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Artigo de método

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

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DOI:

10.3791/66579

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6 de setembro de 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Resumo

Os nucleossomos constituem a unidade primária da cromatina eucariótica e têm sido o foco de inúmeras investigações informativas de molécula única sobre suas propriedades biofísicas e interações com proteínas de ligação à cromatina. A reconstituição de nucleossomos no DNA para esses estudos normalmente envolve um procedimento de diálise com sal que fornece controle preciso sobre a colocação e o número de nucleossomos formados ao longo de uma corda de DNA. No entanto, este protocolo é demorado e requer uma quantidade substancial de DNA e octâmeros de histonas como entradas. Para oferecer uma estratégia alternativa, é descrito um método de reconstituição de nucleossomos in situ para microscopia de força e fluorescência de molécula única que utiliza a chaperona histona Nap1. Esse método permite que os usuários montem nucleossomos em qualquer molde de DNA sem a necessidade de sequências fortes de posicionamento de nucleossomos, ajustem a densidade do nucleossomo sob demanda e usem menos reagentes. A formação de nucleossomos in situ ocorre em segundos, oferecendo um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para medições de molécula única. Exemplos de dois ensaios a jusante para sondar a mecânica do nucleossomo e visualizar o comportamento de proteínas individuais na cromatina são descritos posteriormente.

Introdução

A unidade de empacotamento primário da cromatina eucariótica é o nucleossomo, no qual ~ 147 pares de bases (bps) de DNA são enrolados em torno de um octâmero de proteínas histonas centrais 1,2. Além do empacotamento do genoma, a arquitetura do nucleossomo serve como outra camada rica de regulação biofísica que pode ser aproveitada pelas proteínas de ligação à cromatina ao desempenhar suas várias funções 3,4. Acessar e medir experimentalmente as características físicas dos nucleossomos tem sido tecnicamente desafiador, uma vez que essas unidades funcionam em escalas minúsculas (por exemplo, comprimentos nanométricos, forças de piconewton) e, portanto, sua sondagem requer sensibilidade e precisão suficientes para informar significativamente a função. Além disso, as proteínas de ligação à cromatina geralmente se envolvem com seus substratos transitoriamente, e a maioria das abordagens de conjunto carece de resolução temporal apropriada para informar a cinética dessas interações5. Felizmente, o advento das técnicas de molécula única tornou possível visualizar e manipular proteínas individuais e suas interações em tempo real, revelando informações mecanicistas sobre esses eventos moleculares que ocorrem em nanoescala6. Em particular, a microscopia de força e fluorescência correlativa de molécula única (smCFFM) aproveita as ferramentas de detecção e manipulação de força de fluorescência de alta resolução para resolver simultaneamente a mecânica, composição e coordenação da cromatina e dos complexos cromatina-proteína 7,8.

No smCFFM, que emprega especificamente "pinças ópticas" como método de manipulação de força, um laser bem focado é usado para prender um objeto dielétrico, normalmente um grânulo de plástico do tamanho de um mícron, em três dimensões9. Um biopolímero, como um pedaço de DNA, pode ser conjugado ao grânulo (via, por exemplo, estreptavidina-biotina, ligação de anticorpos digoxigenina-anti-digoxigenina), e o usuário pode aplicar uma força calibrada e medir a força / deslocamento gerado pelo sistema10. O módulo de fluorescência adicionado permite imagens de fluorescência multicoloridas simultâneas para rastrear a composição e o comportamento das proteínas.

O método convencional para reconstituir modelos de nucleossomos para smCFFM envolve a montagem de nucleossomos em modelos de DNA personalizados por diálise salina 11,12,13. Neste procedimento, os octâmeros de histonas purificados são incubados com moldes de DNA em um tampão com alto teor de sal (~ 1 M de cloreto de sódio) e, à medida que o sal é lentamente dilisado, os nucleossomos se montam espontaneamente no DNA de maneira posicional dependente da sequência14,15. Como tal, é comum que sequências fortes de posicionamento de nucleossomos (por exemplo, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) sejam incorporadas aos modelos de DNA para gerar matrizes de nucleossomos personalizadas. Embora este método bem estabelecido ofereça controle preciso sobre a colocação e o número de nucleossomos no DNA, ele sofre de várias desvantagens: (1) a incorporação de sequências de DNA de posicionamento de nucleossomos fortes pode gerar nucleossomos artificialmente estáveis que influenciam a atividade das proteínas de ligação à cromatina, (2) o processo de diálise de sal para a formação de nucleossomos requer grandes quantidades de DNA e octâmeros, e (3) o procedimento leva de um a vários dias de trabalho, bem como um esforço considerável para titular a proporção correta de DNA para octâmero para densidade ideal de matriz de nucleossomos.

Neste manuscrito, descrevemos um método alternativo para formar nucleossomos ao longo do DNA in situ dentro de um microscópio de força correlativa e fluorescência de molécula única usando a chaperona de histona recombinante Nap1, que se assemelha à via fisiológica de formação de nucleossomos in vivo 18,19,20,21,22. Esse método permite que os usuários montem nucleossomos em sequências de DNA não específicas, ajustem facilmente a densidade do nucleossomo e utilizem quantidades significativamente menores de reagentes, tudo em minutos. Além disso, a formação de amarras de DNA nucleossômico in situ permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e a conveniência de visualização e manipulação de uma única molécula integrada. Assim, quando o posicionamento uniforme e específico do nucleossomo não é uma necessidade, este protocolo oferece uma opção útil para a investigação da mecânica do nucleossomo ou do comportamento da proteína na cromatina, para a qual também descrevemos ensaios de exemplo.

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Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de DNA biotinilado

  1. Prepare uma reação de volume de 120 μL contendo 20 μg de λ DNA, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
    NOTA: Este procedimento utiliza especificamente DNA genômico λ bacteriófago λ livre de metilação linear de fita dupla (ds) (48.502 bps), que contém 12 nucleotídeos (nt) 5' saliência de DNA de fita simples (ss)23. No entanto, o protocolo pode ser adaptado para fazer uso de qualquer comprimento ou sequência de dsDNA linear, desde que contenha pelo menos vários nts de ss 5 'saliências, o comprimento e a sequência nt ditando o número de nts biotinilados instalados em cada extremidade para amarração a jusante entre armadilhas ópticas. Além disso, a reação pode ser reduzida. Por exemplo, 5 μg de DNA podem ser usados em uma reação de volume de 30 μL. Além disso, os substratos de DNA gerados dessa maneira não são restritos à torção. Para protocolos para criar DNA com restrição de torção, consulte os relatórios publicados anteriormente24,25.
  2. Incubar a reação à temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Adicionar 10 mM de EDTA e incubar a 75 °C durante 20 min.
  4. Realize a precipitação de etanol para obter o produto de DNA biotinilado.
    1. Adicione 0,1x volume de acetato de sódio 3 M e 3x volume de etanol 100% gelado. Conservar a -20 °C durante, pelo menos, 1 h até uma noite. Centrifugue a 13.500 x g por 30 min a 4 °C.
    2. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 1 mL de etanol a 75%. Centrifugue a 13.500 x g por 1 min a 4 °C.
    3. Repita as etapas de remoção do sobrenadante, adição de etanol e centrifugação.
    4. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante e deixe o pellet secar ao ar por 10 min. Dissolva o pellet em 100-200 μL de tampão TE ou ddH2O (pode incubar a 37 °C para facilitar a dissolução). Meça a concentração usando um espectrofotômetro Nanodrop.

2. Preparação de canais em uma célula de fluxo

NOTA: Este procedimento é baseado em um chip microfluídico disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), mas pode ser adaptado a qualquer instrumento smCFFM com uma célula de fluxo multicanal.

  1. Passivar os canais (cap.) 4 e 5 (ou qualquer ch. que contenha proteínas) (ver esquema dos canais na Figura 1A). Adicione 500 μL de BSA a 0,1% a cada canal e escove a 0,8 bar (~0,45 μL/s para tubos com diâmetro interno de 0,010 pol.) por 8 min.
  2. Adicione 500 μL de 0,05% de Pluronic-F127 a cada canal e flua a 0,8 bar por 8 min. Remova a solução e enxágue as seringas com 1x PBS. Adicione 2 mL de 1x PBS a cada canal e flua a 0,8 bar por 27 min.
  3. Vortex a solução estoque de grânulos revestidos com estreptavidina (este procedimento usa grânulos de tamanho de 3,13 μm) e adicione 2,15 μL da solução de grânulos a 1 mL de 1x PBS. Adicionar ao cap. 1.
    NOTA: O tamanho e a concentração dos grânulos revestidos com estreptavidina podem ser ajustados de acordo com a preferência do usuário.
  4. Adicione 30-80 ng de λ DNA biotinilado a 1 mL de 1x PBS. Adicionar ao cap. 2.
    NOTA: A concentração de DNA biotinilado pode ser ajustada de acordo com a preferência do usuário. Maiores quantidades de DNA aumentarão a frequência de formação de amarras de DNA, mas também aumentarão a frequência de amarrar várias moléculas de DNA de uma só vez, o que pode aumentar a dificuldade do experimento.

3. Formação de nucleossomos in situ mediada por Nap1

  1. Adicione 500 μL de tampão de imagem livre de proteínas ao cap. 3.
    NOTA: A composição do tampão no cap. 3 é flexível e deve ser apropriada para nucleossomos e proteína(s) específica(s) de interesse. Opcionalmente, os usuários podem optar por adicionar sistemas de eliminação de oxigênio para reduzir o fotobranqueamento de fluoróforos e/ou DNA concorrente para remover octâmeros de histonas que não estão devidamente envolvidos em nucleossomos.
  2. Adicione 2 nM S. cerevisiae Nap1 e 2-5 nM LD655 marcado com H4 histona octâmero (HO) a 500 μL de 1x tampão HR18. Adicionar ao cap. 4.
    NOTA: Os octâmeros de histona e o Nap1 podem ser adquiridos comercialmente ou preparados internamente (consulte a Tabela de Materiais). O número de nucleossomos a serem formados ao longo de cada DNA amarrado depende da concentração de octâmero, bem como do tempo gasto neste canal. A densidade de nucleossomos desejada e aproximada do usuário ao longo de cada molécula de DNA pode ser modulada ajustando um ou ambos os parâmetros. Além disso, o usuário pode optar por rotular os octâmeros de histonas com seu fluoróforo preferido.
  3. Opcional: Adicione a proteína de ligação à cromatina ou outra proteína de interesse ao cap. 5 em um tampão apropriado.
  4. Fluxo de todos os canais a 1,0 bar (~ 0,55 μL / s na configuração experimental atual) por 30 s para lavar os canais da célula de fluxo com amostras.
  5. Defina o fluxo para 0,2 bar (~0,16 μL/s na configuração experimental atual). Mova as armadilhas ópticas (OTs) para o cap. 1 e pegue um par adequado de esferas revestidas de estreptavidina.
  6. Mova os OTs para o cap. 3, realize uma calibração de força para o par de contas, ligue o laser confocal vermelho (ou outra linha de laser de sua escolha) e calibre a área de imagem.
  7. Defina o fluxo para 0,2 bar e mova os OTs para o cap. 2. Pegue DNA biotinilado.
  8. Mova os OTs para o cap. 3 e pare o fluxo. Aumente a distância entre os OTs para esticar o DNA e monitore a curva de distância-força (FD) associada para confirmar a presença de uma única corda de DNA (em oposição a várias amarras). A curva deve seguir o modelo de cadeia semelhante a um verme para dsDNA no comprimento de contorno dado26.
  9. Ajuste a distância entre os OTs para que a tensão do DNA leia aproximadamente 1 pN.
    NOTA: 1 pN de tensão é baixo o suficiente para permitir que os nucleossomos permaneçam envoltos pelo DNA27 , mas é alto o suficiente para colocar toda a molécula de DNA dentro do eixo de imagem de varredura de linha.
  10. Ative a varredura de linha para começar a coletar um quimógrafo com o laser vermelho ligado.
    NOTA: Quimógrafos ou varreduras 2D de DNA amarrado podem ser obtidos, conforme a preferência do usuário.
  11. Mova os OTs para o cap. 4 com o fluxo desligado. Facilitado pelo Nap1, os HOs são carregados no DNA e embrulhados para formar nucleossomos em tempo real. A carga de nucleossomos é visualizada como trajetórias fluorescentes que aparecem no DNA dentro dos quimógrafos. Ao mesmo tempo, a formação de nucleossomos no DNA pode ser monitorada pelo aumento da força à medida que mais HOs são carregados quando as posições dos OTs são mantidas constantes.
    NOTA: O laser de excitação de fluorescência pode ser desligado durante as etapas de formação do nucleossomo para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos. Além disso, a ligação não específica de octâmeros de histonas ao DNA, em que os octâmeros não estão envoltos em nucleossomos, pode ocorrer usando este protocolo. Esses eventos de ligação não gerarão um "rasgo" quando o DNA for esticado, conforme descrito no protocolo de desempacotamento de nucleossomos (etapa 4) abaixo, e às vezes podem ser lavados por um fluxo tampão suave, principalmente se o tampão contiver DNA concorrente livre.
  12. Quando o número aproximado desejado de nucleossomos for formado, comece a coletar dados.

4. Desembrulhando nucleossomos

  1. Conclua as etapas 2 e 3.
  2. Depois de formar uma corda de DNA contendo nucleossomos, mova os OTs para o cap. 3.
  3. Prepare-se para experimentos de desdobramento de nucleossomos reduzindo a distância entre OTs até que a força seja aproximadamente zero. Zero a força.
  4. Comece a afastar o OT 1 do OT 2 a uma velocidade constante de 0.1 μm/s. Em um quimógrafo, o cordão no OT 1 se moverá visualmente mais longe do cordão no OT 2. Na curva FD, a força aumentará à medida que a distância aumenta. À medida que os nucleossomos se desenrolam, aparecerão "rasgos" ou transições na força (~ 8-37 pN) que significam o desvendar do envoltório interno de nucleossomos individuais 27,28,29.
    NOTA: A força na qual o desembrulhamento ocorre depende da taxa de tração, que é esperada para processos fora do equilíbrio. Às vezes, vários nucleossomos se desenrolam ao mesmo tempo, produzindo uma mudança de distância maior na transição na curva FD. Além disso, o desenrolar do envoltório externo do nucleossomo não é facilmente visível neste ambiente experimental (consulte a seção Discussão).

5. Visualizando a ligação de proteínas à cromatina

  1. Conclua as etapas 2 e 3.
  2. Adicione 10 nM de histona de ligação marcada com Cy3 H1.4 a 500 μL de buffer de imagem no cap. 5.
    NOTA: Qualquer proteína de interesse pode ser adicionada ao cap. 5 em uma concentração de escolha (normalmente abaixo de 100 nM para visualização de molécula única).
  3. Depois de formar uma corda de DNA contendo nucleossomos, ligue o laser verde além do laser vermelho e mova os OTs para o cap. 5 para obter imagens em tempo real da ligação de H1 à cromatina.
  4. Continue coletando quimógrafos ou varreduras até que estatísticas suficientes tenham sido alcançadas (pelo menos ~ 10-20 quimógrafos, dependendo da frequência de eventos e dificuldade experimental).

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Resultados

Usando a configuração descrita na etapa 3 (Figura 1A), a formação de nucleossomos ao longo da corda de DNA foi visualizada como o aparecimento de focos fluorescentes vermelhos em uma varredura 2D (Figuras 1B, à esquerda) ou trajetórias ao longo do tempo em um quimógrafo (Figura 1B, à direita). Os nucleossomos devidamente embrulhados produziram trajetórias de fluorescência que permaneceram estacionárias ao longo do tempo dentro do li...

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Discussão

O protocolo descrito oferece várias vantagens para a reconstituição do nucleossomo, incluindo a minimização de reagentes e tempo, além de permitir a formação de nucleossomos dependentes de chaperonas ao longo de qualquer sequência de DNA (potencialmente nativa). Além disso, o método in situ permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para ensaios de molécula única da mecânica do nucleossomo e da interação proteína-cromatina. Por outro lado,...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

G. N. L. C. reconhece o apoio do Instituto Nacional de Saúde Mental dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de prêmio F31MH132306. SL é apoiado pela Fundação Robertson, pela Fundação Internacional da Síndrome de Rett e pelo NIH (número de prêmio R01GM149862).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x tampão HRN/AN/A30 mM  tris  acetato pH 7,5, acetato de magnésio 20 mM, cloreto de potássio 50 mM, BSA 0,1 mg/mL 
1x PBS (solução salina tamponada com fosfato)N/AN/A137 mM cloreto de sódio, 2,7 mM cloreto de potássio, 10 mM fosfato de sódio dibásico, 1,8 mM de fosfato de potássio monobásico 
Ácido acético, glacialMillipore SigmaAX0074-6Uso para fazer acetato de tris
Biotina-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotina-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotina-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Soro bovino AlbuminaMillipore SigmaA9418-50GDissolver em H2O e passar por um filtro de 0,22 um
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide funcionalizado Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrífuga de bancada com
resfriamento Álcool etílico, PureMillipore Sigma459844
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissolver em H2O a 0,5 M
Octâmero histona humana (H4, L50C; H2A, K119C) N / AN / Aproteínas histonas recombinantes e aquelas que abrigam mutações de marcação foram purificadas internamente conforme descrito anteriormente (ver refs. 33, 34, 35, 36). Resumidamente, histonas recombinantes foram expressas em células BL21 (De3) pLySS (Promega). Os corpos de inclusão foram isolados após sonicação e as histonas foram extraídas em condições de desnaturação. As histonas foram dialisadas em tampão A (ureia 7 M, cloridrato de tris 10 mM pH 8,0, cloreto de sódio 100 mM, EDTA 1 mM e 2-mercaptoetanol 5 mM), e a solução foi adicionada a uma coluna de gravidade carregada com Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). O fluxo foi então adicionado a uma coluna de gravidade carregada SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), e as histonas foram eluídas da coluna adicionando tampão A suplementado com cloreto de sódio 600 mM. Histonas que abrigam mutações de marcação (H4, L50C; H2A, K119C) foram purificados e depois conjugados ao fluoróforo desejado por meio de corantes funcionalizados com maleimida (Cytiva, Lumidyne) usando uma proporção molar de corante para proteína de 20:1 (ver refs. 33, 34). Os octâmeros de histona foram montados adicionando uma proporção molar igual de cada histona marcada com fluoróforo ou tipo selvagem sob condições de desnaturação, dialisados em um tampão com alto teor de sal contendo cloreto de sódio 2 M e, em seguida, purificados por cromatografia de exclusão de tamanho conforme descrito anteriormente (ver refs. 36, 37). Alternativamente, proteínas histonas individuais e octâmeros de histonas prontos podem ser comprados comercialmente (por exemplo, Epicypher).
Tampão de imagemN/AN/A20 mM cloridrato de tris pH 8.0, 100 mM cloreto de sódio
Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)New England BiolabsM0212S
DNA Lambda (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Livre de metilação λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Fluoróforo LD655 funcionalizado Maleimide
Histona ligante H1.4 (A4C)N/AN/AProteína recombinante purificada fabricada internamente (ver ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfiguração de armadilha dupla; materiais padrão para o instrumento fornecido pelo fabricante
Solução de acetato de magnésioMillipore Sigma63052-100MLUse para fazer tampão HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluído com kit de fragmentos Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDissolva em H2O e passe por um filtro de 0,22 um Cloreto
potássioMillipore SigmaP3911Use para fazer tampão PBS e HR
Fosfato de potássio monobásicoMillipore SigmaP0662Use para fazer PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 foi purificado internamente conforme descrito anteriormente (ver refs. 33, 34). Alternativamente, o Nap1 pode ser comprado comercialmente (por exemplo, Active Motif).
Acetato de sódioMillipore Sigma241245Dissolver em H2O a 3 M
Cloreto de sódioMillipore SigmaS9888Use para fazer PBS e tampão de imagem
Fosfato de sódio dibásicoMillipore SigmaS9763Use para fazer
PBS SPHERO Partículas revestidas com biotina (3.0-3.4 µ m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000 / 2000c EspectrofotômetroFisher ScientificND2000NanoDrop
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissolva em H2O e ajuste para pH apropriado; use para fazer tampão de imagem e acetato de tris
As de

Referências

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