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Artigo de método

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

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DOI:

10.3791/66580

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24 de maio de 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Resumo

A resposta imune adaptativa depende da capacidade de uma célula T de migrar através do sangue, linfa e tecido em resposta a patógenos e corpos estranhos. A migração de células T é um processo complexo que requer a coordenação de muitas entradas de sinal do ambiente e das células imunes locais, incluindo quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão. Além disso, a motilidade das células T é influenciada por pistas ambientais dinâmicas circundantes, que podem alterar o estado de ativação, a paisagem transcricional, a expressão da molécula de adesão e muito mais. In vivo, a complexidade desses fatores aparentemente entrelaçados torna difícil distinguir sinais individuais que contribuem para a migração de células T. Este protocolo fornece uma série de métodos, desde o isolamento de células T até a análise auxiliada por computador para avaliar a migração de células T em tempo real sob condições ambientais altamente específicas. Essas condições podem ajudar a elucidar os mecanismos que regulam a migração, melhorando nossa compreensão da cinética das células T e fornecendo fortes evidências mecanicistas que são difíceis de obter por meio de experimentos com animais. Uma compreensão mais profunda das interações moleculares que afetam a migração celular é importante para desenvolver uma terapêutica aprimorada.

Introdução

As células T são os principais efetores da resposta imune adaptativa e específica do antígeno. Em nível populacional, as células T são heterogêneas, compostas por subconjuntos celulares com funções especializadas distintas. É importante ressaltar que as células T CD8+ são os principais efetores citolíticos do sistema imunológico, que eliminam diretamente as células infectadas ou disfuncionais1.

As células T CD8+ maduras residem no tecido e circulam pelo sangue e linfáticos em busca de antígenos. Durante a infecção, as células T são apresentadas a antígenos no sangue ou tecido e drenam rapidamente para o baço ou linfonodo de drenagem mais próximo para iniciar uma resposta imune produtiva. Em ambos os casos, as células T são ativadas, sofrem expansão clonal e deixam o sistema linfático para entrar no sangue, se ainda não estiverem lá. Durante esse processo, a sinalização intracelular confere a regulação negativa dos receptores linfáticos e a regulação positiva de vários receptores de integrina e quimiocina essenciais para a migração específica do tecido2. Em última análise, a migração direcionada de células T para locais de infecção é impulsionada por sinais ambientais convergentes que incluem sinalização de integrina e quimiocina.

As quimiocinas podem ser amplamente categorizadas em duas classes principais: (1) sinais homeostáticos, que são essenciais para diferenciação, sobrevivência e função basal, e (2) sinais inflamatórios, como CXCL9, CXCL10 e CCL3, que são necessários para a quimiotaxia. Geralmente, as quimiocinas criam um gradiente de sinal que impulsiona a migração direcional, conhecida como quimiotaxia, além de ativar a expressão da integrina1. A quimiotaxia é finamente regulada e altamente sensível, com células T capazes de responder a pequenas mudanças no gradiente que podem levá-las a uma direção ou local específico.

Além desses fatores relacionados às células T, a migração também é afetada pela composição e densidade da matriz extracelular (MEC). A ECM é composta por uma densa rede de proteínas, incluindo colágeno e proteoglicanos, que fornecem a estrutura para receptores de integrina adesiva nas células T. As integrinas são uma família diversificada de proteínas transmembranares, cada uma com domínios de ligação altamente especializados e efeitos de sinalização a jusante. A expressão dinâmica dos receptores de integrina na superfície de uma célula T permite uma rápida adaptação aos seus ambientes em mudança3. É importante ressaltar que as integrinas conectam as redes de ACTINA do citoesqueleto intracelular e do citoesqueleto intracelular que trabalham juntas para gerar a força propulsora necessária para o movimento das células T.

Em resumo, os padrões de migração variam de acordo com o fenótipo da célula imune ou sinais ambientais. Esses processos biológicos complexos são rigidamente regulados pela expressão de citocinas, quimiocinas e integrinas na superfície da célula T, nas células circundantes e no tecido infectado local. In vivo, esses mecanismos migratórios podem ser complexos e podem resultar de vários sinais aditivos4. Devido a essa complexidade, pode ser impossível estabelecer uma relação causal entre variáveis aparentemente interligadas. Para superar isso, existem várias abordagens in vitro para estudar aspectos específicos da migração de células T, como resposta a sinais específicos de quimiocinas e a interação entre integrinas de células T e proteínas de ligação à MEC. Este protocolo aborda métodos para isolar e ativar células T CD8+ murinas, com ensaios de migração in vitro no espaço bidimensional e ferramentas de análise computacional para análise da migração de células T especificadas. Esses métodos são vantajosos para o usuário porque não requerem materiais ou dispositivos sofisticados, como acontece com alguns outros ensaios de migração celular descritos na literatura. Os dados de migração celular gerados com esses métodos podem fornecer evidências de respostas imunes de maneira simplista que permite uma investigação mais aprofundada e informada in vivo.

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Protocolo

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Universitário de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos neste estudo foram mantidos no espaço livre de patógenos do biotério da Universidade de Rochester. Camundongos C57BL/6 machos/fêmeas, com idade entre 6 e 12 semanas (15-30 g), foram usados para o presente estudo. O isolamento do tecido do camundongo pode ser realizado em uma bancada com luvas para cobrir as mãos e uma máscara facial para cobrir o nariz e a boca, ou dentro de um gabinete de biossegurança. Toda a cultura celular e preparação da placa devem ser realizadas em uma cabine de biossegurança. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação e ativação de células T CD8 +

  1. Preparação de materiais
    1. Para a seleção negativa de células T CD8+ : Preparar um meio de seleção negativa a partir do sobrenadante dos anticorpos GK1.5 e M5/114 das linhas celulares de hibridoma, que produzem anticorpos anti-CD4 e anti-MHCII, respectivamente. Misturar o sobrenadante na proporção de 1:1, filtrá-lo e armazená-lo a 4 °C para utilização futura (>0,5 μg de cada anticorpo/milhão de células totais). Como alternativa, kits comerciais de isolamento de células T CD8+ estão disponíveis.
    2. Para ativação de células T: Adicione 500 μL de anticorpos CD3 (10 μg/mL) e CD28 (16 μg/mL) em 1x DPBS (sem cálcio e magnésio) a uma placa de 24 poços tratada sem cultura de tecidos (TC) e armazene durante a noite a 4 °C para garantir a ligação da placa.
      NOTA: Anticorpos e proteínas revestem placas/placas de cultura não tratadas com TC melhor do que as normais tratadas com TC, portanto, placas de cultura não tratadas com TC são usadas para geração de células T.
  2. Prepare uma placa de cultura de 10 cm (ou equivalente) colocando um filtro de células de 70 μm na placa e dispense 2 mL de meio R9 no filtro (meio R9: RPMI 1640x suplementado com 10% de FBS, 1% de antibiótico-antimicótico, 20 mM de tampão HEPES, 1% de aminoácidos não essenciais MEM, 50 μM de β-mercaptoetanol).
  3. Obtenha um camundongo com histórico genético, sexo, idade e peso apropriados, conforme determinado pelo projeto experimental.
  4. Eutanásia do camundongo usando CO2 seguido de luxação cervical, ou estratégias apropriadas de eutanásia, conforme definido pelos protocolos locais de cuidados e uso de animais e aprovados pela instituição.
  5. Coloque o mouse em decúbito dorsal, estique todos os quatro membros perpendicularmente ao corpo e prenda as almofadas dos pés em uma placa de dissecação usando pinos T de dissecação do mouse ou equivalente. Faça uma incisão superficial e central através da camada cutânea no abdômen inferior ventral com uma tesoura de dissecção cirúrgica de camundongo e corte até o queixo (~ 8 cm). Separe a pele do revestimento peritoneal para expor os gânglios linfáticos. Estique a pele perpendicularmente para longe do tronco e prenda-a5.
    1. Extirpe suavemente os linfonodos cervicais, axiais, braquiais e inguinais bilateralmente usando uma pinça romba (ou o tipo preferido de um kit de dissecção cirúrgica de camundongo padrão). Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.
    2. Abra o peritônio e remova o baço. Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.
    3. Descarte a carcaça do camundongo no recipiente de risco biológico apropriado.
  6. Preparar uma suspensão unicelular dos tecidos linfóides secundários por ruptura mecânica sobre o filtro de células de 70 μm com 2 ml de meio R9 do passo 1.2, rodando repetidamente a ferramenta de ruptura tecidual meia volta no sentido dos ponteiros do relógio e no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio.
    NOTA: A extremidade do êmbolo de uma seringa luer-lock, 3 mL ou 10 mL, funciona bem para esmagar e homogeneizar o tecido. Materiais alternativos podem ser usados a critério do usuário.
  7. Lave as células, a extremidade da seringa, o filtro e a placa de cultura com 7 mL de meio, garantindo que o filtro permaneça na posição vertical para evitar a transferência de pedaços maiores de tecido ou agregados celulares que possam estar presentes na suspensão de célula única.
  8. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
  9. Pulverizar as células a 270 x g à temperatura ambiente (20 °C) durante 5 min e decantar o sobrenadante.
  10. Adicione 500 μL de tampão de lise por 1 min para remover os glóbulos vermelhos. Diluir com 9,5 ml de meio R9 e centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Decantar o sobrenadante.
  11. Ressuspenda o pellet em 10 ml do meio de seleção negativa previamente preparado contendo anti-MHCII e anti-CD4 (passo 1.1.1). Agite em temperatura ambiente (20 °C) por 30 min.
  12. Pulverizar as células a 270 x g durante 5 min e decantar o sobrenadante. Lave 3x com 10 mL de meio R9.
  13. Simultaneamente, em um tubo cônico de 15 mL, lave 200 μL de grânulos de IgG anti-rato de ovelha em 7 mL de meio. Coloque o tubo em um ímã, remova o meio e repita a etapa de lavagem duas vezes. Ressuspenda os grânulos em 7 ml de meio R9.
  14. Pulverizar as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min, transvasar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o sedimento em 7 ml de suspensão de esferas a partir do passo 1.13. Balance em temperatura ambiente (20 °C) por 45 min.
  15. Enriqueça as células T CD8+ por depleção de esferas magnéticas. Coloque o tubo cônico diretamente no ímã sem tampa por 3 min para remover as células ligadas a anticorpos/esferas. As células CD8+ devem ser retidas. Com o tubo ainda no íman, recolher a suspensão celular utilizando uma pipeta serológica ou equivalente e transferi-la para um novo tubo de 15 ml. Centrifugue a 270 x g (20 °C) por 5 min e lave 3x em médio.
  16. Lave a placa de ativação pré-revestida (etapa 1.1.2) com 1x DPBS duas vezes sem pipetar diretamente na superfície inferior da placa.
  17. Opcional: Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas.
    1. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione suavemente 2 mL de meio de separação de linfócitos no fundo da suspensão celular. Centrifugue a 900 x g por 10 min (à temperatura ambiente) em baixa aceleração e desaceleração.
      NOTA: As células vivas se separarão na interface do meio e do meio de separação (camada branca média). As células mortas serão pellets no fundo do tubo e podem ser descartadas no final.
    2. Transfira a camada intermediária contendo linfócitos vivos para um novo tubo e centrifugue a 270 x g por 5 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante.
  18. Ressuspenda o pellet em 12 mL de meio com 10 U/mL de IL-2 de camundongo recombinante. Colocar 1 mL por alvéolo em uma placa de 24 poços não tratada com TC e transferir para 37 °C durante a noite.

2. Levantamento das células T CD8+ ativadas

  1. Visualize células usando um microscópio óptico de bancada padrão, usando a objetiva 4x ou 10x.
    NOTA: As células T ativadas parecerão maiores e redondas ou alongadas em comparação com as células T inativadas e devem ter aglomerados densos de células em todo o poço.
  2. Para levantar as células ativadas, interrompa as células com uma pipeta de 1 mL, certificando-se de misturar bem nas bordas da placa. Transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: As células ativadas são mais pegajosas e requerem pipetagem mais vigorosa.
  3. Lave os poços com 1 mL de meio R9 para remover quaisquer células restantes. Repita mais uma vez, se necessário. Centrifugue as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
  4. Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas como nas etapas 1.17-1.18.
  5. Mantenha as células T por remoção de células vivas/mortas a cada 3-4 dias em meio R9 com IL-2 em uma placa de 6 poços não TC.
    NOTA: As células T proliferam melhor em poços de pequena dimensão durante a ativação inicial, possivelmente devido ao contato entre células T e células T ou fatores solúveis derivados de células T que ajudam na ativação. A rápida proliferação de células T faz com que o meio de cultura fique amarelo dentro de 24-48 h após a cultura. Neste ponto, levante as células e transfira-as para um poço maior (placa de 6 poços não revestida e não TC) com meio de cultura fresco suficiente para alimentar as células (normalmente 5 mL por poço). Substitua o meio empobrecido por fresco sempre que indicado pela mudança de cor do meio amarelo ou a cada 3-4 dias.

3. Preparação do prato de vidro

  1. Prepare as câmaras ou placas de migração de células de vidro revestindo com 300 μL / cm2 Proteína A (0,1 mg / mL) durante a noite a 4 ° C, lave duas vezes com 1x DPBS dispensando no prato e decantando antes de passar para a próxima etapa.
  2. Cubra a câmara ou placa de migração com 300 μL / cm2 quimera ICAM-1 ou VCAM-1 Fc de camundongo recombinante (0,1-2,75 mg / mL) junto com uma quimiocina de camundongo recombinante (0,1-10 μg / mL) por 2-3 h à temperatura ambiente. Outros ligantes de integrina, como fibronectina, colágeno IV de camundongo e E-caderina de camundongo, são revestidos diretamente da câmara a 2,5-10 μg / mL durante a noite a 4 ° C.
    1. Lave as câmaras duas vezes com 1x DPBS, dispensando no prato e decantando imediatamente depois antes de adicionar as células.
      NOTA: As células T podem migrar de forma diferente em diferentes concentrações de ligantes de integrina e quimiocinas, dependendo do status de ativação, diferenciação, sensibilização e priming. O ensaio da migração celular em várias concentrações diferentes é fortemente sugerido.
  3. Coloque as células aderentes em placas revestidas de vidro 24 horas antes do início da imagem se co-cultivar células T com outras células, como células cancerígenas, para medir a morte de células T de células cancerígenas em tempo real.

4. Preparação de células

  1. Opcional: Corar células T e células aderentes com corante rastreador celular de escolha a 1 μg/mL por 1 x 107 células em 1x DPBS por 15 min a 37 °C, ou de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Conte as células usando um hemocitômetro ou equivalente.
  3. Placa 1 x 105 células T CD8 + (ou quantidade desejada) em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 1-5 g / L de glicose em uma câmara a 37 ° C.
    NOTA: O meio L-15 é formulado para uso sem um sistema de bicarbonato de sódio CO2. É tamponado usando aminoácidos básicos livres, tampões de fosfato e galactose para manter os níveis de pH.
  4. Opcional: Execute o bloqueio de integração.
    1. Pré-incube as células T com um anticorpo bloqueador para uma integrina (1-10 μg / mL, anti-camundongo CD11a (M17 / 4), anti-camundongo CD18 (M18 / 2), anti-camundongo VLA-4 (9C10) por 10 min e deixe rastejar na presença do mesmo anticorpo.

5. Microscopia de lapso de tempo

  1. Realize microscopia de vídeo.
  2. Para células T, adquira imagens de campo claro e fluorescentes a cada 10-60 s por 10-60 min ou configurações de aquisição desejadas.
    NOTA: A migração de células T é sensível à temperatura e a temperatura ideal para a migração de células T de camundongos é de 37 °C. O sistema de controle de temperatura que este protocolo usa consiste em um deck de microscópio fechado e isolado com um sistema de aquecimento acoplado. A câmara de imagem fica no deck de imagem. O perímetro desta câmara possui um poço preenchido com água destilada que permite calor e umidade consistentes durante a geração de imagens. O micropoço está posicionado no centro da câmara de imagem.

6. Análise assistida por software da migração de células T

  1. Use o software Volocity para avaliar a migração de células T.
    1. Abra Volocity e crie uma nova sequência de imagens.
    2. Selecione e mova todos os filmes de microscopia de vídeo com lapso de tempo para a área azul em Volocity.
    3. Ajuste o brilho e o contraste usando a ferramenta de aprimoramento de contraste para as configurações desejadas pelo pesquisador.
    4. Verifique os tamanhos das imagens: 0,325 μm para 20x, 0,65 μm para 10x.
    5. Sequência: defina pontos de tempo (ex: 81 imagens se tirar uma imagem a cada 15 s por 20 min, 4 por min).
    6. Desmarque todos os pontos de tempo na guia de medição.
    7. Encontre objetos usando intensidade - deslize a barra para que fique à direita do pico.
    8. Excluir objetos por tamanho: todas as células com diâmetro menor que 10 μm e maior que 100 μm para excluir detritos celulares ou partículas não celulares. Exclua as células T que estão migrando por menos de 20% do tempo de gravação (que pode variar dependendo da definição de cada investigador).
    9. Ignorar objetos estáticos (caixa de seleção).
    10. Unir automaticamente trechos quebrados (caixa de seleção).
    11. Defina o caminho mais curto para não mais que 20 μm.
    12. A trilha de uma migração celular é a linha que conecta a localização da mesma célula ao longo do tempo. Certifique-se de que o algoritmo de rastreamento esteja rastreando detectando onde objetos individuais são detectados por segmentação em cada quadro e os objetos são correspondidos entre quadros.
    13. Salve um novo protocolo escolhendo Medidas > Salvar protocolo > Nomear novo protocolo.
    14. Clique em medir todos os pontos de tempo na guia de medição.
    15. Classifique as faixas por período de tempo, de alto a baixo.
    16. Registre os números de identificação da trilha para todas as células com boas trilhas, conforme definido pelo investigador. Após o rastreamento automático de células, a avaliação manual de cada trilha de célula é necessária para excluir trilhas falsamente identificadas ou quebradas. Exclua células com faixas ruins.
    17. Exporte o arquivo como texto separado por vírgulas e transfira os dados para o software de análise desejado.
      NOTA: Parâmetros básicos: Velocidade (μm/min), deslocamento (movimento líquido, μm), comprimento da trilha (comprimento total do caminho, μm) e índice sinuoso (MI; deslocamento líquido/comprimento da trilha. MI = 1 indica uma pista linear completamente reta).
  2. Execute o rastreamento manual usando a imagem J.
    1. Abra os plug-ins e selecione rastreamento e rastreamento manual. Defina os parâmetros - intervalos de tempo, calibração x/y (tamanho do pixel) e calibração z (no modo de rastreamento manual). Inicie o rastreamento de células individuais clicando em adicionar faixa, selecionando uma célula no primeiro ponto de tempo e continuando-o em todos os pontos de tempo. Em seguida, clique em Finalizar faixa. Repita para todas as células de interesse.
      NOTA: Trackmate, outra ferramenta para rastreamento de células, é um software de rastreamento automático disponível através do plug-in ImageJ.

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Resultados

A confirmação da ativação das células T pode ser obtida por citometria de fluxo, buscando aumento da expressão de CD69 e CD44, que são marcadores canônicos de ativação em células T murinas6. Além disso, a pureza da população de células T pode ser determinada por citometria de fluxo para células T CD3+ CD8+ . Este método produz >90% de população de células T CD8+ .

A migração de células T pode ser avaliada com programas de rastreamento...

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Discussão

Compreender o impacto biológico dos sinais convergentes in vivo é desafiador e não é fácil de interpretar. Os protocolos aqui apresentados fornecem um método razoável para entender a migração de células T em condições altamente definidas e biologicamente relevantes. Essas condições podem ser especificadas com base no critério do investigador, e os protocolos podem ser modificados para atender às necessidades de várias populações de células T, status de ativação e fenótipo celular. Além disso, muitos ligantes e r...

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Divulgações

Os autores declaram que toda a pesquisa e preparação do manuscrito foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros anteriores e atuais do Kim Lab que contribuíram para o desenvolvimento desses protocolos ao longo do tempo. Dados representativos foram possibilitados por P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Estados Unidos e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicação foi possível em parte pelo número de concessão T32 GM135134 do Prêmio Institucional Ruth L. Kirschstein National Research Service.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Prato de 10 cmCorning353003ou equivalente
15 mL tubo cônicoThermoFisher339650ou equivalente
1x DPBSGibco14190144sem cálcio e sem magnésio
placa de 6 poços não tratada com TCCorning3736ou equivalente
70 µ filtro de células mFisherScientific352350ou
tampão de lise ACKThermoFisherA1049201ou
equivalente Centrífuga Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R com rotor tx400 3655 e caçambaou equivalente
Beta mercaptoetanolSigmaM3148ou equivalente
CellTrace VioletThermoFisherC34571Ou
equivalente CentrífugaThermoScientificSorvall ST 16Rou equivalente
Colágeno (IV)Corning354233ou
equivalente DeltaT placa de cultura .17 mm de espessura vidro transparenteBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rato IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dou equivalente
Kit de isolamento de células T de camundongo Easy sepStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLou equivalente
FibronectinaSigmaAldrich10838039001ou equivalente
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Cubos de filtroNikon ou Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080ou equivalente
HQ CCD câmeraCoolSNAPou equivalente
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ rastreamento automático plug inhttp://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ rastreamento manual plug-inhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VáriosVer MateriaisMédio Receita: Leibovitz' s Meio L-15 sem vermelho de fenol (Gibco) suplementado com 1-5 g/L de glicose
Meio L-15 de Liebovitz, sem vermelho de fenolSeringa descartável ThermoFisher21083027
Luer LokFisher Scientific14-955-459ou
equivalente Meio de separação de linfócitosCorning25-072-CIou equivalente
M5/114ATCCTIB-120
Aminoácidos não essenciais MEMThermoFisher11140050ou
equivalente Sistema de aquecimento de microscópioOkolabokolab.comDesigns personalizados disponíveis
Millicell EZ slideMilliporeC86024
Mojosort mouse CD8+ Naï kit de isolamento de células T Biolegend480043
Mouse E-caderinaR& D systems8875-EC-050ou equivalente
Kit de dissecção cirúrgica do mouseFisher Scientific13-820-096ou
equivalente Elementos NISNikonSoftware
não-TC 24wpCorning353047ou equivalente
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher15140122ou equivalente
Proteína AThermoFisher Scientificou equivalente
R9Vários VerMateriaisMeio Receita: RPMI 1640x suplementado com 10 % FBS, 1 % antibiótico-antimicótico (Gibco), 20 mM tampão HEPES (Gibco), 1 % MEM Aminoácidos Não Essenciais (Gibco), 50 μ M β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Quimera ICAM-1 Fc de camundongo recombinanteR& D systems796-IC-050ou equivalente
Recombinant Mouse IL2Biolegend575410ou equivalente
RPMI 1640xThermoFisher11875093ou equivalente
T pinosFisherScientific S99385ou equivalente
TE2000-U microscópioNikonou equivalente
Vários mouse recombinante quimiocinaR& D ouequivalente
VCAM-1 Fc quimeraR& D sistemas643-VM-050ou equivalente
VolocityPerkinElmerSoftware
equivalente

Referências

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