pacientes com DA, potencialmente abrindo caminho para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas personalizadas. Além disso, a metodologia empregada neste estudo pode ser estendida a outras condições neurodegenerativas, oferecendo oportunidades para descobrir padrões de expressão gênica específicos do sexo e aprofundar a compreensão dessas doenças complexas.

Divulgações

Não há conflito de interesse neste manuscrito, e todos os autores aprovaram a submissão para publicação.

Agradecimentos

Os autores são gratos a Jessica S Sadick, Michael R O'Dea, Philip Hasel, etc., por fornecer o GSE167490 conjunto de dados. Os autores apreciam que Faten A Sayed, Lay Kodama, Li Fan, etc., ofereçam o GSE183068 conjunto de dados. Os autores agradecem a Shuqing Liu pela ajuda na análise de dados e a Wen Yang por fornecer a plataforma de análise de dados. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82174511), Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, Apricot Grove Scholars, Programa de Aprimoramento de Pesquisa de Talentos de Disciplina (QJJJ2022001), Programa de Talentos de Revitalização de LiaoNing (XLYC 1807083), Fundo de Medicina Chinesa e Ervas do Departamento de Administração de Sichuan (2023MS578), Projeto Nacional de Inovação e Treinamento em Empreendedorismo de Graduação (202310633003X) e Tópicos inovadores da prática de pesquisa científica para estudantes universitários na Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (ky-2023100). Hanjie Liu e Hui Yang contribuíram para a concepção do estudo, coleta, interpretação dos dados, redação e revisão do manuscrito. Shuqing Liu e Siyu Li participaram da concepção do estudo, coleta de dados e redação do manuscrito. Wen Yang e Anwar Ayesha foram responsáveis pela coleta e interpretação dos dados. Xin Tan preparou figuras e/ou tabelas. Cen Jiang, Yi Liu e Lushuang Xie conceberam o estudo e revisaram/editaram o manuscrito. Todos os autores contribuíram com o artigo e aprovaram a versão submetida.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Database
Coremine Medical DatabaseDesenvolvido em conjunto pela Noruega, a Academia Chinesa de Ciências, a Academia Chinesa de Ciências Médicas, a Biblioteca Médica Nacional dos Estados Unidos e outras instituiçõesQuando você explora conceitos no CoreMine Medical, você acessa um banco de dados estruturado para relacionar conceitos importantes, classificados por relevância estatística, ao seu tópico. Por exemplo, se você digitar "doença de Alzheimer", além de recuperar documentos e recursos que discutem a doença, poderá visualizar redes e listas que mostram como seu conceito de consulta está relacionado a outros conceitos biomédicos. Isso fornece uma visão geral dos conceitos relacionados à sua pesquisa, além de ser uma interface para navegar pelas informações sobre esses conceitos.
Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)National Center for Biotechnology Information nos Estados Unidos (NCBI)O GEO é um repositório público de dados de genômica funcional que suporta envios de dados compatíveis com MIAME. Dados baseados em matriz e sequência são aceitos. São fornecidas ferramentas para ajudar os usuários a consultar e baixar experimentos e perfis de expressão gênica selecionados.
Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Plataforma de Pesquisa Integrativa Baseada em Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMIP, versão: 2.0)NenhumIntrodução à Plataforma Integrada de Pesquisa Computacional em Rede Baseada em Farmacologia para Medicina Tradicional Chinesa [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) É uma mineração de dados inteligente plataforma baseada na base de dados online da Enciclopédia de Medicina Tradicional Chinesa (ETCM), que integra serviços de gestão de big data médico e computação farmacológica. Tem como objetivo revelar a conotação científica da teoria da medicina tradicional chinesa e o valor científico do pensamento original na medicina tradicional chinesa, resumir e transmitir a experiência de médicos famosos, controlar a qualidade da medicina tradicional chinesa, explicar os princípios da ação da medicina tradicional chinesa, pesquisa e desenvolvimento da nova medicina chinesa, especialmente a descoberta e otimização de combinações modernas de medicamentos, Forneça uma base sólida de dados e ferramentas analíticas. Com base no TCMIP v1.0, uma atualização abrangente é implementada, incluindo cinco bancos de dados principais e sete módulos funcionais. Por meio da integração do sistema e da integração do módulo, uma análise abrangente da correlação multinível da rede de interação "prescrição da síndrome da doença" pode ser alcançada rapidamente. Como uma plataforma inteligente de mineração de dados, o TCMIP v2.0 fornecerá uma forte base de dados e plataforma de análise para revelar a conotação científica da teoria da medicina tradicional chinesa e o valor científico do pensamento original na medicina tradicional chinesa, resumindo e herdando a experiência de médicos famosos, controle de qualidade da medicina tradicional chinesa, elucidando os princípios da ação da medicina tradicional chinesa, pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos da medicina tradicional chinesa, especialmente descoberta e otimização de combinações modernas de medicamentos.
Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP 
NetworkAnalystNenhumNetworkanalyze é uma plataforma de análise de visualização online para análise de expressão gênica e meta-análise. Ele pode realizar análises comparativas, quantitativas, diferenciais e de enriquecimento da expressão gênica, análise de interação proteína-proteína, análise de integração de vários conjuntos de dados e também pode desenhar imagens de alto valor, como PCA, diagrama de rede de interação proteína-proteína, mapa de calor, diagrama de vulcão, diagrama de Wayne, etc.
Weblink: banco de
dados https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ PubMedNational Center for Biotechnology Information nos Estados Unidos (NCBI)O banco de dados Pubmed é um banco de dados de literatura biomédica mantido pela National Library of Medicine (NLM) nos Estados Unidos, com o objetivo de fornecer os resultados mais recentes de pesquisas médicas para cientistas, médicos, pesquisadores e estudantes em todo o mundo. Este banco de dados coleta literatura biomédica de todo o mundo, incluindo artigos de periódicos, artigos, livros, etc. Até o momento, a base de dados Pubmed coletou mais de 30 milhões de artigos e é continuamente atualizada a cada semana.
Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R softwareRoss Ihaka e Robert GentlemanR é uma linguagem e ambiente para computação estatística e gráficos. É um projeto GNU que é semelhante à linguagem e ambiente S que foi desenvolvido na Bell Laboratories (anteriormente AT& T, agora Lucent Technologies) por John Chambers e colegas. R pode ser considerado como uma implementação diferente de S. Existem
algumas diferenças importantes, mas muito do código escrito para S é executado inalterado em R.
Weblink: https://www.r-project.org/
Plataforma de Análise e Banco de Dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP)Zhejiang Jiuwei Health Co., LtdTCMSP não é apenas um repositório de dados, mas também uma plataforma de análise para os usuários estudarem de forma abrangente as Medicinas Tradicionais Chinesas (MTC): incluindo a identificação de componentes ativos, triagem de alvos de medicamentos e geração de redes compostos-alvos-doenças, bem como as informações farmacocinéticas detalhadas de medicamentos envolvendo semelhança com medicamentos (DL), biodisponibilidade oral (OB), barreira hematoencefálica (BBB), permeabilidade epitelial intestinal (Caco-2), ALogP, área de superfície negativa fracionária (FASA-) e número de   Ligação H  doador/aceitador   (Hdon/HACC). Até agora, o TCMSP atraiu ampla atenção e vários grupos publicaram mais de 10 artigos usando nosso banco de dados TCMSP em cerca de um ano.
Weblink: https://tcmsp-e.com

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