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Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

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DOI:

10.3791/66580

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24 de maio de 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Resumo

A resposta imune adaptativa depende da capacidade de uma célula T de migrar através do sangue, linfa e tecido em resposta a patógenos e corpos estranhos. A migração de células T é um processo complexo que requer a coordenação de muitas entradas de sinal do ambiente e das células imunes locais, incluindo quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão. Além disso, a motilidade das células T é influenciada por pistas ambientais dinâmicas circundantes, que podem alterar o estado de ativação, a paisagem transcricional, a expressão da molécula de adesão e muito mais. In vivo, a complexidade desses fatores aparentemente entrelaçados torna difícil distinguir sinais individuais que contribuem para a migração de células T. Este protocolo fornece uma série de métodos, desde o isolamento de células T até a análise auxiliada por computador para avaliar a migração de células T em tempo real sob condições ambientais altamente específicas. Essas condições podem ajudar a elucidar os mecanismos que regulam a migração, melhorando nossa compreensão da cinética das células T e fornecendo fortes evidências mecanicistas que são difíceis de obter por meio de experimentos com animais. Uma compreensão mais profunda das interações moleculares que afetam a migração celular é importante para desenvolver uma terapêutica aprimorada.

Introdução

As células T são os principais efetores da resposta imune adaptativa e específica do antígeno. Em nível populacional, as células T são heterogêneas, compostas por subconjuntos celulares com funções especializadas distintas. É importante ressaltar que as células T CD8+ são os principais efetores citolíticos do sistema imunológico, que eliminam diretamente as células infectadas ou disfuncionais1.

As células T CD8+ maduras residem no tecido e circulam pelo sangue e linfáticos em busca de antígenos. Durante a infecção, as células T são apresentadas a antígenos no sangue ou tecido e drenam rapidamente para o baço ou linfonodo de drenagem mais próximo para iniciar uma resposta imune produtiva. Em ambos os casos, as células T são ativadas, sofrem expansão clonal e deixam o sistema linfático para entrar no sangue, se ainda não estiverem lá. Durante esse processo, a sinalização intracelular confere a regulação negativa dos receptores linfáticos e a regulação positiva de vários receptores de integrina e quimiocina essenciais para a migração específica do tecido2. Em última análise, a migração direcionada de células T para locais de infecção é impulsionada por sinais ambientais convergentes que incluem sinalização de integrina e quimiocina.

As quimiocinas podem ser amplamente categorizadas em duas classes principais: (1) sinais homeostáticos, que são essenciais para diferenciação, sobrevivência e função basal, e (2) sinais inflamatórios, como CXCL9, CXCL10 e CCL3, que são necessários para a quimiotaxia. Geralmente, as quimiocinas criam um gradiente de sinal que impulsiona a migração direcional, conhecida como quimiotaxia, além de ativar a expressão da integrina1. A quimiotaxia é finamente regulada e altamente sensível, com células T capazes de responder a pequenas mudanças no gradiente que podem levá-las a uma direção ou local específico.

Além desses fatores relacionados às células T, a migração também é afetada pela composição e densidade da matriz extracelular (MEC). A ECM é composta por uma densa rede de proteínas, incluindo colágeno e proteoglicanos, que fornecem a estrutura para receptores de integrina adesiva nas células T. As integrinas são uma família diversificada de proteínas transmembranares, cada uma com domínios de ligação altamente especializados e efeitos de sinalização a jusante. A expressão dinâmica dos receptores de integrina na superfície de uma célula T permite uma rápida adaptação aos seus ambientes em mudança3. É importante ressaltar que as integrinas conectam as redes de ACTINA do citoesqueleto intracelular e do citoesqueleto intracelular que trabalham juntas para gerar a força propulsora necessária para o movimento das células T.

Em resumo, os padrões de migração variam de acordo com o fenótipo da célula imune ou sinais ambientais. Esses processos biológicos complexos são rigidamente regulados pela expressão de citocinas, quimiocinas e integrinas na superfície da célula T, nas células circundantes e no tecido infectado local. In vivo, esses mecanismos migratórios podem ser complexos e podem resultar de vários sinais aditivos4. Devido a essa complexidade, pode ser impossível estabelecer uma relação causal entre variáveis aparentemente interligadas. Para superar isso, existem várias abordagens in vitro para estudar aspectos específicos da migração de células T, como resposta a sinais específicos de quimiocinas e a interação entre integrinas de células T e proteínas de ligação à MEC. Este protocolo aborda métodos para isolar e ativar células T CD8+ murinas, com ensaios de migração in vitro no espaço bidimensional e ferramentas de análise computacional para análise da migração de células T especificadas. Esses métodos são vantajosos para o usuário porque não requerem materiais ou dispositivos sofisticados, como acontece com alguns outros ensaios de migração celular descritos na literatura. Os dados de migração celular gerados com esses métodos podem fornecer evidências de respostas imunes de maneira simplista que permite uma investigação mais aprofundada e informada in vivo.

Protocolo

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Universitário de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos neste estudo foram mantidos no espaço livre de patógenos do biotério da Universidade de Rochester. Camundongos C57BL/6 machos/fêmeas, com idade entre 6 e 12 semanas (15-30 g), foram usados para o presente estudo. O isolamento do tecido do camundongo pode ser realizado em uma bancada com luvas para cobrir as mãos e uma máscara facial para cobrir o nariz e a boca, ou dentro de um gabinete de biossegurança. Toda a cultura celular e preparação da placa devem ser realizadas em uma cabine de biossegurança. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação e ativação de células T CD8 +

  1. Preparação de materiais
    1. Para a seleção negativa de células T CD8+ : Preparar um meio de seleção negativa a partir do sobrenadante dos anticorpos GK1.5 e M5/114 das linhas celulares de hibridoma, que produzem anticorpos anti-CD4 e anti-MHCII, respectivamente. Misturar o sobrenadante na proporção de 1:1, filtrá-lo e armazená-lo a 4 °C para utilização futura (>0,5 μg de cada anticorpo/milhão de células totais). Como alternativa, kits comerciais de isolamento de células T CD8+ estão disponíveis.
    2. Para ativação de células T: Adicione 500 μL de anticorpos CD3 (10 μg/mL) e CD28 (16 μg/mL) em 1x DPBS (sem cálcio e magnésio) a uma placa de 24 poços tratada sem cultura de tecidos (TC) e armazene durante a noite a 4 °C para garantir a ligação da placa.
      NOTA: Anticorpos e proteínas revestem placas/placas de cultura não tratadas com TC melhor do que as normais tratadas com TC, portanto, placas de cultura não tratadas com TC são usadas para geração de células T.
  2. Prepare uma placa de cultura de 10 cm (ou equivalente) colocando um filtro de células de 70 μm na placa e dispense 2 mL de meio R9 no filtro (meio R9: RPMI 1640x suplementado com 10% de FBS, 1% de antibiótico-antimicótico, 20 mM de tampão HEPES, 1% de aminoácidos não essenciais MEM, 50 μM de β-mercaptoetanol).
  3. Obtenha um camundongo com histórico genético, sexo, idade e peso apropriados, conforme determinado pelo projeto experimental.
  4. Eutanásia do camundongo usando CO2 seguido de luxação cervical, ou estratégias apropriadas de eutanásia, conforme definido pelos protocolos locais de cuidados e uso de animais e aprovados pela instituição.
  5. Coloque o mouse em decúbito dorsal, estique todos os quatro membros perpendicularmente ao corpo e prenda as almofadas dos pés em uma placa de dissecação usando pinos T de dissecação do mouse ou equivalente. Faça uma incisão superficial e central através da camada cutânea no abdômen inferior ventral com uma tesoura de dissecção cirúrgica de camundongo e corte até o queixo (~ 8 cm). Separe a pele do revestimento peritoneal para expor os gânglios linfáticos. Estique a pele perpendicularmente para longe do tronco e prenda-a5.
    1. Extirpe suavemente os linfonodos cervicais, axiais, braquiais e inguinais bilateralmente usando uma pinça romba (ou o tipo preferido de um kit de dissecção cirúrgica de camundongo padrão). Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.
    2. Abra o peritônio e remova o baço. Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.
    3. Descarte a carcaça do camundongo no recipiente de risco biológico apropriado.
  6. Preparar uma suspensão unicelular dos tecidos linfóides secundários por ruptura mecânica sobre o filtro de células de 70 μm com 2 ml de meio R9 do passo 1.2, rodando repetidamente a ferramenta de ruptura tecidual meia volta no sentido dos ponteiros do relógio e no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio.
    NOTA: A extremidade do êmbolo de uma seringa luer-lock, 3 mL ou 10 mL, funciona bem para esmagar e homogeneizar o tecido. Materiais alternativos podem ser usados a critério do usuário.
  7. Lave as células, a extremidade da seringa, o filtro e a placa de cultura com 7 mL de meio, garantindo que o filtro permaneça na posição vertical para evitar a transferência de pedaços maiores de tecido ou agregados celulares que possam estar presentes na suspensão de célula única.
  8. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
  9. Pulverizar as células a 270 x g à temperatura ambiente (20 °C) durante 5 min e decantar o sobrenadante.
  10. Adicione 500 μL de tampão de lise por 1 min para remover os glóbulos vermelhos. Diluir com 9,5 ml de meio R9 e centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Decantar o sobrenadante.
  11. Ressuspenda o pellet em 10 ml do meio de seleção negativa previamente preparado contendo anti-MHCII e anti-CD4 (passo 1.1.1). Agite em temperatura ambiente (20 °C) por 30 min.
  12. Pulverizar as células a 270 x g durante 5 min e decantar o sobrenadante. Lave 3x com 10 mL de meio R9.
  13. Simultaneamente, em um tubo cônico de 15 mL, lave 200 μL de grânulos de IgG anti-rato de ovelha em 7 mL de meio. Coloque o tubo em um ímã, remova o meio e repita a etapa de lavagem duas vezes. Ressuspenda os grânulos em 7 ml de meio R9.
  14. Pulverizar as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min, transvasar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o sedimento em 7 ml de suspensão de esferas a partir do passo 1.13. Balance em temperatura ambiente (20 °C) por 45 min.
  15. Enriqueça as células T CD8+ por depleção de esferas magnéticas. Coloque o tubo cônico diretamente no ímã sem tampa por 3 min para remover as células ligadas a anticorpos/esferas. As células CD8+ devem ser retidas. Com o tubo ainda no íman, recolher a suspensão celular utilizando uma pipeta serológica ou equivalente e transferi-la para um novo tubo de 15 ml. Centrifugue a 270 x g (20 °C) por 5 min e lave 3x em médio.
  16. Lave a placa de ativação pré-revestida (etapa 1.1.2) com 1x DPBS duas vezes sem pipetar diretamente na superfície inferior da placa.
  17. Opcional: Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas.
    1. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione suavemente 2 mL de meio de separação de linfócitos no fundo da suspensão celular. Centrifugue a 900 x g por 10 min (à temperatura ambiente) em baixa aceleração e desaceleração.
      NOTA: As células vivas se separarão na interface do meio e do meio de separação (camada branca média). As células mortas serão pellets no fundo do tubo e podem ser descartadas no final.
    2. Transfira a camada intermediária contendo linfócitos vivos para um novo tubo e centrifugue a 270 x g por 5 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante.
  18. Ressuspenda o pellet em 12 mL de meio com 10 U/mL de IL-2 de camundongo recombinante. Colocar 1 mL por alvéolo em uma placa de 24 poços não tratada com TC e transferir para 37 °C durante a noite.

2. Levantamento das células T CD8+ ativadas

  1. Visualize células usando um microscópio óptico de bancada padrão, usando a objetiva 4x ou 10x.
    NOTA: As células T ativadas parecerão maiores e redondas ou alongadas em comparação com as células T inativadas e devem ter aglomerados densos de células em todo o poço.
  2. Para levantar as células ativadas, interrompa as células com uma pipeta de 1 mL, certificando-se de misturar bem nas bordas da placa. Transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: As células ativadas são mais pegajosas e requerem pipetagem mais vigorosa.
  3. Lave os poços com 1 mL de meio R9 para remover quaisquer células restantes. Repita mais uma vez, se necessário. Centrifugue as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
  4. Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas como nas etapas 1.17-1.18.
  5. Mantenha as células T por remoção de células vivas/mortas a cada 3-4 dias em meio R9 com IL-2 em uma placa de 6 poços não TC.
    NOTA: As células T proliferam melhor em poços de pequena dimensão durante a ativação inicial, possivelmente devido ao contato entre células T e células T ou fatores solúveis derivados de células T que ajudam na ativação. A rápida proliferação de células T faz com que o meio de cultura fique amarelo dentro de 24-48 h após a cultura. Neste ponto, levante as células e transfira-as para um poço maior (placa de 6 poços não revestida e não TC) com meio de cultura fresco suficiente para alimentar as células (normalmente 5 mL por poço). Substitua o meio empobrecido por fresco sempre que indicado pela mudança de cor do meio amarelo ou a cada 3-4 dias.

3. Preparação do prato de vidro

  1. Prepare as câmaras ou placas de migração de células de vidro revestindo com 300 μL / cm2 Proteína A (0,1 mg / mL) durante a noite a 4 ° C, lave duas vezes com 1x DPBS dispensando no prato e decantando antes de passar para a próxima etapa.
  2. Cubra a câmara ou placa de migração com 300 μL / cm2 quimera ICAM-1 ou VCAM-1 Fc de camundongo recombinante (0,1-2,75 mg / mL) junto com uma quimiocina de camundongo recombinante (0,1-10 μg / mL) por 2-3 h à temperatura ambiente. Outros ligantes de integrina, como fibronectina, colágeno IV de camundongo e E-caderina de camundongo, são revestidos diretamente da câmara a 2,5-10 μg / mL durante a noite a 4 ° C.
    1. Lave as câmaras duas vezes com 1x DPBS, dispensando no prato e decantando imediatamente depois antes de adicionar as células.
      NOTA: As células T podem migrar de forma diferente em diferentes concentrações de ligantes de integrina e quimiocinas, dependendo do status de ativação, diferenciação, sensibilização e priming. O ensaio da migração celular em várias concentrações diferentes é fortemente sugerido.
  3. Coloque as células aderentes em placas revestidas de vidro 24 horas antes do início da imagem se co-cultivar células T com outras células, como células cancerígenas, para medir a morte de células T de células cancerígenas em tempo real.

4. Preparação de células

  1. Opcional: Corar células T e células aderentes com corante rastreador celular de escolha a 1 μg/mL por 1 x 107 células em 1x DPBS por 15 min a 37 °C, ou de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Conte as células usando um hemocitômetro ou equivalente.
  3. Placa 1 x 105 células T CD8 + (ou quantidade desejada) em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 1-5 g / L de glicose em uma câmara a 37 ° C.
    NOTA: O meio L-15 é formulado para uso sem um sistema de bicarbonato de sódio CO2. É tamponado usando aminoácidos básicos livres, tampões de fosfato e galactose para manter os níveis de pH.
  4. Opcional: Execute o bloqueio de integração.
    1. Pré-incube as células T com um anticorpo bloqueador para uma integrina (1-10 μg / mL, anti-camundongo CD11a (M17 / 4), anti-camundongo CD18 (M18 / 2), anti-camundongo VLA-4 (9C10) por 10 min e deixe rastejar na presença do mesmo anticorpo.

5. Microscopia de lapso de tempo

  1. Realize microscopia de vídeo.
  2. Para células T, adquira imagens de campo claro e fluorescentes a cada 10-60 s por 10-60 min ou configurações de aquisição desejadas.
    NOTA: A migração de células T é sensível à temperatura e a temperatura ideal para a migração de células T de camundongos é de 37 °C. O sistema de controle de temperatura que este protocolo usa consiste em um deck de microscópio fechado e isolado com um sistema de aquecimento acoplado. A câmara de imagem fica no deck de imagem. O perímetro desta câmara possui um poço preenchido com água destilada que permite calor e umidade consistentes durante a geração de imagens. O micropoço está posicionado no centro da câmara de imagem.

6. Análise assistida por software da migração de células T

  1. Use o software Volocity para avaliar a migração de células T.
    1. Abra Volocity e crie uma nova sequência de imagens.
    2. Selecione e mova todos os filmes de microscopia de vídeo com lapso de tempo para a área azul em Volocity.
    3. Ajuste o brilho e o contraste usando a ferramenta de aprimoramento de contraste para as configurações desejadas pelo pesquisador.
    4. Verifique os tamanhos das imagens: 0,325 μm para 20x, 0,65 μm para 10x.
    5. Sequência: defina pontos de tempo (ex: 81 imagens se tirar uma imagem a cada 15 s por 20 min, 4 por min).
    6. Desmarque todos os pontos de tempo na guia de medição.
    7. Encontre objetos usando intensidade - deslize a barra para que fique à direita do pico.
    8. Excluir objetos por tamanho: todas as células com diâmetro menor que 10 μm e maior que 100 μm para excluir detritos celulares ou partículas não celulares. Exclua as células T que estão migrando por menos de 20% do tempo de gravação (que pode variar dependendo da definição de cada investigador).
    9. Ignorar objetos estáticos (caixa de seleção).
    10. Unir automaticamente trechos quebrados (caixa de seleção).
    11. Defina o caminho mais curto para não mais que 20 μm.
    12. A trilha de uma migração celular é a linha que conecta a localização da mesma célula ao longo do tempo. Certifique-se de que o algoritmo de rastreamento esteja rastreando detectando onde objetos individuais são detectados por segmentação em cada quadro e os objetos são correspondidos entre quadros.
    13. Salve um novo protocolo escolhendo Medidas > Salvar protocolo > Nomear novo protocolo.
    14. Clique em medir todos os pontos de tempo na guia de medição.
    15. Classifique as faixas por período de tempo, de alto a baixo.
    16. Registre os números de identificação da trilha para todas as células com boas trilhas, conforme definido pelo investigador. Após o rastreamento automático de células, a avaliação manual de cada trilha de célula é necessária para excluir trilhas falsamente identificadas ou quebradas. Exclua células com faixas ruins.
    17. Exporte o arquivo como texto separado por vírgulas e transfira os dados para o software de análise desejado.
      NOTA: Parâmetros básicos: Velocidade (μm/min), deslocamento (movimento líquido, μm), comprimento da trilha (comprimento total do caminho, μm) e índice sinuoso (MI; deslocamento líquido/comprimento da trilha. MI = 1 indica uma pista linear completamente reta).
  2. Execute o rastreamento manual usando a imagem J.
    1. Abra os plug-ins e selecione rastreamento e rastreamento manual. Defina os parâmetros - intervalos de tempo, calibração x/y (tamanho do pixel) e calibração z (no modo de rastreamento manual). Inicie o rastreamento de células individuais clicando em adicionar faixa, selecionando uma célula no primeiro ponto de tempo e continuando-o em todos os pontos de tempo. Em seguida, clique em Finalizar faixa. Repita para todas as células de interesse.
      NOTA: Trackmate, outra ferramenta para rastreamento de células, é um software de rastreamento automático disponível através do plug-in ImageJ.

Resultados

A confirmação da ativação das células T pode ser obtida por citometria de fluxo, buscando aumento da expressão de CD69 e CD44, que são marcadores canônicos de ativação em células T murinas6. Além disso, a pureza da população de células T pode ser determinada por citometria de fluxo para células T CD3+ CD8+ . Este método produz >90% de população de células T CD8+ .

A migração de células T pode ser avaliada com programas de rastreamento de células assistidos por software que são reproduzíveis e ajustáveis para atender às necessidades do investigador. Alguns parâmetros básicos usados para determinar os efeitos experimentais incluem velocidade celular (comprimento de migração por um determinado tempo para determinar a rapidez com que uma célula se move), deslocamento (distância de migração, uma linha reta do ponto inicial ao ponto final, para determinar a distância que uma célula migra), comprimento da trilha (distância de migração, o comprimento total do caminho de migração, para determinar a distância que uma célula migra), e índice sinuoso (MI está entre 0 e 1 para determinar a retidão da migração, 1 = reto). Esses parâmetros são empregados para avaliar as diferenças migratórias em células T CD8+ virgens e ativadas rastejando ao longo do vidro revestido com ICAM-1 com CXCL12 (Figura 1). Aumento da velocidade média, deslocamento e índice de meandros foram observados em células T CD8+ ativadas em comparação com virgens, indicando que as células T ativadas aumentaram a capacidade de migração. Da mesma forma, o impacto de diferentes quimiocinas nos padrões de migração celular pode ser elucidado com esses métodos. Por exemplo, as células T CD8+ ativadas exibem aumento da migração na presença de CXCL12, mas não CCL2 ou CCL22, e a migração aumenta de maneira dose-dependente para uma concentração saturada (Figura 2). Além disso, o rastreamento celular assistido por software permite a caracterização da migração celular individual, o que permite uma compreensão dos efeitos de ligantes individuais no comportamento das células T. Rastros celulares representativos podem ser vistos na Figura 3.

Tomados em conjunto, esses dados apóiam a eficácia dos métodos atuais, confirmando que podemos (1) rastrear a migração celular em uma base celular individual e (2) distinguir diferenças na migração de células T CD8 + com base no status de ativação e na presença de diferentes quimiocinas e moléculas de adesão. Este ensaio é uma etapa crítica na dissecação de mecanismos de sinalização complexos e na informação de experimentos in vivo focados que podem abordar ainda mais as contribuições biológicas de sinais específicos de uma maneira específica do tipo de célula.

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Figura 1: Ensaios in vitro para migração de células T CD8+ virgens e ativadas. Células T CD8 + de camundongo virgens ou ativadas por CD3 / CD28 foram autorizadas a migrar em ICAM-1 mais CXCL12 por 10 min. A velocidade, o deslocamento e o índice sinuoso da migração celular foram analisados por meio de microscopia de lapso de tempo e volocidade. Cada grupo tem 36 células T individuais (média ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Ensaios in vitro para migração dependente de quimiocina de células T CD8 + ativadas. As células T CD8 + de camundongo ativadas por CD3 / CD28 foram autorizadas a migrar em ICAM-1 mais uma quimiocina indicada. As proporções do número de células rastejando mais de 50 μm por 20 min (porcentagem do total) foram determinadas em um campo de visão. Um único ensaio analisou >10 células (n = 3 ensaios por grupo em média ± MEV). Teste t não pareado, *p< 0,05 em comparação com o controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Trilhas migratórias de células T CD8 + ativadas em ICAM-1 mais CXCL12 por 20 min. Cada linha colorida indica a trilha migratória de cada célula T em uma direção do ponto da célula para o oposto. Neste ensaio em particular, 24 das 38 células migraram em um comprimento significativo (pelo menos a distância da largura de suas células por nossa definição). As células T migraram em diferentes comprimentos de distâncias, indicando que cada célula estava em um status diferente de ativação ou priming. Todas as células migratórias se moveram em direções diferentes sob a condição de que a superfície fosse uniformemente revestida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Compreender o impacto biológico dos sinais convergentes in vivo é desafiador e não é fácil de interpretar. Os protocolos aqui apresentados fornecem um método razoável para entender a migração de células T em condições altamente definidas e biologicamente relevantes. Essas condições podem ser especificadas com base no critério do investigador, e os protocolos podem ser modificados para atender às necessidades de várias populações de células T, status de ativação e fenótipo celular. Além disso, muitos ligantes e receptores podem ser interrogados por meio desses procedimentos definidos de bloqueio de anticorpos 7,8 e vidro revestido com ligante 8,9,10. Essa técnica também tem sido uma plataforma crítica para o desenvolvimento de células imunes modificadas11,12.

Etapas importantes no protocolo incluem o isolamento do tecido linfóide secundário, ativação das células T, revestimento das placas de imagem de vidro e análise de dados. Para o olho inexperiente, os gânglios linfáticos embutidos no tecido podem ser difíceis de identificar e extrair. Isso pode ser superado com a prática. Uma vez que as células T tenham sido isoladas e purificadas, a etapa de ativação resulta em células pegajosas que, se não forem levantadas adequadamente, podem resultar em baixo rendimento. Isso pode ser evitado com uma lavagem generosa e cuidadosa dos poços. Os pratos de vidro devem ser devidamente revestidos com o ligante de interesse e lavados antes da adição das células. Isso garantirá que uma camada robusta de proteína esteja disponível para as células aderirem, ao mesmo tempo em que garante que o excesso de reagente não interrompa a biologia. A ligação da superfície do vidro da proteína A e a ligação da proteína A Fc no pH fisiológico e na concentração de sal são fortes o suficiente para resistir a serem lavadas ao despejar e decantar suavemente o tampão. As proteínas residuais, se houver, no meio não causam toxicidade, embora possam perturbar a interação celular com ligantes ligados se os não ligados estiverem em altas concentrações. Descartamos essa possibilidade enxaguando o vidro revestido algumas vezes. Finalmente, existem muitos softwares comerciais e não comerciais fáceis de usar que permitem aos pesquisadores detectar até mesmo diferenças sutis nos comportamentos e morfologias celulares. A importância de tranquilizar os resultados analisados manualmente para excluir erros que o software poderia cometer não pode ser exagerada.

Os métodos de purificação e ativação de células T podem ser modificados para atender às necessidades do pesquisador de obter o estado celular e o fenótipo adequados para recapitular observações in vivo. Vários tipos e estados de células podem ser usados para abordar diferentes mecanismos de infecção e resposta imune 7,8,9,10,11,13, incluindo o comportamento ingênuo e de células T de memória e vários aspectos da resposta de memória, como priming e recrutamento, em condições específicas de tecido14. Este método pode ser usado para co-cultura com diferentes tipos de células para entender melhor as interações celulares, incluindo tempos de contato célula-célulae duração 7,9, apresentação de antígeno 9,13 e morte de células-alvo6. Repórteres e rótulos adicionais podem ser usados para avaliar estruturas subcelulares7, grânulos15, apoptose6 e muito mais.

O protocolo é uma excelente ferramenta para orientar experimentos in vivo adicionais com base em observações em condições simplificadas e altamente definidas. Embora a avaliação in vitro da motilidade celular possa ser altamente redutora, é um passo importante na quebra de atividades biológicas complexas. Com os resultados desses experimentos, os investigadores podem abordar o trabalho in vivo de uma maneira fisiologicamente mais relevante e direcionada.

A simplicidade desse método também representa sua principal limitação; Embora representativos de atividades in vivo, todos os resultados podem ser confirmados usando microscopia multifotônica intravital, por exemplo. O método aqui descrito é um dos mais simples que está totalmente disponível para laboratórios de pesquisa com um microscópio de campo claro e/ou microscópio de epifluorescência com uma câmera digital integrada ao sistema de microscópio ou colocada separadamente na objetiva do osciloscópio. Por outro lado, existem mais opções para análise avançada da migração de células imunes in vitro. Primeiro, as células imunes são frequentemente impulsionadas por gradientes de quimiocinas no sistema biológico. A análise do comportamento das células imunes sob gradientes de quimiocinas pode ser obtida de várias maneiras. Um método simples é usar um slide especialmente projetado (consulte a Tabela de Materiais). Este sistema de poço canalizado, quando seu fundo revestido com ligantes de integrina, permite a análise da migração de células imunes sob gradiente estático de quimiocinas. Outros ensaios simples para quimiotaxia de células imunes incluem microscopia de lapso de tempo da migração celular para uma ponta de micropipeta que libera quimiocinas16, sob ensaio de agarose17 e câmara de Zigmond18. Para um ensaio de migração mais sofisticado sob gradientes de quimiocinas controlados, são necessárias lâminas personalizadas com geradores de gradiente microfluídico19,20. Em segundo lugar, as células imunes podem migrar em condições físicas únicas usando diferentes mecanismos, às vezes sem usar adesão dependente de integrina a ligantes. O ensaio de migração in vitro em unidimensional pode ser feito com ou sem revestimento de ligante integrina e reproduz a motilidade das células imunes nos vasos capilares21,22. Outra opção é o ensaio de migração celular no espaço tridimensional 23,24 para investigar os mecanismos subjacentes à migração intersticial das células25,26. No geral, descrevemos métodos simples, reprodutíveis e confiáveis para estudar eventos dinâmicos de migração celular.

Divulgações

Os autores declaram que toda a pesquisa e preparação do manuscrito foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros anteriores e atuais do Kim Lab que contribuíram para o desenvolvimento desses protocolos ao longo do tempo. Dados representativos foram possibilitados por P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Estados Unidos e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicação foi possível em parte pelo número de concessão T32 GM135134 do Prêmio Institucional Ruth L. Kirschstein National Research Service.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Prato de 10 cmCorning353003ou equivalente
15 mL tubo cônicoThermoFisher339650ou equivalente
1x DPBSGibco14190144sem cálcio e sem magnésio
placa de 6 poços não tratada com TCCorning3736ou equivalente
70 µ filtro de células mFisherScientific352350ou
tampão de lise ACKThermoFisherA1049201ou
equivalente Centrífuga Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R com rotor tx400 3655 e caçambaou equivalente
Beta mercaptoetanolSigmaM3148ou equivalente
CellTrace VioletThermoFisherC34571Ou
equivalente CentrífugaThermoScientificSorvall ST 16Rou equivalente
Colágeno (IV)Corning354233ou
equivalente DeltaT placa de cultura .17 mm de espessura vidro transparenteBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rato IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dou equivalente
Kit de isolamento de células T de camundongo Easy sepStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLou equivalente
FibronectinaSigmaAldrich10838039001ou equivalente
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Cubos de filtroNikon ou Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080ou equivalente
HQ CCD câmeraCoolSNAPou equivalente
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ rastreamento automático plug inhttp://imagej.net/TrackMateweblink
ImageJ rastreamento manual plug-inhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VáriosVer MateriaisMédio Receita: Leibovitz' s Meio L-15 sem vermelho de fenol (Gibco) suplementado com 1-5 g/L de glicose
Meio L-15 de Liebovitz, sem vermelho de fenolSeringa descartável ThermoFisher21083027
Luer LokFisher Scientific14-955-459ou
equivalente Meio de separação de linfócitosCorning25-072-CIou equivalente
M5/114ATCCTIB-120
Aminoácidos não essenciais MEMThermoFisher11140050ou
equivalente Sistema de aquecimento de microscópioOkolabokolab.comDesigns personalizados disponíveis
Millicell EZ slideMilliporeC86024
Mojosort mouse CD8+ Naï kit de isolamento de células T Biolegend480043
Mouse E-caderinaR& D systems8875-EC-050ou equivalente
Kit de dissecção cirúrgica do mouseFisher Scientific13-820-096ou
equivalente Elementos NISNikonSoftware
não-TC 24wpCorning353047ou equivalente
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher15140122ou equivalente
Proteína AThermoFisher Scientificou equivalente
R9Vários VerMateriaisMeio Receita: RPMI 1640x suplementado com 10 % FBS, 1 % antibiótico-antimicótico (Gibco), 20 mM tampão HEPES (Gibco), 1 % MEM Aminoácidos Não Essenciais (Gibco), 50 μ M β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Quimera ICAM-1 Fc de camundongo recombinanteR& D systems796-IC-050ou equivalente
Recombinant Mouse IL2Biolegend575410ou equivalente
RPMI 1640xThermoFisher11875093ou equivalente
T pinosFisherScientific S99385ou equivalente
TE2000-U microscópioNikonou equivalente
Vários mouse recombinante quimiocinaR& D ouequivalente
VCAM-1 Fc quimeraR& D sistemas643-VM-050ou equivalente
VolocityPerkinElmerSoftware
equivalente

Referências

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

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