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Artigo de método

Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas

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DOI:

10.3791/66564

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23 de fevereiro de 2024

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico celular para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos.

Resumo

As proteínas são fundamentais para a fisiologia humana, sendo seus alvos cruciais na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos. A identificação e validação de alvos proteicos cruciais tornaram-se parte integrante do desenvolvimento de medicamentos. O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para investigar a ligação proteína-ligante, especialmente no contexto de interações entre drogas e proteínas-alvo. Para a verificação experimental da ligação e para acessar a ligação do medicamento e seu alvo diretamente, é utilizado o método de ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA). Este estudo teve como objetivo integrar o docking molecular com o CETSA para prever e validar interações entre drogas e alvos de proteínas vitais. Especificamente, previmos a interação entre xanthatina e a proteína Keap1, bem como seu modo de ligação por meio de análise de docking molecular, seguida de verificação da interação usando o ensaio CETSA. Nossos resultados demonstraram que a xanthatina pode estabelecer ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos específicos da proteína Keap1 e reduzir a termoestabilidade da proteína Keap1, indicando que a xanthatina pode interagir diretamente com a proteína Keap1.

Introdução

As proteínas são macromoléculas altamente importantes nos organismos vivos e possuem uma gama diversificada de funções únicas dentro das células, como composição da membrana, formação do citoesqueleto, atividade enzimática, transporte, sinalização celular e envolvimento em mecanismos intracelulares e extracelulares 1,2,3. As proteínas manifestam suas funções biológicas principalmente por meio de interações específicas com uma variedade de moléculas, incluindo outras proteínas, ácidos nucléicos, ligantes de moléculas pequenas e íons metálicos 1,4. Os ligantes são pequenos compostos moleculares que se ligam especificamente às proteínas de um organismo. A interação entre proteínas e ligantes ocorre em locais específicos da proteína, chamados de locais de ligação, também conhecidos como bolsas de ligação5. Na pesquisa em química medicinal, o foco está na identificação de proteínas-chave que estão claramente associadas a doenças, que servem como alvos para drogas6. Portanto, obter uma compreensão profunda dos locais de ligação entre proteínas e ligantes é de extrema importância na promoção da descoberta, design e pesquisa de medicamentos 7,8.

O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para estudar a ligação proteína-ligante, que emprega as estruturas tridimensionais de proteínas e ligantes para explorar seus modos de ligação primários e afinidades ao formar complexos estáveis 9,10,11. A aplicação da tecnologia de docking molecular originou-se na década de 1970. Com base no princípio de emparelhamento de fechadura e chave e utilizando os algoritmos do software de acoplamento molecular, pode-se determinar a interação entre compostos e alvos moleculares analisando os resultados do encaixe. Essa abordagem permite a previsão de locais de ligação ativos para o composto e a molécula alvo. Consequentemente, facilita a identificação de uma conformação de ligação ideal (aqui chamada de modelo de ligação) para interações ligante-receptor, o que é crucial para a compreensão da mecânica desses engajamentos moleculares 12,13,14,15. Embora o docking molecular forneça previsões valiosas baseadas em computador das interações ligante-receptor, é importante observar que essas são descobertas preliminares. Consequentemente, uma verificação experimental adicional é essencial para confirmar essas interações.

O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), inicialmente proposto pela equipe de pesquisa de Pär Nordlund em 2013, serve como um método para validar as interações entre drogas e proteínas-alvo. Esta técnica testa especificamente a estabilidade térmica das proteínas-alvo induzidas pela ligação de drogas, fornecendo uma abordagem prática para confirmar interações moleculares 16,17,18. Essa abordagem é baseada no princípio fundamental de que a ligação ao ligante inicia uma mudança térmica dentro das proteínas-alvo e é aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas, incluindo lisados celulares, células vivas intactas e tecidos19,20. O CETSA apóia o envolvimento direto do alvo de pequenas moléculas em células intactas, detectando a estabilização termodinâmica de proteínas devido à ligação do ligante e ligando a resposta fenotípica observada ao composto alvo21,22. Dentre as várias metodologias derivadas do CETSA, o Western Blot-CETSA (WB-CETSA) é considerado uma abordagem clássica. Após a preparação da amostra usando o método CETSA, a análise de western blot é utilizada para detectar alterações na estabilidade térmica da proteína alvo. Isso permite a determinação precisa das interações fármaco-proteína dentro dos sistemas celulares17,23.

A xanthatina é um composto bioativo isolado da planta Xanthium L. com propriedades como anti-inflamatória, que tem sido utilizada na medicina tradicional chinesa para tratar doenças como sinusite nasal e artrite24,25. A proteína 1 associada a ECH semelhante a kelch (Keap1) é um componente do complexo proteico de múltiplas subunidades Cullin-RING E3 ubiquitina ligase baseado em Cullin3 e um importante regulador da homeostase redox intracelular, que influencia a intensidade e a duração da resposta inflamatória modulando o estado redox intracelular26. Neste estudo, primeiro utilizamos o docking molecular para investigar a interação entre xanthatin (pequena molécula) e proteína Keap1, com o objetivo de prever seu modo de ligação. Posteriormente, empregamos o método CETSA para validar essa interação, avaliando o impacto da xanthatina na estabilidade térmica da proteína Keap1.

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Protocolo

1. Baixando as estruturas de xanthatin e Keap1

  1. Abra o banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), insira xanthatin (molécula pequena), pressione Pesquisar e clique em O primeiro resultado. Clique em Download e clique em Salvar em Estrutura 2D para salvar o composto no formato .sdf.
  2. Baixe a estrutura cristalina da proteína.
    1. Abra o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/), insira Keap1 e clique em Pesquisar. Clique em Humano em organismos populares na coluna da esquerda e, em seguida, clique em A primeira entrada chamada Q14145 na coluna da direita.
    2. Clique em Estrutura na função na coluna da esquerda, encontre a estrutura com o ID do PDB: 2FLU e clique em RCSB-PDB. Clique em Baixar arquivos e selecione Formato PDB para baixar a estrutura cristalina da proteína Keap1.

2. Acoplamento molecular

  1. Crie uma nova pasta chamada encaixe molecular na área de trabalho e salve as estruturas xanthatin (molécula pequena) e Keap1 (proteína) baixadas nesta pasta.
    NOTA: O nome e o caminho da pasta devem estar em inglês.
  2. Abra o software Maestro, clique em Arquivo, selecione Alterar diretório de trabalho, clique em Área de trabalho, clique duas vezes para selecionar a pasta de encaixe molecular recém-criada e clique em Escolher opções.
  3. Processamento de moléculas pequenas
    1. Clique nas opções Arquivo e importar estruturas, clique em Área de trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique em xanthatin Structure File e clique em Open para importar o arquivo de molécula pequena.
    2. Clique em Tarefas no canto superior direito do software e selecione a opção LigPrep . Use estruturas do espaço de trabalho; o restante dos parâmetros são os parâmetros padrão e clique em Executar para executar o processamento de moléculas pequenas.
  4. Processamento da estrutura da proteína
    1. Clique nas opções Arquivo e Importar estruturas , clique em Área de trabalho e clique duas vezes na pasta Encaixe molecular . Clique no arquivo Keap1 Protein Structure e, em seguida, clique em Open para importar o arquivo de estrutura da proteína.
    2. Clique em Tarefas no canto superior direito do software e selecione a opção Assistente de preparação de proteínas . Marque a caixa Antes de excluir águas além de 5 Å de grupos Het e insira um pH de 7,4+/- 0,0. Clique em Pré-processar, clique em Refinar e, em seguida, clique em Otimizar > Remover Águas > Minimizar.
    3. Clique na próxima tarefa quando a tarefa anterior for concluída. Clique em Tarefas e selecione a opção Mapa do site , use as configurações padrão para todos os parâmetros e clique em Executar.
    4. Clique nas opções Arquivo e Importar Estruturas , clique em Área de Trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular e abra a pasta chamada sitemap_1. Clique no primeiro arquivo chamado Sitemap_1_out.maegz e, em seguida, clique em Abrir.
    5. Clique duas vezes no ponto para selecionar sitemap_1_protein na área de trabalho e, em seguida, clique em Sitemap_1_site_1 para selecioná-la . Clique em Tarefas e selecione a opção Geração de grade receptora .
      NOTA: Os locais de proteína previstos pelo mapa do site são classificados de acordo com a pontuação, com o local com maior pontuação em primeiro lugar.
    6. Selecione a opção Entrada em receptor, com os parâmetros restantes inalterados. Clique na Small White Ball na estrutura da proteína para gerar uma caixa de encaixe de tamanho padrão e altere o nome do trabalho para glide-grid_2FLU. Clique em Executar.
  5. Acoplamento molecular
    1. Clique em Tarefas e selecione a opção Encaixe de ligante . Selecione a grade do receptor como no arquivo e clique em Procurar. Clique em Área de trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique duas vezes no arquivo glide-grid_2FLU, clique em Glide-grid_2FLU.zip arquivo e clique em Abrir.
    2. Clique em Usar ligantes de arquivos > navegar > área de trabalho. Clique duas vezes na pasta de encaixe molecular, clique duas vezes no arquivo ligprep_1, clique em Ligprep_1-out.maegz file e clique em Abrir.
    3. Clique em Configurações e selecione a opção Precisão como XP (precisão extra), altere o nome do trabalho para glide-dock_XP_2FLU e clique em Executar.
  6. Exibir resultados do encaixe
    1. Clique nas opções Arquivo e Importar Estruturas , clique em Área de Trabalho e clique duas vezes na pasta Encaixe Molecular . Clique duas vezes no arquivo glide-dock_XP_2FLU , clique no arquivo glide-dock_XP_1_pv.maegz e clique em Abrir.
    2. Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar sitemap_1_protein. Clique em Tabela, deslize para a extrema direita e exiba a pontuação em pontuação de encaixe.
  7. Visualização de resultados 2D
    1. Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar também sitemap_1_protein. Clique em Interação do ligante > Exibir e marque a caixa de legenda da LID .
    2. Clique em Arquivo, escolha Salvar captura de tela, insira 6000 na largura, desmarque a caixa de fundo transparente e clique em OK. Clique em Área de trabalho, nomeie o arquivo como 2D-xanthatin-2FLU e salve a imagem.
  8. Visualização de resultados 3D
    1. Clique duas vezes no ponto para selecionar o ligante na área de trabalho e, em seguida, clique para selecionar também sitemap_1_protein.
    2. Clique em L na Seleção Rápida para selecionar moléculas pequenas e clique em Estilo. Clique na segunda linha no estilo para alterar o tamanho da ligação da molécula pequena e clique nos átomos de cor para alterar a cor da molécula pequena.
    3. Selecione a pequena molécula na figura, clique com o botão direito do mouse, selecione Expandir seleção e escolha 4 Å. Clique em Aplicar rótulos com estilo para exibir os rótulos.
    4. Clique na segunda linha do estilo para alterar o tamanho das ligações de aminoácidos e clique em Átomos de cor para alterar a cor dos aminoácidos.
    5. Clique em Avançar > Inverter, mantenha pressionada a tecla control e clique na posição do primeiro olho em estilo para mostrar apenas os aminoácidos com rótulos.
    6. Clique em Estilo > Fitas para mostrar a proteína como um estilo de fita e clique em Editar Fita em fitas para alterar a cor da fita.
    7. Clique em Alternar interações no canto inferior direito da tela, clique com o botão direito do mouse e desmarque contatos/conflitos.
    8. Pesquise por medida em tarefas, selecione Distância e clique nos dois átomos conectados pela linha pontilhada amarela (ligação de hidrogênio) na tela para medir os comprimentos das ligações de hidrogênio.
    9. Pressione e segure a roda do mouse para girar a proteína, ajuste a proteína para o centro da tela e certifique-se de que cada rótulo de aminoácido esteja visível.
    10. Clique em Área de trabalho > Salvar imagem como e clique na área de trabalho. Salve a imagem como 600dpi por padrão, nomeie o arquivo como 3D-xanthatin-2FLU, escolha o tipo de arquivo como formato tiff e salve a imagem.

3. Cultura celular e preparação de amostras CETSA

  1. Cultura de células
    1. Adicione 5 x 106 células RAW264.7 / mL em uma placa de cultura de 100 mm e incube com 6 mL de meio DMEM com 10% de FBS e 1% de solução antibiótica-antimicótica a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO2. Prepare três pratos e faça o experimento quando as células atingirem 80% de confluência.
  2. Preparação da amostra CETSA
    1. Aspire o meio antigo, adicione 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) aquecida à temperatura ambiente em cada prato e lave 2x.
    2. Adicione 2 mL de PBS a cada prato de células, misture as células e colete as células em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 377 x g por 3 min em temperatura ambiente.
    3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 2 mL de PBS contendo 1% de misturas de inibidores de protease de amplo espectro. Divida em tubos de microcentrífuga individuais com 1 mL de suspensão celular em cada um.
    4. Congele os tubos de microcentrífuga em nitrogênio líquido até que fiquem brancos sólidos, depois descongele imediatamente em banho-maria a 37 °C e repita 3x. Centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 10 min.
    5. Pegue dois tubos de microcentrífuga, um com 100 μM de xanthatin e outro com um volume igual de DMSO, e adicione 450 μL de sobrenadante centrifugado a cada tubo, incube a 37 ° C por 30 min.
    6. Adicionar o sobrenadante dos dois tubos de microcentrífuga a 14 tubos de PCR a um volume de 60 μL/tubo e aquecer os tubos simultaneamente a diferentes temperaturas (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C) durante 3 min, com dois tubos de PCR a cada temperatura, para os grupos DMSO e xanthatin, respectivamente.
    7. Para o grupo não aquecido, retirar o sobrenadante de cada um dos dois tubos de microcentrífuga e adicionar 14 tubos de PCR, 7 para o grupo DMSO e 7 para o grupo xanthatína, num volume de 60 μL cada. Não aqueça as amostras aqui.
    8. Resfrie os tubos em temperatura ambiente para o grupo aquecido. Centrifugue todos os tubos (aquecidos e não aquecidos) a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e leve 48 μL de sobrenadante de cada tubo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 12 μL de tampão de carga de proteína SDS-PAGE a cada tubo, vórtice para misturar bem e aqueça em banho-maria a 100 ° C por 5 min.
      NOTA: As amostras preparadas de CETSA devem ser armazenadas a -80 °C e testadas por western blot dentro de 1 semana.

4. Mancha ocidental

  1. Preparação do gel SDS-PAGE
    1. Enxágue um prato de vidro longo e um curto com água ultrapura. Coloque as placas no clampslot e, em seguida, em uma placa transparente. Adicione água ultrapura e verifique o vazamento por 10 min.
    2. Adicione 8 mL de solução de gel inferior e 8 mL de tampão de gel inferior em um frasco cônico e misture agitando suavemente. Adicione 160 μL de promotor coagulante à solução de gel e misture bem.
      NOTA: O volume da camada inferior do adesivo não deve exceder a linha verde no clampranhura.
    3. Escorra a água ultrapura das placas e seque-as com papel de filtro. Adicione a solução de gel inferior preparada. Adicione 2 mL de álcool isopropílico e aguarde 20 min para solidificação.
    4. Pegue 2 mL de solução de gel superior e 2 mL de tampão de gel superior em um frasco cônico e misture agitando suavemente o frasco.
    5. Remova o álcool isopropílico da camada de gel e seque o excesso de álcool isopropílico com papel de filtro.
    6. Adicione 40 μL de promotor coagulante à solução de gel superior misturada, misture bem, adicione entre as placas de vidro longas e curtas e insira um pente de 1,5 mm com 15 orifícios, aguarde 20 min.
      NOTA: O pente deve ser inserido perpendicularmente à camada superior, sem bolhas de ar entre o pente e a solução.
  2. Eletroforese
    1. Adicione 1 L de água ultrapura a um copo, adicione um sachê de pó tampão de corrida SDS-PAGE, mexa bem com uma haste de vidro e adicione o gel preparado à unidade de eletroforese. Coloque a unidade na caixa e puxe o pente para fora.
    2. Descongele as amostras de marcador e CETSA à temperatura ambiente, vórtice e centrifugação. Adicionar 2,5 μL de marcador ao primeiro poço e 20 μL de amostras CETSA a cada um dos restantes poços de acordo com a sequência predeterminada.
      NOTA: As amostras CETSA foram adicionadas sucessivamente de acordo com o tratamento de temperatura descrito na etapa 3.2.6 de 45 °C a 63 °C; o grupo DMSO foi adicionado primeiro, depois o grupo xanthatina (Figura 1).
    3. Adicione a solução de eletroforese restante à unidade de eletroforese, feche a tampa e insira o eletrodo, pólo positivo com pólo positivo, pólo negativo com pólo negativo.
    4. Ligue o interruptor de alimentação e ajuste o voltage interruptor para 80 V para iniciar a eletroforese.
  3. Transferir para a membrana
    1. Adicione 850 mL de água ultrapura, 100 mL de etanol anidro e 50 mL de tampão de transferência rápida a um béquer e mexa bem. Prepare placa de espuma, facas de plástico, pinças, bandejas e dispositivos de transferência de membrana.
    2. Corte a membrana de PVDF de acordo com o tamanho do gel, marque-a e mergulhe-a em metanol por 30 s para ativá-la.
    3. Despeje a solução de transferência na bandeja, coloque e abra os grampos de transferência e coloque uma esponja e três camadas de papel de filtro de transferência.
    4. Pare a eletroforese e abra a tampa da caixa de eletroforese. Pegue o dispositivo de eletroforese, despeje a solução de eletroforese e remova a placa. Coloque a placa na placa de espuma, retire-a suavemente com uma faca de plástico e corte o gel para visualizar claramente o marcador de proteína e as proteínas-alvo.
    5. Segure um lado do marcador com uma pinça, lave-o em uma bandeja contendo a solução transmembrana e coloque-o sobre papel de filtro. Mergulhe a membrana de PVDF ativada na solução de transferência, segure o lado rotulado com uma pinça e cubra o gel com a face voltada para baixo.
      NOTA: O lado marcado com membrana de PVDF é a parte frontal e preste atenção ao fato de que nenhuma bolha é gerada durante o processo de colocação.
    6. Coloque duas camadas de papel de filtro de transferência e uma camada de esponja na membrana de PVDF, cubra e prenda os clipes de transferência e coloque-os no tanque de transferência.
      NOTA: Cor preta do clipe de transferência para a cor preta do slot de transferência.
    7. Adicione a solução transmembrana restante ao transmembrana, cubra com a tampa, positivo para positivo, negativo para negativo.
    8. Ajuste a corrente para 400 mA, o tempo para 30 min e pressione Executar para iniciar a transferência da membrana à temperatura ambiente.
  4. Bloqueio
    1. Adicione 2 L de água ultrapura a um frasco de vidro, adicione um sachê de pó TBS e, em seguida, adicione 2 mL de Tween para fazer a solução TBST. Pese o pó de BSA para preparar uma solução de BSA a 5% com TBST e adicione 6 mL de solução de BSA à caixa de incubação.
    2. Pare a transferência da membrana e abra o clipe de transferência. Prenda o lado marcador da membrana de PVDF e coloque-o na caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em um agitador e bloqueie por 1.5 h em temperatura ambiente.
  5. Incubação de anticorpo primário
    1. Prepare o anticorpo primário (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) com solução de BSA a 5% a 1:1000, recicle a solução de BSA na caixa da incubadora e adicione 6 mL de anticorpo primário à caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em uma caixa de espuma com bolsas de gelo e mantenha-a em uma coqueteleira durante a noite.
  6. Incubação de anticorpos secundários
    1. Colete o anticorpo primário na caixa de incubação no dia seguinte, adicione 6 mL de solução de TBST e coloque-o em um shaker para lavar por 5 min.
    2. Despeje a solução TBST lavada e adicione fresca para lavar; repita 5x e prepare o anticorpo secundário com solução de BSA a 5% a 1:5000.
    3. Despeje a solução de TBST e adicione 6 mL de anticorpo secundário à caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em um shaker e incube por 1.5 h em temperatura ambiente.
    4. Colete o anticorpo secundário (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes), adicione 6 mL de solução de TBST e coloque-o em um shaker para lavar por 5 min. Despeje a solução TBST lavada e adicione fresca para lavar; repita 5x.
  7. Expondo as tiras
    1. Guarde a solução TBST no final da última lavagem. Pegue volumes iguais de reagentes quimioluminescentes A e B, agite e misture bem. Proteja a solução da luz.
    2. Abra o sistema de imagem de gel, clique em Amostras, verifique a calibração, aguarde a conclusão da calibração e, em seguida, clique em Marcador, verifique a calibração.
    3. Pegue o lado marcador da tira com uma pinça e mergulhe totalmente na solução reagente quimioluminescente. Prenda um lado do marcador para colocar a tira voltada para baixo no gerador de imagens, feche a tampa do gerador de imagens, clique em Exposição e defina o tempo de exposição para 1 s.
      NOTA: O desenvolvedor deve cobrir completamente a faixa e o desenvolvimento deve estar em um ambiente escuro.
    4. Clique em Salvar, nomeie a imagem e salve-a como um arquivo .tif. Analise a densidade óptica do western blot. Os valores de cinza de cada temperatura no grupo DMSO foram comparados com os valores de cinza de 45 °C, e os valores de cinza de cada temperatura no grupo xanthatin foram comparados com os valores de cinza de xanthatin a 45 °C.

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Resultados

A análise de docking molecular previu a interação entre xanthatin e proteína Keap1. A Figura 2 demonstra a formação de ligações de hidrogênio entre a xanateína e os resíduos de aminoácidos Gly-367 e Val-606 da proteína Keap1, com um comprimento de ligação de hidrogênio de 2,17 Å para Gly-367 e 2,13 Å para Val-606. Além disso, a pontuação de encaixe calculada de -5,69 kcal / mol significa uma boa afinidade de ligação entre a xanthatina e a proteína Keap1.

O método ...

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Discussão

A identificação de alvos de doenças e a descoberta e desenvolvimento de medicamentos estão intimamente interligadas27. Ao visar precisamente alvos específicos, os candidatos a medicamentos podem ser desenvolvidos para tratar doenças específicas de forma mais eficaz, minimizando simultaneamente os efeitos colaterais associados aos medicamentos28,29. Os alvos mais comumente usados são alvos de proteínas30. No entanto,...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82004031) e pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022NSFSC1303). Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun no Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com western blot.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 μ m Membrana de fluoreto de polivinilidenoMilliporePR05509
Etanol anidroProdutos químicos Chron64-17-5
Albumina de soro bovinoBioFroxx4240GR100
Misturas de inibidores de protease de amplo espectroBoster Biological Technology Co., LtdAR1193
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Reagente de quimioluminescência aprimoradoBeyotime Biotechnology Co., LtdP0018S
GAPDH anticorpoProteinTech Group Co., Ltd10494-1-AP
Gel Imaging InstrumentE-BLOTTouch Imager Pro
Gradient PCRBiometra TADVANCEDBiometra Tadvanced 96SG
Centrífugade congelamento de alta velocidadeBeckman CoulterAllegra X-30R
Horseradish peroxidase conjugada affiniPure anticorpo de cabraProteinTech Group Co., LtdSA00001-2
Álcool isopropílico produtos químicos67-63-0
, LtdR26935
Banho do metalAnalytik JenaTSC
MetanolChron dos produtos químicos67-56-1
Ncmblot tampão de transferência rápida (20×)NCM Biotech Co., LtdWB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel de preparação rápida kieEpizyme Biotech Co., LtdPG212
Tampão fosfato salinoBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Marcador de proteína de cor prestainedBiosharp BL741A
Sistema de Eletroforese de Blotting de ProteínasBio-RadMiniPROTEANÒ Tetra Cell
RAW264.7 célulaBeyotime Biotechnology Co., LtdC7505
RAW264.7 meio específico da célulaProcell Life Science& Technology Co., LtdCM-0597
Tampão de carregamento de proteína SDS-PAGEBoster Biological Technology Co., LtdAR1112-10
SDS-PAGE pó de buffer de corridaServicebioG2018
Tris tamponado pó salinoServicebioG0001
Tween 20BioFroxx1247ML100
Banho-mariaMemmertWNE10
Purificador de águaMilliporeMilli- IQ 7005
XanthatinChemConst Biotechnology Co., LtdCONST210706
instrument Zen BioScience Co. do anticorpo Keap1 dos de Chron

Referências

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